小鼠酪氨酸酶siRNA的体外有效性实验研究.pdf

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1、2 0 0 8 年1 2 问 中国比较医学杂志December，2008 第1 8 卷第1 2 期 C H I N E S EJ O U R N A LO FC O M P A R A T I V EM E D I C I N E V 0 1 1 8 N 0 1 2 矿8 、麟、e R 蟛“弩 鬟研究报告葛 ( i m 麟龄镕曹 小鼠酪氨酸酶s i R N A 的体外有效性实验研究 贾秀华1 ，黄冰1 ，庄菁1 ，朱翔2 ，廖东江1 ，葛坚1 ，林少春1 ，徐晓平1 ，彭展1 F O 0 5 ，艮h 0 0 5 ；h = 1 7 9 。2 1 7 F O 。0 5 ，h F O 0 5 ，h

2、0 0 5 ) ，其它 各组之阉差异均有显著性( F = 5 8 ，4 8 5 F O 。0 5 ，P F 0 0 5 ，P 0 0 5 ) ；干扰后7 2 h ，s i N M 一 0 1 1 6 6 1 _ 0 0 2 ，s i N M - 0 1 1 6 6 1 _ 0 0 3 序列干扰效率问差异无 显著蕊，其它各组闻差异均有显著性( F = | 1 7 。3 7 2 F O 0 5 ，P 0 。甾；7 2h 后只有s i N M 。0 1 1 6 6 t 一 0 0 1 片段的黑素含量和干扰效率与其它稀缎之间差 异有显著性( P 9 5 ) 。因此，我们肉眼 所冤的豹荧光量并菲实际转染

3、进入缁脆内的s i R N A 的总量，实际上有许多进入细胞内但没有引起荧光 的有效转染，造藏对转染效率认识酶假象。总之，在 保证有效转染的前提下，m R N A 沉默水平的商低与 转染效率无正院关系，露只与s i R N A 特异性翻稳定 性有关。当然，在同一条件下，即同一条有效的 s i R N A ，转染效率高，相应的沉默效率也高。 在R N A i 过程中，s i R N A 主要引起的是转录后水 平的基因沉默，所以我们选择在m R N A 水平与蛋白 水平进行干扰效果的检测分析。 在m R N A 水平上，三个干扰片段均能使酪氨酸 酶m R N A 有一定程度豹降低。S P S S

4、的分折结果表 明三个干扰片段的抑制作用有明显差异，其中 s i N M 一0 1 1 6 6 1 0 0 1 靛的搀铡佟臻最强，在于挽霜2 4 h 既能发挥最大的抑制作用；其它两个片段的作用强 震都明避弱予该片段。攉测酪氨酸酶基嚣可麓吴看 特殊的关键m R N A 发生功能的结构，s i N M 一0 1 1 6 6 1 0 0 1 片段针对的靶序襄恰好与酪氨酸貉发挥功能酶 m R N A 关系最大，从而可以充分发挥基因沉默作 用H 9 0 。霹见，针对圊一个靶基因霹以合成多种 s i R N A 片段，因此创建一个高效的s i R N A 设计准则 就显褥极其重要，从而可以太大减少体外片段筛

5、选 成本和工作量。 基于酪氨酸酶是黑素生成的主要限速酶，我们 通过酪氯酸酶活性及细胞中黑素含量两个主要指标 来分析干扰后蛋白水平的变化。结果显示干扰后 2 4h 7 2h ，三条s i R N A 片段均能发挥一定的干扰 效率，并且s i N M 一0 1 1 6 6 1 0 0 1 片段的作用最强，能明 显抑制酪氨酸酶活性及黑索的生成，相对于其它片 段有明显的差异。 从R N A i 后酪氨酸酶m R N A 水平与蛋白水平总 的干扰效果来看，在转染詹2 4h 一7 2h 三个时间 点，随着对阂酶推移，干扰效莱及予扰效率隧线的斜 率均呈下降趋势。一方面说明随着时间的延长 s i R N A

6、的于挽作用逐渐降低，另一方嚣说明s i R N A 在细胞内干扰效率变化的随时间的推移逐渐变缓。 本磅究专用于实验的s i R N A 是体外化学合成穰 经过化学修饰的s i R N A 。s i R N A 反义链5 端的低稳 定性是发挥基因沉默功能的一个重要前提，过高的 稳定性会影响s i R N A 双链的解链，过低的稳定性则 会降低s i R N A 的亲和力，并影响之后R I S C 对m R N A 的降解H 引。s i R N A 在转染入细胞盾受细胞微环境的 影响会发生部分降解，从而影响效果。对s i R N A 进 行一定的纯学骖锯，在傈诞其终用效果酶前提下，适 当提高s i

7、 R N A 的化学稳定性，减少降解，从而更好地 发挥佟震。 本实验中我们发现一个有趣的现象：s i N M ， 0 1 1 6 6 1 0 0 1 , q - 段在转染后7 2h ，在m R N A 求平仍保 持较高的干扰效率，但在酪氨酸酶活性和黑素合成 上的干扰效察帮降褥较低。我们分橱这霹能由予莱 种代偿机制在起作用。尽锊酪氨酸酶是黑索生成过 程中的关键限速酶，但并非黑素生成过程巾唯一的 一种催化酶，还有许多其它酶和因素参与了黑色素 的生成。例如通过抑制细胞外信号调节激酶E R K 能导致色素沉着避度，说明E R K 在黑素生成过程 中发挥一定的抑制作用心；又如小眼畸形相关转录 蛋舀M I

8、 T F 对酪氨酸酶的表达吴有极强的激活作 用 ，是黑色素合成过程中重要的调节剂；9 0 K D a 酶孩糖掭S 6 激酶1 - R S K 一1 麓够使M I T F 磷酸纯，导 致M I T F 的降解】，在一定程度上限制皮肤毛发中 色素酶沉积；A k t 信号通路酶激滔= 燕黑色素的生成 过程中也发挥抑制作用；c A M P 反应成分结合蛋白 的磷酸化亦可导致M I T F 的表达，弓l 起黑索合成的 增加。s i R N A 在导致酪氨酸酶m R N A 部分降解以后 可能激活了某种代偿机制，使懿氨酸酶活性增 强j ，并相应的引起黑色素的合成增加。 还有一个现象值得我们注意：在图6 可

9、见，阴性 干揽片段和单纯脂质体对照组的黑素生成量也随着 时间的推移逐渐降低，最后在7 2 h 与s i N M 一0 1 1 6 6 1 + 0 0 2 稗s i N M 一0 1 1 6 6 1 0 0 3 两实验组无赣显差异。说 万方数据 1 6 中国比较医学杂悫2 0 0 8 年1 2 胃筹1 8 豢第1 2 期C h i nJc o 棚p 越e d ，狲e k r 2 0 0 8 ，V o l 。1 8 N o 。1 2 明在R N A i 实验巾存在非特异性的干扰作用。这提 承我锅：( 1 ) 在予扰效率评价时一定要将实验缀与转 染试剂空白对照组进行比较，去除非特异性的干扰 作用；(

10、 2 ) 同时也簧注意阴性予揽片段觞选择。理论 上阴性干扰片段对目的法因不应产生抑制作用；但 如果选择不当，阴性干扰片段可能会与磐的基透在 菜些部位产生非特异性的结合，对目的基因m R N A 产生一定的降解，从丽起不到阴性对照的作用。从 m R N A 及酪氨酸酶活性和黑素合成的干扰效率也可 以看出，本研究所采用的阴性干扰片段仍有很低的 予扰作用，从丽不是最理想的阴性干扰冀段。 总之，本实骏中使用的三个s i R N A 千扰片段都 黥在m R N A 合成及酪氨酸酶活性和黑素合成方覆超 到干扰作用，其中以s i N M 一0 1 1 6 6 1 0 0 1 片段最佳。 这是一种继反义核酸技

11、术潮、基因打靶授术嚣孳| 起 酪氨酸酶基因沉默的新工具滔】。为下步构建体 内更加稳定懿病毒秀载体戆s i R N A 于找片段以及隈 白化病等色素脱失性疾病动物模型的建立提供思 路，并可望在色素沉着性疾病的治疗，以及化妆罴的 开发方面开辟一条新的途径。同时对生命科学中酪 氨酸酶下游的研究也具有重要的指导意义。 参考文献： 【1 】J o n e sK ，H u g h e sj ，H o n gM ，e ta 1 M o d u l a t i o no fm e l a n n g e n e s i sb y a l o i n ：8c o m p e t i t i v ei n h i

12、 b i t o r0 ft y r 8 8 i n a s e J 】P i g n e n tC e l lR 8 8 ， 2 0 0 2 ，1 5 ( 5 ) ：3 3 5 3 4 0 23 Y a n g 掰，K o oJ H ，s a | 壤Y G ，e t 越S t i m u l a t i o no fm d a n o g e n e s i sb y s c e p a r o n ei nB 1 6m e l a n o mc e l l s J 】A c t aP h a r m a c o lS i n ，2 0 0 6 ，2 7 1 1 ) ：1 4 6 7 1 4

13、 7 3 f3 】C a p l e n 辩，P a r d s hS ，I m a n iF ，e ta 1 S p e c i f i ci n h i b i t i o no fg e n e e x p r e s s i o nb ya m a d o u b l e - s t r a n d e d R N A si ni n v e r t e b r a t ea n d v e r t e b r a t es y s t e m s J P r o cN a i lA c a dS c iUSA ，2 ( 1 0 1 ，9 8 ( 1 7 ) ： 9 7 4 2 一9

14、7 4 7 4 】B r a d a e1 ，V a r e k o v aI t S ，W a c e n o v s k yM 。e ts 1 s i R N As e l e c t i o n e r i t e r i a - - - - - - 蛙a t i m i e a la n a l y s e so fa p p l i c a b i l i t y 耐确商| l # 【J 】 B i o c h e mB i o p h y sR e sC o m m u n ，2 0 0 7 ，3 5 9 ( 1 ) ：8 3 一盯 【5 】K i mY J ，N oJ K ，l

15、e eJ S 。e ta l 。A n t i m e l a n o g e n i ca c t i v i t yo f3 ，4 - d i h y d m x y a c e t o p h e n o n e ：i n h i b i t i o no f 姆s i m e ea n dM I T F J 】+ B i 8 8 d B i o t e c h n o lB i o e h e m ，2 0 0 6 ，7 0 ( 2 ) ：5 3 2 5 3 4 【6 】O h g u c h iK ，B a n n oY ，A k a oY ，e ta l 。I n v o l v

16、e m e mo fp h o s p h o l i p a w D Ii nm e l n n o g e n 8 8 i so fm o u l u eB 1 6m l a n o mo e l 鲥J JB i dC h e m ， 2 0 0 4 ，2 7 9 ( 5 ) ：3 4 0 8 3 4 1 2 【7 】D o r r i eJ ，W e U n e rV ，K a m p g e nE ，e ta l 。A ni m p r o v e dm e t h o df o r R N Ai s o l a t i o na n dr e m o v a lo fm e l a

17、n i nc e n t a m i n a t i o nf r o mm e l a n o m a t i s s u e ：i m p l i c a t i o n sf o rt u m o ra n t i g e nd e t e c t i o na n da m p l i f i c a t i o n J 】。 Jl m m u n o lM e t h o d s 。2 0 0 6 ，3 1 3 ( 1 - 2 ) ：11 9 1 2 8 8 】N a k a j i m aM ，S h i n o d aI ，F u k u w a t a r iY ，c ta 1

18、 A r b u t l ni n c r e a s e st h e p i g m e n t a t i o n c u l t u r e dh u m a nm e l a n o c y t e s 螽嘲m e c h a n i s m s 9 】 【l O 】 ( 1 l 】 D 2 【1 3 3 1 4 1 5 【1 6 【1 7 1 8 【1 9 【籀】 2 1 】 2 2 】 2 3 【描】 2 5 】 o t h e rt h a nt h ei n d u c t i o no ft y m s i n a s ea c t i v i t y J 】P i g m

19、 e n tC e l lR e s ， | 辨8 ，1 1 ( 1 ) ：1 2 1 7 。 P e e kA S B e h l k eM A D e s i g no fa c t i v e 删i n t e r f e r i n gR N A s J 】 C u r tO p i nM o lT h e r 2 0 0 7 ，9 ( 2 ) ：l l O 一儿8 1 s h i k a w aM 。X ml tl | l l i iF 。C o m b i n a t i o no fa m i n oa c i d sr e d u c e s p i g m e n t a t

20、 i o ni nB 1 6 F 0m e l a n o m ac e l l s J B i dP h a r mB u l l ，2 0 0 7 ， 3 0 ( 4 ) ：6 7 7 6 8 l 。 D c e n c hJ G 。融e C P ，s h a r pP A s i R N A sc a nf u n c t i o n 蚺 m i R N A s J G e I I D e v ，2 0 0 3 ，1 7 ( 4 ) ：4 3 8 4 4 2 G u mT 。As i l e n c et h a ts 岫v o l u m e s j 】。N a t u r e 2 0

21、 0 0 ，4 0 4 ( 6 7 8 0 ) ：8 0 4 8 0 8 R e y n o l d sA ，L p _ J i k eD ，B 0 8 8 eQ ，械a l 。R a t i o n a ls i R N Ad e s i g nf o r R N Ai n t e r f e r e n c e J 】N a tB i o t e c h n o l ，2 0 0 4 ，2 2 ( 3 ) ：3 2 6 3 3 0 M c M o r r o wT ，C a m p b e l lE ，T u i t eN ，e ta 1 B N Ai n t e r f e r e m

22、：a n o v e la l t e r n a t i v ea p p r o a c hi nn e p h r o t o x i c i t y 蛙a d i e s J 】A h e m a f i v e n m lT i e t m x p e r i m e n t e n 。2 0 0 6 2 3 ( S u p p l ) ：4 0 6 4 0 9 Y o uZ ，H u a n gJ ，Z h e n gY ，e ta 1 R N Ai n t e r f e r e n c ei nf u n c t i o n a l g e n o m i c ea n dm

23、e d i c a lr e s e a r c h 1 】生粝医学工程杂意，2 0 0 4 ，2 1 ( 5 ) ：8 4 8 8 5 1 S a e h s eC ，E c h e v e r r iC J O n c n l o g ys t u d i e s s i n gs i R N Al i b r a r i e s ：t h e d a w no fR N A i b a s e dg e n o m i c e J 】O n c o g e n e 。2 0 0 4 ，2 3 ( 5 1 ) ：8 3 8 4 8 3 9 1 S c h e HM 。S t e l n m

24、 a n nD 。E 函M 。R N Ai 瓣妇辩( R N A i ) 溆 h e m a t o l o s y J A n nH e m a t 0 1 2 0 0 4 ，8 3 ( 1 ) ：l 一8 G uX ，a 煺J ，Y a oY ，e ta 1 E f f e c t so fR N Ai n t e r f e r e n c eO nC D 8 0 a n dC D 8 6e x p r e s s i o ni nb o n em a r r o w - d e r i v e dm u r i l , l ed e n d r i t i cc e l l s J S

25、 c a n dJl m m u n o l ，2 0 0 6 ，6 4 ( 6 ) ：5 8 8 5 9 4 G m y m nA C ，M aj 。P u t n a mD K i n e t i ca n de f f i c a c ya n a l y s i so fR N A i n t e r f e r e n c ei ns t a b l ya n dt r a n s i e n t l ye x p r e s s i n gc e l ll i n e s ( J 】M o l P h a r m ，2 0 D 6 。3 ( 5 ) ：6 0 l 一6 1 3 K

26、i mD S ，K i mS Y ，P a r kS H ，巍a l 。I n h i b i t o r ye f f e c t so f 垂” b u t y l r e e o r e i n o lo nt y 删n a s ea c t i v i t ya n dm e l a n i ns y n t h e s i s J B i d P h a r mB u l l ，2 0 0 5 ，2 8 ( 1 2 ) ：2 2 1 6 2 2 1 9 C h o iY G ，B a eE J 。K i mD S ，e la 1 D i f f e r e n t i a l 特啦a

27、 l i o f m d o n o s o m a lp r o t e i n sa f t e rh i n o k i t i o lt r e a t m e n t J 】JD e r m a t o lS c i ， 2 6 。4 3 ( 3 ) ：1 8 1 一1 8 8 。 K i mH J 。C h oY D 。L e e mK H 。e ta 1 E f f e c t so fe p h e d m eh e r b ao n m e l a n n g e n e s i sa n dg e n ee x p r e s s i o np r o f i l e su

28、 s i n gc D N Am i c r o a r r a yi n B 1 6 翻e b o 啪 j 】。P h y t o t h e rR e s ，2 0 0 6 ，2 0 ( 9 ) ：7 4 8 7 5 4 H e f f m m mK ，L u s c h e rW U p r r 键q d a t i n no fb r a i ne x p r e s s i o no fP - g l y e o p r o t e i ni nM B P 2 - d e f i c i e n tT T t ( ) r a t sr e s e m b l e ss e i z u

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30、nc a t e c h o l a m i n e r g i cn e u r o n a lc e l l s J 】J N e u r o c h e m ，2 0 ，7 5 ( 4 ) ：1 7 7 1 一1 7 7 4 B o o n a n o n t a n a s a r nS 。Y m h i z a k iG 。1 w a iK e t 越M o l 黜妇c l o n i n g 。 g e n ee x p r e s s i o ni na l b i n om u t a n t s a n dg e n ek n o c k d o w ns t u d i e

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32、 F u l l t e x to np a g e1 0 广 。rl7 ：，7 篱 A F m m 【0n m o 2 0 儿3 0n m o l L4 0 u L5 0n m o l L6 u 】m o V L 目2 & i l l 4 ；月F A M * ( 镕E ) 杯E 的s i R N A 目”ln * 目# R l 【 怖】R # 女m N o I cT h cs i R N A c n 【r a l l o n w e d i n l h l se x p e r i m e n t I f t o mF i g2 A I nF i g2 F I s f o l l o 吣：】

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