大鼠TIMP1真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达.pdf

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1、6 7 4 大鼠T m P - 1 真核表达载体的构建及其在C H O 细胞中的表达 朱传龙1 ，聂青和2 ，高人焘1 ，李 宜1 1 安徽医科大学附属省立医院感染病科，安徽合肥2 3 0 0 0 1 ；2 第四军医大学唐都医院传染病科全军感染病诊疗中心 【摘要】目的构建大鼠基质金属蛋白酶组织抑制物1 ( T I M P - 1 ) 的真核表达载体p T I M P 一1 ，并在中国仓鼠卵母( c H o ) 细胞中表 达。方法从大鼠肝组织提取总R N A ，R T - P C R 扩增出T I M P l 基因的c D N A 片段，将目的片断克隆至p M D l 8 一T 载体，酶切和测序

2、鉴 定，然后将目的片断酶切回收后插入p c D N A 3 1 ，构建真核表达载体p T I M P 1 ，将该载体转染到c H 0 细胞后2 4 4 8h ，收集细胞上清 同时制作细胞爬片，双抗体夹心酶联免疫吸附法( E L I s A ) 和免疫组化检测T I M P l 的表达情况。结果扩增出了长约6 5 4b p 的基 因片段，并将其克隆至p M D l 8 一T 载体，酶切和测序鉴定无误；将p M D T I M P 1 中T l M P l 基因亚克隆至p c D N A 3 1 载体，酶切鉴定无 误；p T I M P l 载体转染C H 0 细胞后，E L I S A 法可检测

3、到细胞上清中有大量T I M P 一1 的表达，同时细胞爬片免疫组织化学染色可见胞 浆中存在明显的阳性棕染。结论成功构建了大鼠T I M P 一1 基因的真核表达载体p T I M P 一1 ，为进一步探讨其功能奠定了实验基础。 【关键词】基质金属蛋白酶组织抑制物一1 ；基因表达；真核表达载体 中图分类号：R 3 6 4 3 + 2文献标识码：A文章编号：1 0 0 6 5 7 0 9 ( 2 0 0 8 ) 0 8 一0 6 7 4 一0 3收稿日期：2 0 0 7 1 2 2 7 C o n s t r u c t i o no fe u k a r y o t i cV e c t o

4、rc a r r y i n gT I M P - 1g e n ea n di t se x p r e s s i o ni nC H oc e U s Z H UC h u a n l o n 9 1 ，N I EQ i n g h e 2 ，G A 0R e n t a 0 1 ，L IY i l 1 D e p a r t m e n to fI n f e c t i o u sD i s e a s e s ， A f f m a t e dP r o v i n c i a l H o s p i t a l o fA n h u iM e d i c a lU n i v e

5、 r s i t y ，H e f e i2 3 0 0 0 1 ； 2 D e p a r t m e n to fI n f e c t i o u sD i s e a s e s ，T a n g d uH o s p i t a l ，F o u r t hM i l i t a r yM e d j c a lU n i V e r s i t y ，C h i n a 【A b s t r a c t1o b j e c t i V e T oc o n s t r u c tr a tT I M P - 1e x p r e s s i o nv e c t o r ( p T

6、 I M P 1 ) a n dd e t e c tt h ee x p r e s s i o no fT I M P 一1i n C H Oc e U s M e t h o d sT o t a lR N Aw a se x t m c t e df 而mm tl i v e r ，c D N Aw a so b t a i n e db yr e V e r s et r a n s c r i p t i o n T I M P 一1c D N Aw a sa m p l i f i e da n dc l o n e di n t op M D l 8 一Tv e c t o r

7、a n dt h es e q u e n c ew e r ee n s u r e db yr e t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e sa n ds e q u e n c i n ga s s a y T I M P 一1g e n ew a sd i s s e c t e df 南mp M D - T I M P - 1a n dr e c l o n e di n t op c D N A 3 1 p T I M P - 1w a sa n a l y z e d b y r e s t r i c t i o ne n d o n u

8、c l e a s e st oe n s u r et h eo r i e n t a t i o n T h i sp l a s m i dw a st m n s f e c t e di n t oC H Oc e U s ，a n dt h e nT I M P 一1e x p r e s s i o nw a sd e t e c t e db yE L I S Aa n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r y R e s u l t sA6 5 4b pg e n ef r 丑g m e n tw a so b t a i n e d

9、a n dc o l o n e d i n t op M D l 8 一Tv e c t o r ，a n dt h es e q u e n c ew a sc o r r e c t T I M P - lg e n ew a ss u b c l o n e di n t op c D N A 3 1V e c t o r ，a n dt h e nr e - s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e sa s s a y ss h o w e dt h ec o r r e c to r i e n t a t i o n A f t e r2

10、 4 4 8h o u r st h ep l a s m i dt r a s f e c t e di n t oC H Oc e l l s ， t h ee x p r e s s i o no fT I M P - lc o u l db ed e t e c t e db yE L I S Aa n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r y C o n c l u s i o nR a tT I M P - 1e x p r e s s i o n V e c t o r ( p T I M P - 1 ) h a sb e e ns u c

11、 c e s s f u l l yc o n s t r u c t e da n dc anb eu s e df o rf u r t h e rg e n ei n t e r v e n t i o ns t u d y 【K e yw o r d s 】T I M P - 1 ；G e n ee x p r e s s i o n ；E u k a I y o t i cv e c t o r 金属蛋白酶组织抑制因子( t i s s u ei n h i b i t o r sm e t a l 1 0 p r o t e i n a s e ，T I M P s ) 是近年发现

12、的一组抑制基质金属 蛋白酶( m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s ，M M P s ) 的活性糖蛋 白。T I M P s 家族由4 个成员组成( T I M P 1 、2 、3 、4 ) ，而 肝脏中仅有T I M P - 1 和T I M P - 2 存在。研究表明， T I M P s 与M M P s 在正常状态下处于动态平衡，调节肝 内细胞外基质( E c M ) 的生成和降解，维持肝脏内E C M 质和量的稳定；而在病理状态下，各种原因和机制使肝 脏内T I M P s M M P s 的失衡引起E c M 质和量的变化，导

13、 致肝纤维化的发生和发展旧。本研究构建了大鼠 T I M P 一1 真核表达载体，并转染中国仓鼠卵巢( C h i n e s e h a m s t e ro v a r y ，C H O ) 细胞，为进一步开展针对T l M P 一1 基金项目：安徽省科技攻关项目( 0 7 0 1 0 3 0 2 1 9 5 ) 作者简介：朱传龙，主治医师，博士，主要从事肝细胞再生研究 通讯作者：聂青和。E - m a i l ：n i e q i n g l I e h o t m a i Lc o m ；高人焘，E m a i l ：m n t - 曲弘o h u c o m 基因的体内外干预的研究奠

14、定实验基础。 1 材料与方法 1 1 主要材料 p c D N A 3 1 购自i n v i t m g e n 公司， p M D l 8 T 载体购自大连宝生物公司。P C R 扩增所用引 物由i n v i t r o g e n 公司合成。中国仓鼠卵巢( c H O ) 细胞 购于A T c c 公司，由本研究室保存。w i s t a r 大鼠，1 2 0 1 5 0g ，雌性，购自第四军医大学实验动物研究中心。 T a q D N A 聚合酶购自M B IF e 瑚e n t a s 公司，D N A m a r k e r D L 2 0 0 0 购自大连宝生物公司，D N A

15、 凝胶回收试剂盒 和质粒中提取试剂盒购自O m i g a 公司，限制性内切酶 H i n d 和B a m HI 购自大连宝生物公司，T 4D N A 连接 酶购自P r o m e g a 公司，感受态J M l 0 9 大肠杆菌购自大 连宝生物公司，细胞培养液F 1 2 、胎牛血清和L i p o - f e c t a m i n e 2 0 0 0 转染试剂盒购自I n v i t r o g e n 公司，大鼠 T I M P 1M c A b 购自美国M a x i m 生物技术公司，大鼠 T I M P - lE L I s A 试剂盒购自美国A D L 公司。 万方数据 1

16、2 获取大鼠肝组织总R N A处死W i s t a u r 大鼠取肝 组织1 0 0m g ，按啊z o l 试剂说明书操作提取组织总 R N A ，以总R N A 为模板按试剂盒说明书操作进行逆转 录得到肝组织细胞的总c D N A 。 1 3 重组质粒p T I M P - 1 的构建、克隆及鉴定 以肝 组织细胞c D N A 为模板，用T I M P 一1 引物( 上游引物5 一 A T T A A G C T T A T G G C G C C C T T T G C A T C T C T G 37 弓1 人H i n d 酶切位点，下游引物5 - A T A T A G G A

17、T C C T C A G G C T T c A G c 唧G C C A G 3 引入B a m HI 酶切位点) 扩增 T I M P 1 的全长c D N A ，P C R 产物经过琼脂糖凝胶电泳 回收纯化后连接于p M D - 1 8T 载体，将重组体转化至 感受态J M l 0 9 大肠杆菌内。筛选出阳性克隆。用限 制性内切酶图谱分析和D N A 测序( i n v i t r o g e n 公司) 对 重组体进行鉴定，对重组体p M D T I M P 一1 进行双酶切 ( H i n d 和B a m HI ) ，酶切后分离并纯化小片段 T I M P 1 后，连接于同样经过

18、双酶切( H i n d 和B a m H I ) 并纯化的大片段p c D N A 3 1 ，将重组体转化至感受 态J M l 0 9 大肠杆菌内，筛选出阳性克隆。用限制性内 切酶图谱进行鉴定。 1 4 免疫组化检测T l M P - 1 的表达复苏冻存的 C H O 细胞，将培养的4 一1 0 代细胞接种于6 孔板，当6 孔板内细胞汇合率达5 0 7 0 时，将1 斗g 表达载体 p T I M P 1 通过L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 转染试剂转染至C H O 细胞，同时用一孑L 转染p c D N A 3 1 空质粒作阴性对照。 转染后8h 将细胞

19、消化接种于另一6 孔板中的无菌玻 片上制作细胞爬片，2 4h 取出爬片，固定于载玻片上， 冷丙酮固定5m i n ，p v 一6 0 0 l 法对C H O 细胞中的T I M P - l 进行免疫组化染色。 1 5 E L I S A 检测T I M P 1 的表达p T I M P l 和p c D N A 3 1 空质粒转染c H O 细胞8h 后加入完全培养基， 分别于2 4 、4 8h 收集细胞上清，按试剂盒说明书操作 步骤检测T I M P - l 在细胞上清中的含量。 1 6 统计学分析采用S P S S1 1 5 软件分析数据，结 果以i 5 表示，f 检验，p O 0 5 表

20、示有显著差异。 2结果 2 1 模板c D N A 制备结果取小鼠肝组织。应用T r i z o l 提取R N A ，稀释1 0 0 倍，分光光度计检测其A ：6 0 为 0 6 5 5 ，A 2 6 0 A ：。比值为1 8 8 4 ，R N A 浓度为2 6 2g L ， 总R N A 纯度高。取2 斗L 凝胶电泳，可见3 条清晰的 R N A 条带，总R N A 无降解，取1 斗L 为模板逆转录得 到肝组织总c D N A 。 2 2重组质粒p T I M P - 1 的构建 用经典分子克隆方 法，首先设计合成引物，以大鼠肝组织总c D N A 为模板 P c R 扩增T I M P

21、1 ，然后通过T A 连接插入T 载体中， 酶切鉴定正确，并进一步测序证实与G e n B a n k 中公布 6 7 5 的大鼠T I M P 1c D s 序列完全相符，最后亚克隆至真核 表达载体p c D N A 3 1 ，酶切鉴定正确( 见图1 ) 。 图l 重组质粒的酶切鉴定1 ：l c R 产物T I M I - l ( 6 5 4b p ) ；2 ： p M D T I M P 1 双酶切( H i n d 和B m HI ) 产物；3 ：p 1 1 M P - l 双酶 切( H i n d 和B m HI ) 产物；4 ：D N A 分子量标准 n glE n 巧m a 6

22、cm 群s t i o n 珊m I y s i so fr o m 岫啦t e dp I 蛐柚 l ：P C R 砌p l i 6 c a t i o no fr I I I M P l ；2 ：p M D - 1 r I M P l + H i n d + B 锄H I ；3 ：p n M P - l + H i n d + B 锄HI ；4 ：D N Am a r I 【盯 2 3 免疫组化检测T 珊P - l 的表达分别将重组质 粒p T I M P 1 和p c D N A 3 1 空质粒转染至C H O 细胞，转 染2 4h 后接种于无菌玻片上，4 8h 后取细胞爬片进行 免疫组化

23、染色。显微镜下观察，转染重组质粒p T I M P - 1 的C H O 的胞浆和胞膜有明显的棕染，而转染p c D N A 3 1 空质粒的c H O 细胞未见任何棕染( 见图2 ) 。 图2T I M P 1 在C H o 细胞中的表达( S P2 0 0x )A ：转染 p T I M P 1 细胞的T I M P l 蛋白免疫组化显色；B ：转染p c D N A 3 1 空质粒细胞的T I M P - 1 蛋白免疫组化显色 F i g2 I m m u n o h i s t o c h e m i c a Is t a i n i n gf o rT I M P - lp 阳t e

24、 I np i t 暑v ei nC H Oc e l l s ( S P2 0 0 )A ：t r a n 8 f e c t e dw i t hp T I M P l ； B ：t r a n 8 f b c t e dw i t hp c D N A 3 1e m p t yp l a s m i d 2 4E L I S A 检测T I M P - l 的表达转染后2 4h 和4 8 h ，分别收集细胞上清E L l s A 检测，结果显示：p T I M P - 1 载体转染C H O 细胞后，在细胞上清中可获得高表达的 T I M P 1 ，与转染p c D N A 3 1 对照

25、组相比P 0 0 l ；p T I - M P 1 载体转染c H O 细胞后，4 8h 的表达水平要显著 高于2 4h ，两者相比P 0 0 1 ( 见图3 ) 。 万方数据 6 7 6 4 3 量 2 o o l O Z 4h4 8 h 图3转染后的c H o 细胞T I M P - l 表达水平 与转染p c D - N A 3 I 组相比 P O 0 l ；与转染后2 4h 组丰廿比# P O 0 1 F i g3 M e a s u r e m e n to fT I M P - ll e v e lb yE L I S Aa f t e rt r a n s - f e c t e

26、 d木P O 0 lc o m p a r e dw i t hg m u pt r a n s f e c t e dw i t hp c D N A 3 1 ， # P O O lc o m p a r e dw i t hg r o u pt r a n 8 f e c t e dw i t hp T l M P - l2 4h p o B t t r a n e f e c t i o n 3 讨论 在我国现在和将来相当长的一个时期内，肝硬化 发生率将持续保持较高水平，其病理学基础是肝纤维 化，而肝纤维化是多种肝损因素引起的肝脏损害和炎 症，进而导致慢一陀肝病发展为肝硬化的必经病理过程

27、。 现今大量的实验及临床研究已证实肝纤维化是可以逆 转的”，足阻止向肝硬化发展的唯一时期，也是临床 上治疗的最佳时机。 肝纤维化是E C M 沉积与降解不均衡所致，在此过 程中涉及很多因素，其中在E c M 降解过程中起主导作 用的是M M P s 1 ，而T I M P s 是一组具有抑制M M P s 功 能的活性多肽，其通过与M M P s 非共价结合而抑制 M M P s 的活性，也可与酶原结合阻止其活化，从而抑制 E c M 的降解，造成E c M 的过度沉积，引起肝纤维化。 现研究已表明在肝脏组织巾可表达出T I M P l 、2 ，而尤 以T I M P 1 在肝纤维化研究中报道

28、较多，由于I L 一1 、I L 一 6 等细胞因子以及激活的肝星状细胞( H S C ) 均可使 T I M P 1 表达增强，提示T I M P 1 在肝纤维化的发病中 起着重要的作用“ o 。N i e 等利用反义寡核骨酸技 术，构建T l M P 一1 的四种反义寡核苷酸质粒，通过尾静 脉注射到人血清白蛋白诱导的肝纤维化的w i s t a r 大鼠 体内，检测模型组和治疗组的各项指标。结果硅示治 疗组的T I M P - lm R N A 含量、蛋白表达水平及I 、I I I 型 胶原含量均明显低于模型组，证明运用反义寡核苷酸 技术显著抑制T I 砌? 一l 的转录，具有良好的抗肝纤

29、维化 作用。但由于反义寡核苷酸在体内逐渐被代谢消耗， 其干预效果会随着时间的延长而降低最后完全终止。 因此建立一个有效且能长期下调T I M P l 基因表达的 载体尤为重要。M i rR N A 载体是新开发的一种能表达 m i R N A 分子的真核表达载体，体内应用安全性高，且 能包装成病毒颗粒，在肝脏获得长期高效表达川。因 此，通过m i R N A 分子下调T I M P - l 基因表达的研究可 为各种原因导致的肝纤维化为主要病理特征的疾病的 研究提供新的思路。 本研究从大鼠肝组织中提取总R N A ，正向克隆至 p c D N A 3 1 真核表达载体上。因为c H O 细胞生长

30、快 且帖壁生长，使用L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 转染外源基因效 率能达到9 0 以上，适合应用于m i R N A 基因于预载 体的筛选。本研究构建载体p T I M P 1 后，脂质体法转 染C H O 细胞2 4h 后，免疫组化染色可见9 0 以上细 胞胞浆棕染，胞核和胞膜无染色，说明p T I M P - l 载体能 在细胞胞浆高表达目的基因。同时我们在转染c H O 细胞2 4h 和4 8h 分别收集培养细胞上清，E u s A 法检 测发现有T I M P - 1 高表达，且随时问延长表达水平也在 升高，说明p T I M P 1 载体在细胞高

31、表达目的基因并能 分泌至胞外。因此本研究成功地构建了大鼠T I M P 1 的真核表达载体p T I M P 一1 ，并在细胞水平获得有效表 达，为下一步筛选T I M P 1 的m i R N A 干预载体和开展 T I M P 1 的功能学研究奠定了实验基础。 参考文献 1 一i eQ H ，x i eY M ，z h o uY x E 。p 陀s s i o n 锄ds i g n i 丘c a n c eo ft i 8 8 u ei n h i b i t o 鹏o fm e t a I l p r o t e i n 鼬e 8 1a n d _ 2i ns e m ma n dl

32、j v e rt i s s u eo fp a t i e n t s w i t hl i v e rc i f n l o s i s J N a t lM e ( 1Jc h i 腑，2 0 0 l 。8 l ( 1 3 ) ：8 0 5 - 8 0 7 聂青和，谢玉梅。周永兴肝硬化病人血清、肝组织中金属蛋白酶 组织抑制因子的表达及意义 J 】中华医学杂志。2 0 0 l ，8 l ( 1 3 ) ： 8 0 5 8 0 7 2 N i eQ H ，x i eY M ，z h 吼IY x ，e ta 1 c o m p 8 r i s o no ft h el o c a t i o

33、na n de x p 陀s s i o n ，fT I M P sb e t w e e ni m m u n ei n d u c e da n dt o x i ni n d u c e dH V e r6 一 b m 8 i sm o d e l i nm t J c h i n e s eH e p a t o l o g y ，2 0 0 5 ，l O ( 2 ) ：8 2 - 8 5 聂青和，谢玉梅，周永兴，等毒素利及免疫型大鼠肝纤维化肝组 织中金属蛋白酶组织抑制冈子定位及表达差异( J 】肝脏。2 0 0 5 ， l O ( 2 ) ：8 2 8 5 3 c a oQ ，M a

34、 kK M ，L i e b e rc s L e p t i nf P p 陀s s e sm a t r i xm e t a l l o p m t e i n a 8 e lg e n ee x p r e s s i o ni nL x 2h u m a nh e p a t i c $ t e l l a t ec e u B J JH e p a t o l ， 2 0 0 7 ，4 6 ( 1 ) ：1 2 4 一1 3 3 4 L u ox D ，N i eQ H s i g I l i f i c a n c eo ft i s s u ei n h i b i t o r

35、 so fm e t a I l p m t e i n 嘲s i nh 。p a t i c 肋m s i s J c h i n e s eH e p a t o l o g y ，2 0 0 3 ，8 ( 2 ) ：4 0 4 2 罗新栋，聂青和金属蛋白酶组织抑制因子在肝纤维化研究中的 价值 J 】肝脏，2 0 0 3 ，8 ( 2 ) ：4 0 4 2 5 Y o s h 巧iH ，K u f i y a m as ，M i y a m o t oY ，e ta LT i s 8 u ei n h i b i t o r0 fm e t a l l o p r o t e i n a

36、s e s lp m m o t 姻l j y e r6 b r ：0 s i sd e V e l o p m e n ti nat 髓n 8 9 e n i cm o u m o d e l J H e p a t o l o g y ，2 0 0 0 ，3 2 ( 6 ) ：1 2 4 8 一1 2 5 4 6 N i eQ H ，c h e n gY Q ，x i eY M ，e ta LI n h i b i t i n ge f f e c to fa n t i B e n s eo l i 学o n u c l e o t i d e Bp h o s p h o r t h

37、i o a t eo ng e n ee x P r e B B i o no fT I M P 1i nm tU v e rf i - b 8 i 8 J 】w o d dJc a s t m e n t e m l 。2 0 0 I ，7 ( 3 ) ：3 6 3 - 3 6 9 7 c a 而“g t o nJ C ，A m b m sV R o l eo fM i c m R N A si nP l 蛐t 蛐dA n i m a l D e - v e l o p m e n t J s c i e n c e ，2 3 ，3 0 l ( 5 6 3 1 ) ：3 3 6 3 3 8 万方数据