小鼠结核病初期T淋巴细胞亚群穿孔素和颗粒酶B的检测.pdf

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1、小鼠结核病初期T 淋巴细胞亚群穿孑L 素 和颗粒酶B 的检测 邓薇薇1 ，雷建平2 ( 1 南昌大学研究生院医学部2 0 0 5 级；2 江西省胸科医院呼吸内科，南昌3 3 0 0 0 6 ) 1 1 摘要：目的了解结核病初期T 淋巴细胞亚群内穿孔素和颗粒酶B 的表达水平。方法将3 0 只小鼠随机分为2 组：对照组和试验组各1 5 只。实验组经尾静脉途径接种结核菌株H 。，R v0 1m g 。感染6 周后，应用流式细胞仪检 测外周血中T 淋巴细胞亚群内细胞因子( 穿孔索和颗粒酶B ) 的表达。结果C D 8 + T 、C D 4 + C D 8 + ( D P ) T 淋巴细 胞内颗粒酶B

2、阳性细胞百分率比对照组显著升高( P 0 0 5 ) 。结论在结核 病初期，C D 8 + T 、D P T 淋巴细胞内颗粒酶B 阳性细胞增多，而C D 4 + T 淋巴细胞内颗粒酶B 阳性细胞和C D 8 + T 、 C D 4 + T 、D P T 淋巴细胞内穿孔素阳性细胞无显著变化。 关键词：结核病；T 淋巴细胞亚群；穿孔素；颗粒酶B # 动物，实验；小 中图分类号：R - - 3 3 2文献标识码：A文章编号：1 0 0 0 - - 2 2 9 4 ( 2 0 0 8 ) 0 5 - - 0 0 1 1 - - 0 4 D e t e c t i o no fP e r f o r i

3、 na n dG r a n z y m eBi nT L y m p h o c y t eS u b s e t si nT u b e r c u l o s i sI n f e c t i o no fM I C E D E N GW e i w e i l ，L E IJ i a n p i n g z ( 1 2 0 0 5G r a d g eo fM i d i c a lD e p a r t m e n to fG r a d u a t eS c h o o l ，N a n c h a n gU n i v e r s i t y ； 2 D e p a r t m

4、e n to fR e s p i r a t o r yM e d i c i n e ，J i a n g x iT h o r a c i cH o s p i t a l ，N a n c h a n g3 3 0 0 0 6 ，C h i n a ) A B S T R A C T ：O b j e c t i v eT oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o nl e v e l so fp e r f o r i na n dg r a n z y m eBi nTl y m p h o c y t es u b s e t si

5、 nt h ep r o t e c t i v ei m m u n ea g a i n s tt u b e r c u l o s i s M e t h o d sT h i r t ym i c ew e r er a n d o m i z e di n t ot w og r o u p s ：n a m e l yc o n t r o lg r o u pa n de n p e r i m e n t a lg r o u p ( n 一1 5e a c h ) 。0 1m g s t a n d a r dp e r s o nt y p em y c o b a c

6、t e r i u mt u b e r c u l o s i sw e r ei n j e c t e di n t ot h et a i lv e i no fm i c ei ne n p e r i m e n t a lg r o u p s A t6w e e k sa f t e ri n f e c t i o n ，p e r c e n t a g eo fp e r f o r i na n dg r a n z y m eBe x p r e s s i o n si n Tl y m p h o c y t es u b s e t sf r o mp e r

7、i p h e r a lb l o o dw e r ed e t e c t e db yf l o w c y t o m e t r yi n t r a c e l lu l a rs t a i n R e s u l t sT h ep e r c e n t a g eo fg r a n z y m eBe x p r e s s i o ni nC D 8 十Ta n dD P Tl y m p h o c y t e si nt u b e r c u l o s i sm o d e lw e r eh i g h e rt h a nt h a to f i nh e

8、 a l t hc o n t o r l s ( P 0 0 5 ) C o n c l u s i o nI ts h o w e dt h a tg r a n z y m eB e x p r e s s i o ni nC D 8 + Ta n dD P Tl y m p h o c y t e sw e r ei n c r e a s e di nt h ep r o t e c t i v ei m m u n ea g a i n s tt u b e r c u l o s i s ，b u tg r a n z y m eB - e x p r e s s e dC D

9、4 + Tl y m p h o c y t e sa n dp e r f o r i ne x p r e s s i o ni nC D 8 + ， C D 4 + T ，D P Tl y m p h o c y t e sw e r en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e K E YW O R D S ：t u b e r c u l o s i s ；Tl y m p h o c y t es u b s e t s ；p e r f o r i n ；g r a n z y m eB ；a n i m a l ，l a b o r

10、a t o r y ；m i c e 收稿日期：2 0 0 8 一0 4 一0 1 作者简介；邓薇薇( 1 9 7 8 一) ，女，硕士研究生，住院医师，主要从事结核病免疫研究。 通讯作者：雷建平，学士，主任医师，主要从事结核病免疫研究，E - m a i l ：l i e - j i a n p i n g v i p s i n a t o m 。 万方数据 1 2 目前的研究表明，结核病中T 淋巴细胞亚群存 在数量和功能的异常，但其具体机制尚无定论。穿 孔素( p e r f o r i n ) 又称孔形成蛋白( p o r e f o r m i n gp r o t e i n ，P

11、 F P ) 和颗粒酶B ( g r a n z y m eB ，G r aB ) 是介导 细胞毒作用最关键的效应分子 1 。因此，本研究选 择穿孔素和颗粒酶B 作为检测指标，采用流式细胞 仪胞内染色法，对结核病初期组和对照组小鼠外周 血T 淋巴细胞亚群内穿孔素和颗粒酶B 水平进行 检测，以明确结核病初期不同T 淋巴细胞亚群内穿 孔素和颗粒酶B 的表达水平。 l 材料和方法 1 1 实验动物及分组 由江西中医学院实验动物科学部提供，体质量 1 8 2 0g 、清洁级、健康雄性M K 小鼠3 0 只。随机 分为2 组：实验组1 5 只，对照组1 5 只。 1 2 主要试剂 P E 标记的大鼠抗小

12、鼠的穿孔素、颗粒酶B 单 抗以及相应的同型对照抗体、红细胞裂解液，购自 e B i o s c i e n c e 公司。大鼠抗小鼠的C D 3 P e r C P 、 C D 4 F I T C 、C D 8 A P C 单抗以及相应的同型对照抗 体、C y t o f i x C y t o p e r m T MP l u sF i x a t i o n P e r m e a b i l i z a t i o n 试剂盒购自B D 公司。 1 3 结核病小鼠模型的建立口 取在改良罗氏培养基上生长3 周的H 。，R v 的 菌落1 0m g ，加入0 0 5 T w e e n 8

13、0 生理盐水1 0m L 制成菌悬液( 1m g m L ) ，在毛底玻璃试管中磨成均 匀菌悬液，于实验组的每只小鼠尾静脉内注射 0 1m L ( 相当于湿菌0 1m g 只) 。 1 4 结核病小鼠模型效果判断 结核分支杆菌攻击6 周后通过内眦静脉取血的 方式处死全部小鼠，均进行解剖，肺组织各留两份， 一份做病理学检查，另一份按照中国防痨协会结核 病诊断细菌学检测流程做抗酸染色。结果H E 染色 实验组肺组织可见病灶处类上皮细胞和巨噬细胞聚 集。周围有淋巴细胞浸润( 封四图1 ) ；抗酸染色实验 组肺组织见大量红色短小结核杆菌聚集，呈并列、交 叉或重叠排列( 封四图2 ) 。因此证明结核病小

14、鼠模 型建立成功。 1 5 细胞染色 3 1 细胞表面染色按常规方法进行。取1 0 0 弘L 全 血，加入C D 3 P e r C P C D 4 F I T C C D 8 A P C 各2 0 肛L ， 室温避光孕育3 0m i n 。离心洗涤2 次后。重悬细 胞，加入1m L 红细胞裂解液，轻轻摇匀，室温避光 孕育1 5m i n 。再次洗涤2 次后，重悬细胞。胞内因 子染色：加入2 5 0 肛LF i x a t i o n P e r m e a b i l i z a t i o n 4 避光通透2 0m i n ，lm Lc y t o p e r m w a s h 洗涤2

15、次后加入特异性胞内标记单抗各2 0 肛L ( p e r f o r i n - P E 或g r a n z y m eB - P E ) ，室温避光孵育3 0m i n ， 1m Lc y t o p e r m w a s h 洗涤2 次后重悬细胞，待机检 测。 1 6 流式细胞仪分析 如图3 所示，根据T 淋巴细胞表达C D 3 分子的 特点，将门设在C D 3 阳性细胞群，再根据C D 4 和 C D 8 分子表达与否再设3 个门，将T 淋巴细胞分为 3 个主要亚群，即C D 4 + T 、C D 8 十T 和C D 4 + C D 8 十 ( D P ) T 淋巴细胞，再分析穿孔素

16、和颗粒酶B 的表 达。检测经F A C SC a l i u r 流式细胞仪( 美国B D 公 司) ，用C e l lQ u e s t 软件分析，打出散点图，以荧光抗 体染色阳性细胞百分率记录结果。 R 1 门为C D 3 + T 细胞；R 2 门为C D 8 + T 淋巴细胞l R 3r - 1 为C D 4 + T 淋巴细胞；R 4 门为D P T 淋巴细胞 图3T 淋巴细胞门设置 万方数据 1 7 观察指标 观察T 淋巴细胞亚群内穿孔素和颗粒酶B 阳 性细胞百分率。 1 8 统计学分析 用S P S S1 1 0 统计软件包进行统计学分析。 计量资料以均数士标准差( j 土s ) 表

17、示，采用均值t 检验，P O 0 5 ) 。见表1 。 表1T 淋巴细胞亚群内穿孔素阳性细胞占各自亚群的 百分率( i 士$ ) 2 ) 实验组C D 8 + T 和D P T 淋巴细胞中颗粒 酶B 阳性细胞百分率与对照组比较显著升高( P O 0 5 ) 。见表2 。 表2T 淋巴细胞亚群内颗粒酶B 阳性细胞占各自亚群的 百分率( i 士s ，) 3 讨论 细胞毒细胞活化后有一个明显的形态学特征： 胞浆内含有很多颗粒，经研究证实其中主要是穿孔 素和颗粒酶B 。穿孔素被细胞分泌后，首先在靶细 胞的胞膜上形成不同直径的小孔，可以令水分子、 离子以及其他小分子物质进入靶细胞内，而大分子 物质流出细

18、胞外，从而导致细胞渗透性溶解( 膜坏 死) 。同时，颗粒酶B 通过穿孔素在靶细胞膜上形 成的通道进入靶细胞浆，在靶细胞浆内再分布，集 中于细胞核，再在穿孔素的帮助下进人细胞核。并 嵌入D N A 中启动凋亡机制使其发生程序性死亡 ( 凋亡) 。 实验证明。只有穿孔索和颗粒酶共同作用才能 引起大量的靶细胞凋亡。穿孔素单独作用所形成的 膜管型损害，由于其自身的修复功能，并不一定引起 1 3 细胞坏死。颗粒酶B 能迅速介导经穿孔素处理过 的靶细胞D N A 断裂，而对未经穿孔素处理的靶细 胞不能发挥作用 4 。 目前的研究表明，在结核病中，特异性C D 8 + T 淋巴细胞主要通过穿孔素和颗粒酶等细

19、胞毒性分子 发挥毒性杀伤作用溶解靶细胞r 5 。在本实验中。 C D 8 + T 淋巴细胞内颗粒酶B 阳性细胞百分率与对 照组比较明显升高。而穿孔素阳性细胞百分率与对 照组比较无显著变化，这说明在结核病初期颗粒酶 B 先启动，而穿孔素启动滞后。机体诱导细胞凋亡 已经开始，但由于缺乏穿孔素的帮助，颗粒酶B 不 能有效清除结核杆菌感染的靶细胞。从而导致结核 病的发生。 C D 4 + T 淋巴细胞是机体抗结核的主要免疫细 胞，它除了通过分泌细胞因子诱导细胞免疫应答外， 还可以通过细胞毒作用直接杀灭吞噬了抗原的巨噬 细胞从而控制结核。国外的研究表明C D 4 + T 淋巴 细胞主要通过F a s F

20、 a s L 介导的细胞凋亡途径杀死 被感染靶细胞 6 。而在本试验中C D 4 + T 淋巴细胞 内穿孔素和颗粒酶B 阳性细胞百分率与对照组比 较无显著差异。因此，作者推测在结核病初期，穿孔 素和颗粒酶B 途径并不是C D 4 + T 淋巴细胞抵抗结 核参与免疫的途径。 目前已证实D P T 淋巴细胞是结核病的重要保 护性免疫活性细胞【7 - 9 ，它可同时识别抗原提呈细胞 递呈的与M H C1 I 类分子相结合的抗原信息和靶细 递呈的与M H CI 类分子相结合的抗原信息，因而 同时具有C D 4 + T 淋巴细胞和C D 8 + T 淋巴细胞功 能。本试验表明，在结核病初期，D P T

21、淋巴细胞与 C D 8 + T 淋巴细胞一样，颗粒酶B 阳性细胞显著增 多而穿孔素阳性细胞无明显变化。因此，作者推 测，D P T 淋巴细胞也可以通过穿孔素和颗粒酶途径 参与结核病的免疫反应，只是它们与C D 8 + T 淋巴 细胞一样，在结核病初期，穿孔素启动滞后，导致结 核杆菌不能有效清除，结核发病。 综上所述，结核病中存在着T 淋巴细胞亚群功 能的异常，对其进一步深入研究对防治结核病非常 重要。 参考文献： 1 S m y t hMJ K e l l yJM ，S u t t o nVR ，e ta 1 U n l o c k i n gt h eS e c r e t s o fC y

22、 t o t o x i cG r a n u l eP r o t e i n 虹3 3 】L e u kB i o | 。2 0 0 1 ，7 0 ( 1 ) 1 1 8 - 2 9 2 谢惠安，阳国太。林善梓。等现代结核病学 M 北京：人民卫 生出版社2 0 0 0 1 9 3 - 9 8 ( 下转第1 6 页) 万方数据 鎏亘匿堂堕堂塑兰竺竺苎堡蔓塑堂蔓曼塑垒! 丝垒竺生! 翌丝! 丝! 垡! ! ! 翌! 生丝罂星型兰壁竺璺：竺! 塑：型竺苎 ( V I L I ) 3 q 。呼吸系统静态压力一容餐曲线( P _ V 曲 性随机对照研究进一步证实。 线) 完整反映了肺的呼吸力学状态，

23、在急性肺损伤 祟妻寺越 ( A I 。I ) 并i lA R D S 中该曲线表现为上下2 个拐点：下 万丐义陬： 拐点代表大部分肺泡开始扩张时的临界点；上拐点 1 黄侠，高伟陈施俭t 等重症急性胰腺炎伴成人呼吸窘迫综合 代表大部分肺泡过张的临界点，以其上拐点限制 征的救治 J 肝胆胰外科杂志2 0 0 0 1 2 2 ：8 5 - 8 6 V T 、下拐点选择P E E P 适合个体化的病理生理特 r 2 P S h 。i e 。l 。d sm C ；J 。：_ 三：三：= i 。H 。，P 。L 。u n T g 。I ：爻凳笼： 点，有可能减轻机械通气造成的肺再损伤3 。在( ) p i

24、 n C r i tC a r e , 2 0 0 2 ，8 ( 2 ) ，1 5 8 - 1 6 3 , S A P 并发A R D S 的机制中，炎症介质的作用日益受E 3 T h eA c u t 。R e s p i r a t o r yD i s t r e s sS y n d mN e t w o r k V e n t i l a t i o nw i t h 到重视，提出了“细胞因子级链效应学说”。近年该L o w e r T i d a l V o l u l e s C o m p a r e d w i t h T r a d i t i o n a l T i d

25、a l V o l u m e s 学说认为：重症A P 时粒细胞，特别是中性粒细胞核 f o rA c u t e1 ，u n g1 n j u r ya n d 。h eA c u eR 。s p i r a t o r y m 。5 8S y n 一 转录因子N F K B 过度激活，使中性粒细胞产生 。 ：= 2 量三= ：耋竺。, 一3 4 2 M ：1 E 3 烈0 1 - a 1 1 3 0 H 8 i g h d a 。腓 大量的T N F a 、I L 一1 、I I 一一6 、I L - 8 等细胞因子”3 ，以上 u p r e g u l a t e sI n t r

26、a p 。l m o n a r yc y t o k i n e si na n i nV i v oM o u s e 细胞因子可进一步加重重症A P 对全身多个器官损 M o d e Io fV 。t i l 。t o r I n d u c e dL u n gI n j 。r y J JA p p lP h y s i o l 。 伤，对肺组织损伤尤其明显，从而加速A R D S 的发 2 0 0 3 9 5 ( 4 ) ：1 3 8 5 1 3 9 3 生阳 。D e n h a mW 等韵研究提示，I L - h 3 和T N F - a 5 3 R o u p l eE ，D

27、a m b r o s i 。M ，S e r v i l l 。G ，e t8 L 量r a o n0 fT d a lw “” 在实验性s A P 肺损伤过程中具有重要作用。 盏芝i 芝黑芑，? ：蠹黧= X 要：= 洲” 本研究采用6 8m l 一k g 潮气量、压力一容量 6 T e l e kG ，F e h e ，J ，J 。k a bF , e ta 1 A c u t 。P a 。t i t i s ：R e c e n tA d ( P V ) 曲线下拐点加2 3c m H z O 为P E E P 、呼吸频删i nU n d e r s t a n d i n gI t s

28、P a t h o p h y s i o i o g y J O r vH e t i l ，2 0 0 0 ， 率为1 6 次r a i n 的肺保护性通气策略治疗A P 并发 1 4 1 ( 6 ) ：2 6 7 2 7 8 A R D S ，观察其对全身性炎性介质T N F a 和I L - 6 的 7 W u l c z y nFG ，K r a p p m a n nD S c h e i d e r d tcT h 。N F k a p p aB R e l 影响。结果显示，C V 组机械通气后2 4h 外周血清 a n d 卜k a p p a B ，G ，e n 。F a m

29、 i l i e s ：M e d i 8 。“d1 舢羔。R 唧a n d T N F a 水平较机械通气前明显升高( P 0 0 5 ) 。 G a s t r o e n t e r o l o g y ，2 0 0 2 ，1 2 2 ( 2 ) ：4 4 8 4 5 7 机械通气后2 4h ，2 组外周血清I I 。一6 水平均较通气 E g S t e e r ML R e l a t i o n s h i pb e t w e e n P a n e r e a t i t i sa n d L u n g D i ”。 前有所升高，但差异均无统计学意义( P 均 0 0 5 )

30、 。 J R 8 8 p 。P h y 8 i 。1 2 0 0 1 1 2 8 1 ：1 3 16 这些结果提示，在治疗A P 并发的A R D s 中，肺保护 口竺：兰：= = ：= ： 性通气策略引起的全身性炎性反应较常规机械通气 S y n d r o m 。t h r o u g ha nI n t e r l 。k i + 1 。1 1 dT u m o ，N e c r o s i 。F a e t “ 所致的全身性炎性反应更轻。d e p e n d e n tM - e t z h a n i s m J S u r g e r y ，1 9 9 7 。1 2 2 ( 2 )

31、 ：2 9 5 3 0 1 总之，本研究结果提示，在治疗A P 并发A R D S( 责任编辑：胡炜华) 中，肺保护性通气策略较常规机械通气可能更为合 适，但其确切的临床效果需要多中心、大样本的前瞻 、 ( 上接第1 3 页) 3 4 5 6 3 7 R a j e s w a r iDN S e l v a r a jP ，J a w a h a rMS ，e ta 1 E l e v a t e dP e r - c e n t a g eo fP e r f o r i nP o s i t i v eC e l l si nA c t i v eP u l m o n a r yT u

32、 b e r - e u l o s i s J I n d i a nJM e dR e s ，2 0 0 6 ，1 2 3 ( 5 ) ：6 8 7 6 9 0 马戈细胞毒T 细胞F J 中国医学科学院学报。2 0 0 2 ，2 4 ( 4 ) ： 4 3 9 4 4 2 张慧洁陈兰举，陈名武淋巴细胞哑群在结核感染免疫反应中 的作用 J 实用儿科临床杂志，2 0 0 6 ，2 1 ( 1 9 ) ：1 3 4 2 1 3 4 3 S i l v aCL L o w r i eDB fI d e n t i f i c a t i o na n dC h a r B c t e r i z

33、a t i o no f M u r i n eC y t o t o x i eTC e l l st h a tK i l lM y c o b a c t e r i u mT u b e r c u l o s i s J I n f e c tI m m u n e 2 0 0 0 。6 8 ( 6 ) 1 3 2 6 9 3 2 7 4 雷建平，彭燕。熊国亮，等卡介苗接种对大鼠外周血中C D 4 + C D 8 + 双阳T 细胞的影响 J 中华结核和呼吸杂志，2 0 0 4 ，2 7 ( 1 2 ) t 8 6 5 - 8 6 6 8 3 雷建平彭燕。熊国亮，等卡介苗免疫对大鼠抗结

34、核发病和T 淋巴细胞亚群的影响 J 中国预防医学杂志，2 0 0 7 8 ( z ) ；8 1 8 4 9 3 雷建平彭燕熊国亮。等不同时期卡介苗免疫治疗对结核病 大鼠疗效和C D 4 + C D 8 + 双阳( D P ) T 细胞的影响 J 中国防痨 杂志2 0 0 6 2 8 ( 6 ) ：4 0 4 4 0 7 ( 责任编辑：钟荣梅) 万方数据 结核病初期T 淋巴细胞亚群穿孔素和颗粒酶B 的检测( 正文见第1 l 页 喜j ， 。 固1 核病钾划小鼠肿组织辅理表现( H E ) 幽0 结核病初期小鼠肺m 织抗酸染色表现( H E 超声引导下经皮微波凝固治疗复发性肝癌的临床应用( 正文见

35、第6 0 页) 幽l * 疗前肝癌彩色多普勒卢像目 图2 镕疗目癌彩色# 昔勒月像阿 翌旦! ! 兰竖旦! ! ! ! ! 兰! ! 里! ! 里 江西医学院学报 J I A N G X IY I X U EY U A NX U E B A O A C T A A C A D E M I A E M E D I C I N A EJ I A N G X I 2 0 0 8 年10 月第4 8 卷第5 期1 总第1 6 6 期) 主管单位：南吕人学医学院 主办单位：南昌大学医学院 创刊年：1 9 5 6 年 主编：高国 出龋单位：南晶大学医学院学报编辑部 地址：江西省南昌市八一大道46 l 号 邮政编码：3 3 0 0 0 6 电子邮箱：1 x y b c h i n a j o u r n a ln e tc n 电话：( 9 7 9 1 ) 6 3 6 1 2 5 9 传真：( 0 7 9 1 ) 6 3 6 1 2 5 9 照排：南昌大学医学院学报编辑部 印刷：汀西嘉欣印务有限公司 订阅：牟国各地邮局 国内发行：江两省报刊发行局 国外发行：中国国际图书贸易总公司 北京3 9 9 信箱，1 9 0 5 4 4 I N 内统连续出版物号：C N3 61 0 2 9 R 邮发代号：国内4 41 2 0 国外Q 4 4 2 9 定价：1 00 0 元 万方数据