小鼠IFNγ基因的克隆及其分子佐剂作用的研究.pdf

《小鼠IFNγ基因的克隆及其分子佐剂作用的研究.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《小鼠IFNγ基因的克隆及其分子佐剂作用的研究.pdf（5页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、O c t 2 0 0 8 2 8 ( 5 ) 实验动物与比较医学L a b o r a t o r yA n i m a la n dC o m p a r a t i v eM e d i c i n e3 6 7 小鼠I F N 丫基因的克隆及其分子佐剂作用的研究 刘勇，王海燕，张甲，王雨舟，张冰 ( 中国农业大学动物医学院，北京1 0 0 0 9 4 ) 【摘要】目的通过融合表达小鼠I F N Y ( M u l F N 的与猪脑心肌炎病毒( E M C V ) 结构蛋白V P l 研究 M u l F N Y 的分子佐剂作用。方法通过R T P C R 克隆I F N 一丫的成熟肽基

2、因，从p G E X 一6 p 1 v p l 中 亚克隆猪脑心肌炎病毒( E M C V ) 毒L 原基因V P I ，分别构建原核表达菌株p E T 3 2 a V P l R o s e t t a ( D E 3 ) 和p E T 3 2 一a V P l M u l F N 一丫，将V P l 及V P I 与M u l F N 一丫在宿主菌R o s e t t a ( D E 3 ) 中进行表达与共表达。 将表达的V P l 及M u l F N T V P l 蛋白分别免疫B A L B c 小鼠，每次免疫2 周后采血，分离血清，利用 E L I S A 测定抗体效价。结果表达

3、的V P l 蛋白分子量为6 0k D ，共表达蛋白M u l F N y V P l 分子量 为7 3k D ，V P l 及M u l F N W P l 蛋白免疫小鼠测定的抗体效价分别为l ：3 2 0 0 0 和l ：1 2 8 0 0 0 。 结论 表达的V P l 蛋白具有良好的免疫原性，可刺激免疫小鼠产生明显的体液免疫反应。 M u l F N Y V P I 免疫小鼠后产生的佐剂效果要强于弗氏佐剂。M u I F N _ y V P I 蛋白能增强小鼠的体液 免疫水平，M u l F N Y 具有一定的分子佐剂效应。 【关键词】M u l F N tE M C VV P l ：

4、原核表达：免疫佐剂 【中图分类号】Q 9 5 3 3【文献标识码】A【文章编号】1 0 0 4 8 4 4 8 ( 2 0 0 8 ) 0 6 0 3 6 7 0 5 干扰素是第一个被发现的细胞因子，是联系 细胞和免疫系统的一种可溶性蛋白质。根据来源和 理化性质町分为I 型和I I 型干扰素，I 型十扰素主 要包括I F N o t ，I F N B ，I F N ，I F N E 和I F N K 。 此外，I F N 一6 ，I F N 一和I F N T 也属于I 型十扰素 家族。I I 型干扰素只包括I F N 一7 。除直接抗病毒的 作用外，小鼠I F N Y 可以抵御细菌感染，治疗

5、肿 瘤和参与寄生虫感染的保护性免疫。I F N 一丫还具有 很好的免疫调节活性，呵作为基因佐剂与疫苗联用 增强免疫效果【。机体的I F N Y 水平已成为评价疫 苗诱导的细胞免疫应答的指标。所以。I F N 一丫的研 究越来越受到研究者的重视。本研究通过酶切的方 法将E M C VV P l 基因与M u I F N 丫先后连接到表达载 体上，成功构建了重组表达质粒p E T 3 2 一a V P l 与 p E T 3 2 a V P l M u l F N Y ，实现了V P l 及V P l 与 M u l F N 丫在宿主菌中的表达与共表达，并通过动物 【收稿日期12 0 0 8 0

6、4 1l 【作者简介】刘囊J ( 1 9 8 0 - ) ，男，硕士，实验动物学， E - m a i l ：s y n d s y l y y a h o o c o r n c n 【通讯作者】张冰( 1 9 6 6 - ) ，男，硕士，副教授，实验动物学， E - m a i l ：z t u m g d b c a u e d u c n 实验初步研究了M u l F N 一 r 的分予佐荆作用，为探 索用于预防E M C V 的基因工程疫苗奠定了基础。 1 材料与方法 1 1 实验动物 8 周龄清洁级B A L B c 小鼠2 0 只，购白军事医学 科学院实验动物中一t ：, S C

7、 S K 一( 军) 2 0 0 7 0 0 4 】。 1 2 主要仪器及试剂 生化培养箱( E R a 2 5 0 A 广东省医疗器械厂) ；冷 冻台式离心机( E p p e n d o r f 公司产品) ；高速离心机( 飞 鸽T G L 12 G B C 型) ；紫外分光仪( P e r k i n e l m e r 公司 产品，U V V I S ) ；P C R 仪( H Y B A I D 公司产品) ：电泳 成套设备( B I O R A D 公司产品) ；成像仪( A l p h aI m a g e r 2 0 0 0 ，A l p h aI n n o t e c hC

8、 O r p o r a t i o n ) ；空气浴摇床( 哈 尔滨东明仪器厂产品) ；原核表达质粒p E T 3 2 一a 购自 N o v a g e n 公司；R N A 提取试剂盒、t a q 酶、T 4 连接 酶和琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自T A K A R A 公司； 羊抗鼠I g G H R P 购自鼎国生物公司。 1 3R N A 的提取与引物设计 C o n A 刺激B A L B c 小鼠，2 4 h 后处死取脾脏， 用T a K a R aR N A 提取试剂盒提取总R N A 。用o l i g d T 万方数据 3 6 8 实验动物与比较医学L a b o r a

9、t o r yA n i m a la n dC o m p a r a t i v eM e d i c i n e O c t 2 0 0 8 2 8 ( 5 ) ( 18 ) 引物对所提R N A 进行反转录，根据C , e n B a n k 中 登录的M u I F N 吖基因序列，采用p I i m e f 5 0 软件在其成 熟肽序列两端设计含H i n d l l I 和X h oI 酶切位点的引 物，上游引物为5 。C C C Q ! I T G T T A C T G C C A C G G C A C A G 一3 。下游引物为5 。C C G 堑丛鲫A G C G A

10、C T C C l _ r I T C C G - 3 。 1 4M u l F N 吖基因的克隆 利用该引物以反转录产物为模板进行P C R 反 应，条件如下：9 5 预变性3m i n ，9 4 变性1m i n ， 5 8 退火3 0S ，7 2 延伸3 0S ，3 5 个循环，最后7 2 延伸7m i n 。P C R 产物经1 琼脂糖凝胶电泳鉴定。 胶回收法纯化M u l F N 一丫基因片段，回收产物与 p E A S Y T s 载体连接，转化后进行P C R 鉴定，鉴定正 确的菌株进行测序。 1 5E M C VV P l 基因的克隆 根据G e n B a n k 中登录的基

11、因序列，采用 p r i m e r 5 0 软件在其序列两端设计含B a mHI 和H i n d I I I 酶切位点的引物，上游引物为5 - C G 鱼墅巡C T C A A G A T G C C T A T C T 3 下游引物为5 C C C 鱼! 至C C A A A A T T G T C C A T G T C T 一3 ，以 P G E X 一6 p 1 v p l 为模板进行P C R 反应，条件如下： 9 5 预变性3m i n ，9 4 变性1m i n ，5 3 退火1m i n ， 7 2 延伸lm i n ，3 5 个循环，最后7 2 延伸1 0m i n 。

12、P C R 产物经l 琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收法纯 化E M C VV P l 基因片段，回收产物与p E A S Y T 3 载 体连接，转化后进行P C R 与鉴定，鉴定正确的菌 株进行测序。 1 6E M C VV P l 重组表达质粒与共表达质粒的构建 E M C VV P IP C R 回收产物和p E T 3 2 a 载体质粒 经B a mHI 和H i n dI I l 双酶切后电泳，回收载体 D N A ，用T 4 连接酶连接载体与E M C VV P l 酶切产 物，将连接产物转化入D H 5 t Z 感受态细胞，筛选阳 性克隆，提取质粒后分别进行B a mHI 、H i

13、n dI I I 双酶切和测序鉴定。M u l F N Y P C R 回收产物与鉴定 后的E M C VV P l 重组表达质粒经H i n d l I I 和X h oI 双 酶切后电泳，回收目的条带，用T 4 连接酶连接 M u l F N - Y 与E M C VV P l 重组表达质粒酶切产物。将 连接产物转化入D H 50 c 感受态细胞，筛选阳性克 隆，提取质粒后分别进行H i n dI I I 、X h oI 双酶切 和测序鉴定。 1 7 重组质粒的诱导表达 将测序正确的重组表达质粒与共表达质粒转入 表达菌株R o s e t t a ( D E 3 ) q h ，均匀涂布L

14、B a m p 板，培 养过夜。将生长良好的阳性菌落接种3m lL B a m p 液体培养基，3 7 快速震荡培养4 6h ，加入I P T G 至终浓度0 5m m o l L ，继续培养4h ，收集菌液。 1 8S D S P A G E 分析 1 20 0 0r m i n 离心收集菌体，超声波裂解菌体沉 淀后。离心收集裂解后上清和沉淀用S D S P A G E 的 方法进行表达产物的检测。 1 9 V P l 与共表达重组蛋白的纯化 离心收集菌体。沉淀先用含有去污剂T r i t o n X 1 0 0 和尿素的包涵体洗涤液分步洗涤去除大部分杂 蛋白后，然后用8m o l 尿素溶解

15、，溶解液稀释至0 O l 0 2m g n m 后放入透析袋中，4 条件下依次在复性 缓冲液6 、4 、2 、0m o l L 尿素中各透析1 次，每 次6h 以上。换P B SB u f f e r 透析4 次，每次6h 以上，透析后测定蛋白浓度。 1 1 0 W e s t e r n b l o t t i n g 分析1 3 】 将纯化的重组蛋白进行S D S P A G E ，目的蛋白 在低温、恒压条件下被转移到聚偏氟乙烯( P V D F ) 膜上。6 5V 转印3h 后，取出P V D F 膜放入1 丽 春红染色液中，条带清晰后切下蛋白M a r k e r ，P V D F 膜

16、用1 0 小牛血清4 “ C 封闭过夜。然后将P V D F 膜 与猪源E M C V 抗血清3 7 反应2 h ，经P B S T 充分洗 涤后再与兔抗猪酶标二抗3 7 反应2h ，最后加入 底物( D A B 和H z 0 2 ) 显色，至出现明显条带后终止。 1 1 1 共表达重组蛋白的免疫效果 将2 0 只B A L B c 小鼠随机分成4 组，每组5 只 ( 表1 ) ，共免疫3 次，每次间隔2 周。每次免疫后 2 周尾静脉采血，分离血清，用E L I S A 测抗体效价。 2 结果 2 1M u l F N - y 基因、E M C VV P l 基因的P C R 扩增 用P C

17、R 分别扩增出长约9 7 9b p 的E M C VV P l 基因片段和4 0 8b p 的M u l F N 一丫基因片段，与预期 的目的片段大小致。 2 2E M C VV P l 重组表达质粒与p E T 3 2 a M u N 彤 V P l 共表达质粒的构建 双酶切后V P l 基因片段与表达载体p E T 3 2 a 连 接，构建成重组表达质粒p E T 3 2 a V P l 。重组表达 质粒p E T 3 2 a V P l 经H i n dI I I 和X h oI 双酶切后与 M U I F N 丫连接，构建成共表达质粒P E T 3 2 - a ， M u I F N

18、Y V P l 。重组质粒转化大肠杆菌R o s e t t a ( D E 3 ) ，提取重组质粒p E T 3 2 a V P l 与p E T 3 2 一a M u l F N Y V P l ，酶切鉴定证明( 图1 ) ，V P l 基因正确插 万方数据 O c t 2 0 0 8 2 8 ( 5 ) 实验动物与比较医学L a b o r a t o r yA n i m a la n dC o m p a r a t i v eM e d i c i n e3 6 9 入表达载体中，M u l F N 一丫正确插入p E T 3 2 a V P l 重 组表达质粒中。经测序确定V P

19、 I 及M u l F N T N P l 基 因的读码框均完全正确。 2 3 表达产物的S D S P A G E 分析 分别于诱导前和诱导后不同时间取样，用1 2 聚丙烯酰胺凝胶进行S D S P A G E 。结果显示，重组 蛋白的表达量在诱导4 h 后达到高峰( 图2 ) 。在加入 I P T G 诱导3 h 后，收集菌液。沉淀经超卢波裂解后， 再离心所得上清和沉淀分别进行S D S P A G E 。结果 发现V P l 与共表达蛋白均为包涵体表达。 2 4 重组蛋白的纯化 包涵体经洗涤后，用分步透析法将大部分杂 蛋白已去除，目的蛋白得到纯化( 图3 ) 。 2 5 重组蛋白的W e

20、 s t e r n b l o t t i n g 鉴定 纯化后的重组表达蛋 J 被转移到P V D F 膜上， 与特异性的猪源E M C V 抗血清反应，结果f j 现很明 显的目的条带( 图4 ) ，即表达的重组V P l 蛋白及共 表达蛋白能被E M C V 阳性血清所识别。 2 6E L I S A 结果 分别于每次免疫后2 周采血，将血清做倍比稀 释，测定各稀释度的O D 值，被检血清的O D 值与 一组阴性样本O D 值均值的比人于或等于3 的血清 最大稀释度即为血清抗体效价，结果如表2 所示。 3 讨论 本试验选择p E T 系列载体中的p E T 3 2 一a 融合表 达了两

21、段外源基囚，在引物设计的过程中考虑到 p E T 3 2 一a 载体一卜存在起始密码子和终止密码子，所 以在两段基因的上下游引物中均未加起始密码子和 终止密码子。在X h oI 酶切位点经酶切连接外源基 因后，使得载体上的终止密码子产牛移码，但移码后 在原来载体卜终止密码予处向5 。端1 0 个碱基左右出 现一个终止密码子，所以，并不影响目的蛋白的 表达，所表达的目的蛋白比预期的要小。在设计 两段外源基因融合时，为了确保融合后阅读框不漂 移，本试验选择了p E T 3 2 a 载体卜B a mHI 、H i n d I I I 和X h o1i 个酶切位点加入到V i a l 和M t t l

22、 F N - 1 两段 基因中。使两段基因之间以及两段基冈与载体之间形 成互补的粘性末端。通过B a mHI 和H i n dI I I 两个 限制性内切酶预先将较长的V P l 基因片段连到载体 卜，形成蘑组质粒p E T 3 2 一a V P l ，然后p E T 3 2 a J V P l 经H i n dI I I 币UX h oI 双酶切，再引入M u l F N Y 基因。 M u l F N 丫基因就通过H i n dI I I 这一酶切位点在币组质 粒p E T 3 2 一a V P I 与V P I 基冈实现了定向融合，成功 构建了罩组表达质耗p E T 3 2 一a V P

23、 l M u l F N 一丫。 本试验通过测定血清I g G 水平研究了机体的体 液免疫状态，结果表明V P l 具有良好的免疫原性， M ：D N AM a k e r1 ，4 ：p E l 3 2 。a 卒绒体2 ：p E T 3 2 一a V P I 双酶t U3 ：p E T 3 2 一a M u l F N W P l 双酶切 图1p E T 3 2 - a V P l - 与p E T 3 2 - a M u l F N - 删P l 的双酶切鉴定 万方数据 3 7 0 实验动物与比较医学L a b o r a t o r yA n i m a la n dC o m p a r

24、 a t i v eM e d i c i n e O c t 2 0 0 8 2 8 ( 5 ) M ：标准蛋白M a k e r1 ，2 ，3 ：p E T 3 2 - a V P I 诱导前，诱导4h ，诱导6h 4 ：7 ：5 和8 ；6 和9 ：p E T 3 2 一a M u l F N Y V P I 诱导前；诱导2h ；诱导4h ；诱导6h 图2v P l 蛋白及M u W N - T V P l 共表达蛋白的S D S - P A G E 分析 M ：标准蛋白M a r k e rl ：8m o l 尿素溶解V P l 包涵体蛋白 2 ：纯化的V P I 蛋白3 ：纯化的M

25、u I F N - 节V P l 蛋白 图3 重组蛋白V P l 与M u I F N 唧1 的纯化 M ：标准蛋白M a r k e rl ：纯化的V P l 蛋白 2 ：纯化的M u I F N a V P I 共表达蛋白 图4 重组蛋白的W e s t e r n - b l o t t i n g 检测 表2 三次免疫后血清抗体效价 能刺激小鼠产生体液免疫反应。共表达蛋白 M u I F N 一“ V P l 能增强机体的体液免疫水平，与V P I 相比，I g G 水平更高，共表达蚩白的免疫效果略 强于弗氏佐剂。重组M u I F N Y 对腹膜下或皮下注射 的约氏疟原虫疟疾疫苗具有

26、很好的免疫辅佐性能， 包括抗体、辅助性T 细胞和迟发犁变态反应在内的 特异性免疫反应均增强【4 】。用M u l F N 丫作为基因佐 剂与分泌型柯萨奇病毒B 3V P l 核酸疫苗联合免疫小 鼠，在一定程度上增强了分泌型C V B 3V P I 基因疫 苗的免疫保护作用【5 l 。本研究发现，M u l F N 丫具有 一定的分子佐剂效应与以上研究相符。 免疫实验结果表明，与注射p b s 对照组相比， v p l 、v p l + 弗氏佐剂、M u l F N T v p l 三个免疫组抗 体效价上升都很快，但M u I F N T v p l 抗体效价上升 明显，比其他两组要快。I F

27、N Y 与疫苗联合应用可 以发挥佐剂作用，鉴于此，本实验将I F N 丫作为 分子佐剂与抗原联合表达，结果表明I F N 一 r 发挥了 分子佐剂的功效，提高了免疫应答的效率。这可 能与I b N Y 能增强a p c 表面M H CI I 类抗原表达有效 的激发抗原提呈有关。 万方数据 O c t 2 0 0 8 2 8 ( 5 ) 实验动物与比较医学L a b o r a t o r yA n i m a la n dC o m p a r a t i v eM e d i c i n e3 7 l 脑心肌炎病毒属于小R N A 病毒科心脏病毒 属【6 】，啮齿类动物是此病毒的天然宿主，此

28、病毒可 以在啮齿类动物体内长期存在而不发病。E M C V 感 染可引起小猪致死性心肌炎和母猪繁殖障碍【，】，该 病已在世界上多个国家暴发和流行，给一些国家的 养猪业造成了巨大的经济损失。已有血清学研究表 明，我国规模化猪场普遍存在E M C V 感染【8 1 。鉴 于E M C V 对我国养猪业的威胁，及早的进行免疫预 防方面的研究十分必要。一般，微R N A 病毒表达 4 种不同的衣壳蛋白，V P I 、V P 2 、V P 3 和V P 4 ， 其中V P l 的抗原性最j 虽【9 1 0 J ，同样，V P l 是E M C V 的保护性抗原。本研究选择了E M C V 的保护性抗原

29、V P l 基因，在p E T 3 2 一a 中进行了表达，并首次引 入细胞因子佐剂M u I F N 一丫基因进行了共表达，初步 研究了M u l F N 一丫的分子佐剂作用，为E M C V 的预 防和控制奠定了基础。 【参考文献】 【1 】H e n k eA ，Z e URM a r d nU ，e t a l D i r e c t - i n t e r f e r o n - Tm e d i a t e d p r o t e c t i o nc a u s e db yar e c o m b i n a n tC o x s a c k i ev i r u sB 3 J

30、 I V i r o l o g y ，2 0 0 3 ，3 1 5 ( 2 ) ：3 3 5 - 3 4 4 【2 】B i n gS u n ，W e l l sJ G o l d m u n t zE ，e t a 1 Aa u a n t i f i e d , c o m p e t i - t i v eR T P C Rm e t h o df o rm e a s u r i n gr a tI F N Ym R N A e x p r e s s i o n 阴J o u r n a lo f I m m u n o l o g i c a lM e t h o d s ，1

31、 9 9 6 ，1 9 5 ： 1 3 9 1 4 8 【3 】萨姆布鲁克J ，弗里奇E F ，曼尼阿蒂斯T 黄培堂译分子 克隆实验指南( 第3 版) 【M 】北京：科学出版社，2 0 0 2 【4 】P l a v f a i rJ H ，D eS o u z aJ B R e c o m b i n a n tg a m m ai n t e r f e r o ni s ap o t e n ta d j u v a n tf o ram a l m av a c c i n ei nm i c e J C l i nE x p l m m u n o l ，19 8 7 ，6 7 (

32、1 ) ：5 - 1 0 【5 】揣侠，高志云，房文亮，等小鼠I F N 丫基因佐剂对分泌 型柯萨奇病毒B 3V P l 核酸疫苗免疫作用的影响【J 】第四 军医大学学报，2 0 0 6 ，2 7 ( 1 6 ) ：1 2 1 5 【6 】M i n o r , P D ，B r o w n ，F ，D o m i n g o ，E ，e ta 1 P i c o r n a v i r i d a e I n ： M u r p h yF 八e ta l ( E I 血) V i r u sT a x o n o m y C l a s s i f i c a t i o na n d N

33、o m e n c l a t u r eo fV i r u s e s S i x t hR e p o r to ft h eI n t e r n a t i o n a l C o m m i t t e eo nT a x o n o m yo fV i r u s e s 【M 】V i e n n a ：S p r i n g e r - V e r l a g A r c h i v e so fV i r o l o g y ，( S u p p t 1 0 ) ，1 9 9 5 3 2 9 3 3 6 【7 】J o oHS E n c e p h a l o m y o

34、 c a r d i t i sv i r u s I n ：L e m a nAD ，e la l ( E d s ) D i s e a s e so fS w i n e 【M 】7 t he d A l n e s ：I o w aS t a t e U n i v e r s i t yP r e s s ，1 9 9 2 【8 】张家龙，盖新娜，马良，等规模化猪场脑心肌炎病毒感 染的血清学调查【J 】- 中国兽医杂志，2 0 0 7 ，4 3 ( 1 ) ：7 2 9 【9 】L 卸dG A ，Z i o l aB R ，S a l m iA ，e ta 1 S t l l l c

35、 t u r eo ft h eM e n g o v i r i o nV D i s t r i b u t i o no ft h ec a p s i dp o l y p e p t i d e s w i t h r e s p e c tt Ot h es u r f a c eo ft h ev i r u sp a r t i c l e J V i r o l o g y ， 1 9 7 7 ，7 8 ：3 5 - 4 4 【1 0 】P a l m e n b e r gA C ，K i r b yE M ，J a n d aM R ，e ta 1 T h en u c

36、l e o t i d e a n dd e d u c e da m i n oa c i ds e q U e n c e so ft h e e n c e p h a l o m y o c a r d i t i sv i r a lp o l y p r o t e i nc o d i n gr e g i o n J N u c l e i cA c i dR e s ，1 9 8 4 ，1 2 ：2 9 6 9 2 9 8 5 C l o n i n go fM u r i n eI F N - 丫a n di t sE f f e c ta saM o l e c u l

37、a rA d j u v a n t L I UY o n g ，W A N GH a l y a n ，Z H A N GJ i a ，W A N GY u z h o u ，Z H A N GB i n g ( C o l l e g eo f A n i m a lM e d i c i n e ，C h i n aA g r i c u l t u r eU n i v e r s i t y , B e i j i n g1 0 0 1 9 3 ，C h i n a J A b s t r a c t 】O b j e c t i v eS m d yt h em o l e c u

38、 l a ra d j u v a n te f f e c to fM u l F N - 丫b yC O - e x p r e s s i n gM u l F N 一丫 a n dE M C Vs t r u c t u r a lp r o t e i nV P l M e t h o dM a t u r ep e p t i d eg e n eo fM u l F N Yw a sc l o n e db yu s i n gR T - P C R V P lo fp i gE M C VW a ss u b c l o n e df r o mp G E X 一6 p 1 v

39、 p l ，a n dc o n s t r u c t e di n t ot h ee x p r e s sp l a s m i d p E T 3 2 一a V P l R o s e t t a ( D E 3 ) a n dC O e x p r e s s i o np l a s m i dp E T 3 2 一a V P I M u l F N tr e s p e c t i v e l y B A L B I c m i c ew e r ei n o c u l a t e dw i t ht h eV P la n dM u l F N T V P Ip r o t

40、 e i n si nE c o l i ，r e s p e c t i v e l y ，f o rt h r e et i m e sa t t w ow e e ki n t e r v a l s ，s e r u mI g Gw e r ed e t e c t e db yE L I S Ae v e r yt w ow e e k sp o s t i n o c u l a t i o n R e s u l tI n E c o l iR o s e t t a ( D E 3 ) ，e x p r e s s i o na n dC O e x p r e s s i o

41、 nw e r es u c c e e d e dI P T G ( I s o p r o p y lp D 一1 T h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ) i n d u c t i o n ，w i t h6 0M W o fV P Ip r o t e i na n d7 3M Wo f c o e x p r e s s e dp r o t e i n T h e s e r u mI g Go fm i c ep o s t i n o c u l a t e db yV P1a n dM u l F N T V P1a r e1

42、：3 2 0 0 0a n d1 ：12 8 0 0 0 C o n c l u s i o n sV P lh a dg o o da n t i g e n i c i t yw h i c hc o u l ds t i m u l a t e dh u m o r a li m m u n er e s p o n s ei ni n o c u l a t e dm i c e ，t h ed e t e c t e ds e r u mI g Go fM u I F N - T V P li n o c u l a t i o ni Sh i g h e rt h a nV P l

43、 M o r e o v e r i m n l u n e e n h a n c i n ge f f e c t sw a sf o u n di nm i c ei n o c u l a t e dw i t hC O e x p r e s s e dM u l F N y N P l - , M u l F N 一丫w a sa s a t i s f a c t o r yi m m u n ea d j u v a n t K e yw o r d s 】M u l F N 一丫E M C VV P l ；P r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ；I m m u n ea d j u v a n t 万方数据