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1、第 1 6 卷第 I 期 1 9 9 9 年3月 实验动物科学与管理 L AB OR A TO RY ANI MAL S C I E NC E AND A DMI NI S TR ATI O N V o l . 1 6 No . 1 Ma r c h , 1 9 9 9 大鼠实验性甲亢心肌内肌酸激酶变化的免疫组化研究 曾林李劲松曲在屏曹永成李学勇 江其辉 济南军区总医院病理科( 济南 2 5 0 0 3 1 ) 摘要 以药物诱导的方法建立了大鼠实验性甲亢模型， 并对该模型心肌切片进行了免疫组化染 色， 检测肌酸激酶。结果显示， 随着甲亢病程的延长， 着色呈现酶含量降低， 酶活性减少的变化。实验
2、证 实甲亢时心肌呈现渐进性缺血过程。 类健词: 甲状腺功能亢进症心肌缺血肌酸激酶免疫组织化学染色 应用免疫组织化学的方法研究甲状腺 功能亢进症( 以下简称甲亢) 心肌缺血少见 报道。为探讨甲亢时心肌缺血的程度及变 化规律， 本实验建立了甲亢动物模型， 检测 了心肌内肌酸激酶。 1 甲亢模型的建立 1 . 1 实验动物及分组 军事医学科学院 实验动物中心提供的Wi s t a r 大鼠3 0只， 8 0 - 9 0日 龄， 体重2 2 0 - - 2 4 0 g ， 平均体重 2 3 4 . 6 g ， 雌雄各半。随机分成6 组， 每组5 只， 第1 组为对照组， 第2 一6 组为实验组。 1
3、. 2 诱导药物甲状腺片， 济南生物化学 制剂厂生产， 批号9 5 0 3 0 1 ， 每片重4 0 m g o 1 . 3 诱导方法将甲状腺片均匀混于大 鼠饲料粉中， 制成颗粒饲料， 饲喂实验组大 鼠。每次饲喂时， 待大鼠食完含甲状腺片 饲料后， 再饲喂常规饲料。平均每日每只 大鼠 服甲 状腺片4 m g 1 , 2 1 。 对照 组除 不 饲 喂含甲状腺片饲料外， 其他条件完全同实 验组。 1 . 4 处死动物及实验观察分别于喂药 后2 0 d 处死第2 组， 3 0 d 处死第3 组， 4 0 d 处死第4 组， 5 0 d 处死第5 组， 6 0 d 处死第 6 组和第 1 组大鼠。6
4、 组大鼠在2 0 d内体 重、 体温、 心率、 情绪等无明显变化。3 0 d 后第4 , 5 , 6 组大鼠体重由 平均2 3 3 . 2 g 降 至1 9 0 . 6 g ， 体温由平均3 9 . 2 升至4 0 . 1 ， 心跳频率由平均 4 7 5次/ m i n增加至 5 9 2 次/ m i n ， 并出现惊恐躁动现象。4 0 6 0 d 期间， 第5 , 6 组大鼠惊恐躁动现象更 甚。整个实验期间， 实验组大鼠进食、 饮水 明显比对照组多。对照组大鼠未查见上述 变化及其他变化。 1 . 5 病理切片制备处死后立即取出各 组大鼠心脏， 福尔马林固定， 常规石蜡切 片， 白片以备免疫组
5、化染色。 1 . 6 大鼠血清T 3 , T a 检测分别于处死 前采各组大鼠眶下静脉血， 2 5 0 0 r / m i n 离 心， 留取血清，以放射免疫法检测。 结果 见表 1 . 表1 实验大鼠血清T 3 , 几浓度与正常大鼠比较 ( .x土s ) 组别 T 3 ( n m o l / L ) 几( n m o l/ L ) 0. 6 0士0. 1 1 7. 2士1 . 3 0. 6 9士0. 1 2 0. 2士 1 . 2 0. 8 1士0. 1 2 5. 5士1 . 4 1 . 0士0 . 1 * 3 1 . 8土2 . 5 “ 1 . 1士0 . 1 * 3 2 . 6 士1 .
6、 9 . 1 . 2士0. 1 * 3 4. 5士2. 1 “ 注: 统计方法采用D u n n e d s 的均值比较法， 同一行内有* 号组与对照组有非常显著差异P0 . 0 1 . * 军事医学科学院实验动物中心， 北京1 0 0 0 7 1 1 9 9 9 年( 第 1 6 卷) 第 1 期实验动物科学与管理 上述临床表现以及第4 , 5 , 6 组T 3 , T 4 的测定结果与对照组间存在非常显著差 异， 说明第4 , 5 , 6 组大鼠实验性甲亢模型 的建立是成功的。 表 2 组别 表达 心肌内肌酸激酶免疫组化表达 1 2 3 4 5 6 十+十+ 2 肌酸激酶一肌型抗原的制备
7、雄性 Wi s t a r 大鼠 1 0只， 体重 2 2 0 一 2 4 0 g ， 采用无菌操作的方法， 摘取双后腿 纯净肌肉， 冷冻、 复溶、 匀浆后， 经 1 X1 0 4 r / m i n 超速低温离心取上清液， 加乙醇搅 拌均匀， 0 . 8 1 X 1 0 4 r / m i n低温离心， 弃上 清液， 于沉淀中加T r i s 一 H c l ( p H 7 . 4 ) 缓冲 液， 拌匀， 再经 1 X 1 0 4 r / m i n 离心， 最后取 得上清液6 0 m L ， 经透析及2 次离子层析 过滤， 梯度洗脱， 分光光度计检测， 收集峰 值管， 得到较纯的肌酸激酶。
8、 3 兔抗鼠肌酸激酶一肌型抗体的制备 经免疫琼脂糖双扩散反应鉴定无肌酸 激酶抗体的纯种大耳白雄兔 6只， 体重 2 . 5 k g 左右， 月龄8 个月左右， 按常规进行 免疫注射3 次后， 静脉注射抗原 3 次。当 测定抗体效价合格后， 颈动脉采血， 分离血 清， 一 2 0 保存备用。 4 免疫组织化学染色阳性判定标准及结 果 免疫组化染色采用P A P 法， P A P的工 作浓度为 1 : 1 0 0 ， 桥抗体的工作浓度为 1 : 2 0 。染色背景呈浅黄色， 心肌呈褐色， 肌酸 激酶阳性区域表现为棕黑色、 圆形、 针尖大 的微细颗粒， 弥漫性分布于肌细胞中。阳 性细胞必须具备细胞结
9、构清晰; 阳性 颗粒定位好; 着色明显高于背景。染色 判定标准为不着色无阳性细胞为“ 一” ，阳 性细胞占细胞总数少于2 5 %为“ + ” ; 2 5 - 5 0 % 为“ +” ;5 0 一7 5 %为“ +” ; 7 5 9 6 以上为“ 十十十十 ” 。 染色结果见表2 0 5 讨论 观察实验动物， 第4 , 5 , 6 组在体温、 体 重、 心率、 进食、 饮水、 情绪等方面和对照组 比较有明显变化， 和甲亢病人的临床表现 比 较一 致; 血清T 3 , T 4 的测定结果存在非 常显著性差异( P0 . 0 1 ) ， 说明大鼠实 验性甲亢模型的建立是成功的。 文献报道 3 ， 甲
10、亢时心肌内线粒体受 到破坏。因肌酸激酶大部分存在于线粒体 内， 推测甲亢时肌酸激酶的含量应该因为 线粒体的受损坏而减少。本实验结果证实 了这一点。 研究发现 4 ， 甲 状腺激素对心肌功能 有较大的影响， 其机理尚未完全明了。有 人认为甲状腺激素影响心肌内氧化磷酸化 或腺昔酸环化酶活性 5 。本实验提示， 心 肌内肌酸激酶对甲状腺激素的变化敏感， 甲亢时该酶活性降低， 可以认为过高的甲 状腺激素影响了肌酸激酶活性。 P A 1 法染色原理是抗原抗体的特异 性亲和反应， 不易引起非特异性反应 6 0 肌酸激酶和心肌缺血有明显的相关， 依据 肌酸激酶的含量及活性来判断心肌缺血程 度， 特异性强，
11、敏感性高， 是较理想的方 法 7 ) 。实验证实， 甲亢时心肌内肌酸激酶 含量随病程的延长、 病情的加重逐渐减少， 活性逐渐降低， 表明心肌呈现一个渐进性 的缺血过程。提示心肌内肌酸激酶含量及 活性的变化， 是心肌缺血、 以至于心肌损伤 的部分生化基础。 参考文献 刘安丽， 贺生 . 家免实验性甲亢心肌形态学观察 . 北京实验动物科学， 1 9 9 1 ; 8 ( 3 ) : 2 2 徐叔云 . 临床用药指南 . 第 2版 . 合肥: 安徽科学 1 0 实验动物科学与管理1 9 9 9 年( 第1 6 卷) 第1 期 技术出版社， 1 9 9 4 : 9 7 8 -9 8 0 李广生， 王凡心
12、肌病理学 . 上海: 上海科学技术出 版社， 1 9 8 5 : 2 3 4 一2 3 5 H o h J F Y , e t a l . E l e c t r o p h o r e t i c a n a ly s is o f m u l t i p l e f o r m s o f r a t c a r d i a c m y o s i n : E f f e c t o f h y p o t h y s e c t o m y a n d t h r o x i n e r e p l a c e m e n t . J Mo l C e l l C a r d i a l
13、 , 1 9 8 7 ; 1 0 : 1 0 5 2 . 陆荣宝译 . 甲状腺性心脏病 . 国外医学心血管疾病 分册， 1 9 8 0 ; 7 ( 3 ) : 1 6 4， 温祥云， 李文， 陈铁军 . 早期缺血心肌内肌酸激酶变 化的 病理学研究. 临床与实验病理学杂志， 1 9 9 5 ; 1 1 ( 3 ) : 2 2 1 S ie g e l R J , S a id J W, S h e l l WE , e t a l . I d e n t if ic a t io n a n d l o c a l i z a t i o n o f c r e a t i n e k i n
14、a s e B a n d M i n n o r ma l i s 一 c h e m i c a n d n e c r o t i c m y o c a r d i u m: A n i m m u n o h i s t o - c h e m i c a l s t u d y . J Mo l C e l l C a r d i o l , 1 9 8 4 ; 1 6 : 9 5 I mmu n o h i s t o c h e mi c a l S t u d y o f t h e C r e a t i n e - k i n a s e C h a n g e s i
15、n E x p e r i me n t a l H y p e r t h y r o i d i s m My o c a r d i u m i n R a t s Z e n g L i n L i D e p a r t m e n t o f P a t h o lo g y , L a b o r a t o r y A n i ma l C e n t e r , J i n s o n g Q u Z a i p i n g C a o Y o n g c h e n g G e n e r a l H o s p i t a l o f J i n a n C o m m
16、a n d , J i n a n 2 5 0 0 3 1 L i X u e y o n g J i a n g Q i h u i A c a d e m y o f Mi l i t a r y Me d i c a l S c i e n c e s , B e ij i n g 1 0 0 0 7 1 A b s t r a c t T h e r a t m o d e l o f e x p e r im e n ta l h y p e r t h y r o id is m in d u c e d b y t h e d r u g w a s b u ilt a n d
17、t h e m y o c a r d iu m c r e a - t i n e k i n a s e c h a n g e s w e r e a n a l y s iz e d b y i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g m e t h o d . T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e s t a i n i n g c o l o r d e - c r e a s e o c c u r r e d a s h y p e r t h y roi d
18、i s m g o t m o r e s e r io u s , w h i c h i n f e r r e d t h a t t h e s t a t e o f m y o c a r d i a l i s c h e m i c g o t m o r e a n d m o r e s e r i o u s b y e x t e n s io n o f t h e c o u r s e o f t h e d i s e a s e . K e y w o r d s : H y p e r t h ro id i s m My o c a r d ia l i
19、s c h e m ic C r e a t i n e k in a s e I m m u n o h is t o c h e m i c a l s t a in in g R a t s 简讯I 我 国 确定下 一 步 创新 药 研究 与 产 业 化 工作 重 点 在过去开展的创新药研究、 新药筛选、 建立G L P中心、 重点实验室和 兀 二 P中心， 以及新药博士基金 工作的基础上， 科技部确定下一步的工作安排: 重点选择数十个创新药物， 加强支持力度， 跟踪管理， 确保2 0 0 0 年部分获得新药证书; 组织新药临床实验研究中心和新药安全评价中心实验室开展交流、 互通信息、 取长补短， 分工合作， 促进各中心的筹建工作; 在具有现代管理水平和国际交流能力的单 位， 考虑建立具有中药特色的安全评价中心; 国家新药基金将重点支持全新化合物的研究工作和中药 或植物药先导化合物发现研究工作， 同时可考虑支持各筛选中心或实验室发现的生物活性样品; 拟于 9 9 年 1 0 月召开较大规模的医药博士论坛大会。科技部、 国家中医局与国家药品监督管理局联合成立 中药工作组， 研究中药标准的有关法规问题， 共同开展立法前的有关研究工作， 同时， 与美国F D A合作， 让F D A制定的植物药标准贯穿我们的意识， 保护国家利益。 李冠民供稿