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1、收稿日期：!“#$“$“；修回日期：!“%$“9-: ;6 通讯作者：曾甫清 （,$-./0：45627 1.899: ;9-） 小鼠趋化因子 !“#$%BCD): $ -?*E2，酶切和测序鉴定插入序列；将重组质粒转染 ?FG 细胞进行体外表达，通过 HI$J?H、K5LM5N6 O09M 鉴定目的基因 的表达，利用趋化小室法测趋化活性。结果测序证实重组表达载体含 -?* 编码序列和人 E2P Q; 段序列，其序列分别 与 P56R.6S 中公布序列比对一致，E2P Q; 段读码框未发生改变；K5LM5N6 O09M 结果证实转染了 A;BCD): $-?*E2 的 ?FG 细胞培养上清中有
2、相对分子质量为 )+“ 的融合蛋白 -?*E2 表达；体外趋化实验表明融合蛋白 -?*E2 对小鼠脾细胞 有趋化活性，且呈剂量依耐关系。 关键词：趋化因子；?*；重组融合蛋白；基因表达；趋化活性 中图分类号：H)*!: 序 列和起始密码：I? DDP ?II I?I P? DIP P? ? ?PI PI，下游引物含 #$端以 O. E 识别序列 代替终止密码的三个碱基：ID? I?I DPD ?D PD? D?D PPP ?I? ?II ?IP，该引物由 I.Y.H. 公司合成。J?H 条件：*9H E 把 E2P 的 Q; 段从 AVY$E2P 上切 下，与目的基因片断连接，而后定向插入经
3、F/6U EEE 和 ,;9H E 双酶切处理的 A;BCD): （ Z ） ，获得 重组质粒命名为 A;BCD): $-?*E2。用 F/6U EEE_ ,;9H E 双酶切鉴定，并送 I.Y.H. 公司测序。 #(2 重组蛋白的体外表达T 按照 /A945;MDEC,!“ 试剂盒说明，将重组质粒 A;BCD):$-?*E2 经 R20 EE 线性化、无水乙醇沉淀后转染至 ?FG 细胞中。用 含 P ，375689789： # ) ，()% 产物 长度 !） ；()% 条件：,? 预变性 ? *67；,? 变性 # 8；# 退火，?A 8；1 HW-.:! 经 V=3 -L J4G% - 双
4、酶切的片段和 4I /0;“ ! X 质粒经 167U -L J4G% - 双酶切的片段分 别于 BC、!“ #C和 A“ YC琼脂糖凝胶电泳，紫外灯 下观察到大小约 ;#A = 片段、 片段和 #?AA = 片段 （图 !） 。三个纯化片段在 “ !*)+!,-. 重组质粒构建成功。取 ; 个含插 入片段的阳性克隆送 ?# 和 .6： #A,B#,#M） 比对完全一致。 图 !$ 目的基因片段的电泳结果 !“ I+BAAA I/0 *3ER9E；B“ ()% 扩增的 *)+!,4I/0 经 167U -L V=3 - 双酶切片段；;“ HW-. 经 V=3 -L J4G% - 双酶切的片段；
5、?“ I+BAAA I/0 *3ER9E；#“ $ 167U - I/0 *3ER9E；M“ 4I/0;“ ! X 质 粒经 167U -L J4G% - 双酶切的片段 B;现代免疫学 BAAM 年第 BM 卷第 ? 期 图 !“ 重组质粒 #$%#(? 的 ,6*+ 表 达，发现转染 4)*+7“ ! 的细胞样品只有内参照片 断，而转染 4)*+7“ !#,=8!(? 的细胞扩增出约 7A9 B 的片断和内参照片断 （图 7） 。进一步对 =$C 培养上清中蛋白进行 D0EF0.9?; 鉴定 !“ 高相对分子质量蛋白标准；1“ 转染 4)*+7“ !；7“ 转染 4)*+7“ !# ,=8!
6、(? !*0“ 重组蛋白 #$% 细胞免疫反应依赖树突状 细胞 （0 细胞之间协 同、有效的相互作用，这种相互作用首先需要 )= 和未致敏 ; 细胞共同移位于二级淋巴结特定的微 环境，而二者定向趋化过程中趋化因子 =8!、 =81! 和 其 共 受 体 =6N 发 挥 重 要 作 用 P QJ。 =8! 和 =81! 表达于二级淋巴结的高内皮细胞 和 ; 细胞区，=6N 表达于成熟 )= 和未致敏 ; 细 胞，在趋化因子 =8! 和 =81! 的作用下成熟 )= 和未致敏 ; 细胞都移动并定位与二级淋巴结 ; 细 777小鼠趋化因子 =8!(? 融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定 胞区，使得成
7、熟 !“ 向 # 细胞提呈抗原成为可能， 从而使 # 细胞活化。“$% 基因敲除小鼠和 在肿瘤局部表达 “567，削弱了机体对同种 移植的肿瘤细胞的排斥。我们有理由假设全身运用 外源性趋化因子 “567 可能干扰表达 “$% 的 !“ 和未致敏 # 细胞特异地向二级淋巴结移位，可能 是外周封闭作用，也可能是干扰趋化因子的浓度剃 度。因此，外周长期表达外源性趋化因子 “567 可能运用于移植免疫耐受的诱导，或对其他耐受方 案有促进作用。 趋化因子是一类小分子分泌蛋白组成的细胞因 子超家族，在体内半衰期短，反复运用体内浓度波 动大。研究这类分子在体内的功能及治疗运用时， 通常采用重组细胞因子和免疫
8、球蛋白 ?A 的 B+ 段 融合蛋白的方法来延长半衰期，持久地维持其体内 功能，同时也便于检测 6C， 66。在构建 0“567? 融 合基因时，保留了 0“567 +!DE 中的 :.FZ6*GCS NP:;， 668： NC6*NC7S PA， N： G6*%CS 6C P 5.(F4 T#，T8N*8%S NN现代免疫学 8CCG 年第 8G 卷第 期 !“#$%8 “#$)(#(# :“/*+)3，5“ ?70#)7# %)6 3#770#)7# 8#)#;4,F G;6,F5) G78 G:66 6/+: I/J 4/K;4,F5) L/78 G:66 I* *O:H PO WE(X;W *+H 0:J:M+ P6;4,F *+H 2*+ 5)$,(!G LM*)2:+J，*+H J: /+:MJ:H LM*)2:+J I* /H:+J/L/G*6 I/J J*J 78 G:66 JM*+L:GJ:H I/J S:GJ;4,F(5)U 16;4,F；M:G;4,F5) 融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定