定量分析铜绿假单胞菌第一类整合酶基因的表达.pdf

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1、中国抗生素杂志2 0 0 6 年3 月第3 1 卷第3 期 1 4 9 文章编号: 1 0 0 1 - 8 6 8 9 ( 2 0 0 6 ) 0 3 - 0 1 4 9 - 0 5 定量分析铜绿假单胞菌第一类整合酶基因的表达 杨维青 ,3 石磊2 谢铁 苏建裕2 李心晖2 寇亚丽2 程曦 曾 蔚 贾 文祥 。 ( 1四 川大学华西基础医学与法医学院， 成都6 1 0 0 4 1 ; 2华南 理工大学轻工与食品工程学院， 广州5 1 0 6 4 0 ; 3河北医科大学墓础医学院，石家庄0 5 0 0 1 7 ) 摘要:目的 整合子是具有整合和表达外来耐药性基因盒能力的基因元件， 在细菌耐药性基

2、因的积累和传递中起重要作用。 本 研究通过定量分析第一类整合子整合酶基因( i n t I l ) 在细菌不同生存状态的表达水平， 探讨整合子的作用机制。方法培养和提取 两株第一类整合子阳性铜绿假单胞菌的液相培养菌、 生物被膜菌、 被膜脱落菌等三种生长状态的总R N A ， 采用竞争R T - P C R 方法定 量检测菌体在以上三种状态下 i n t l l m R N A的表达水平。结果铜绿假单胞菌的液相培养菌、 生物被膜菌和被膜脱落菌都有 i n t l l m R N A表达; 两株菌在三种状态下i n t l l m R N A的表达量不同， 其中生物被膜菌表达最高， 被膜脱落菌次之

3、， 液相培养菌最低; 生物被 膜菌 i r a l l m R N A的量较液相培养物高约 1 5 倍， 较被膜脱落菌高约4 倍。结论铜绿假单胞菌 i n tl l 在生物被膜中m R N A表达上 调， 随着菌体从被膜脱落以及菌体持续的液相培养 i n t I l 表达下调。 提示整合子在生物被膜菌中可进行活跃的基因盒的捕获、 移动和 积累， 有利于细菌耐药性的提高及扩散。 关键词: 铜绿假单胞菌; 生物被膜; 整合子; 整合酶; 竞争R T 一 P C R 中图分类号:R 3 8 7 . 9 9 1文献标识码:A Qu a n t i f i c a t i o n o f c l a s

4、 s 1 i n t e g r a s e g e n e o f P s e u d o mo n a s a e r u g z n o s a i n d i f f e r e n t e x p r e s s i o n c o n d i t i o n s Y a n g W e i - c l i n g “，S h i L e i 2 ，X i e Y i ， Z e n g We i S u J i a n - y u 2 ，L i X i n - h u i 2 ， K o u Y a - l i 2 , C h e n g X i ，a n d J i a We n

5、 - X i a n g ( 1 W e s t C h i n a S c h o o l o f P re c l i n i c a l a n d F o r e n s i c M e d i c i n e , S i c h u a n U n i v e r s i t y ， C h e n g d u 6 1 0 0 4 1 ; 2 S o u t h C h i n a U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y , G u a n g z h o u 5 1 0 6 4 0 ; 3 H

6、e b e i U n i v e r s i t y o f M e d i c a l S c ie n c e s , S h ij ia z h u a n g 0 5 0 0 1 7 ) A B S T R A C T O b j e c t i v e I n t e g r o n s p l a y e d i m p o rt a n t r o l e s i n t h e s p r e a d o f a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e a n d m u l t i d r u g r e s i s t a n c e

7、. I n o r d e r t o s t u d y t h e m e c h a n i s m o f i n t e g r o n a c t i o n , P . a e r u g i n o s a s t r a i n s c a r r y i n g c l a s s 1 i n t e g ro n , w e r e m e a s u r e d f o r t h e e x p r e s s i o n o f c l a s s 1 i n t e g r a s e g e n e ( i n t l l ) m R N A i n d i f

8、 f e r e n t c o n d i t i o n s r e s p e c t i v e l y . Me t h o d s A c o m p e t i t i v e r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n - P C R ( c R T - P C R ) m e t h o d w a s d e s i g n e d t o q u a n t i f y c l a s s 1 i n t e g r a s e m R N A p r o d u c t i o n i n p l a n k t o n i c c

9、u l t u r e d c e l l s , b i o f i l m c e l l s a n d a m o t i c c e l l s f r o m t h e b i o f i l m o f t w o c l i n i c a l s t r a i n s o f P . a e r u g i n o s a r e s p e c t i v e l y . R e s u l t s T w o c l i n i c a l s t r a i n s o f P . a e r u g i n o s a p r o d u c e d i n t

10、I l m R N A i n t h e t h r e e d i f f e r e n t c o n d i t i o n s o n d i f f e r e n t l e v e l s , i n w h i c h t h e q u a n t i t i e s o f t h e m R N A e x p r e s s e d b y t h e i r b i o f i l m s w e r e a b o u t 4 t i m e s h i g h e r t h a n t h e i r a m o t i c c e l l s f r o

11、m b i o f i l m a n d a b o u t 1 5 t i m e s h i g h e r t h a n t h e i r p l a n k t o n i c c e l l s . C o n c l u s i o n I n P . a e r u g i n o s a b i o f i l m , t h e i n t e g r a s e g e n e w a s u p - r e g u l a t e d a t m R N A l e v e l . A n d t h e h i g h e r l e v e l o f i n

12、t e g r a s e m a y b e c o n d u c e t o c a p t u r e a n d a c c u m u l a t e g e n e c a s s e t t e s f o r b a c t e r i a i n b i o f i l m , w h i c h m a y b e o n e o f t h e r e a s o n s f o r t h e s p r e a d o f a n t i b i o t i c r e s i s - t a n c e a n d t h e f o r m a t i o n

13、o f m u l t i d r u g r e s i s t a n c e . K E Y WO R D S P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ;B i o f i l m ;I n t e g r o n ; I n t e g r a s e ;C o m p e t i t i v e R T - P C R 收稿日期: 2 0 0 5 - 0 7 - 0 6修回日期: 2 0 0 5 - 0 9 - 1 2 基金项目: 国家自 然科学基金( 3 0 3 7 0 0 7 9 ) ， 纽约中华医学墓金会( C M B , N o .

14、 8 2 - 4 2 1 ) ， 广东省自 然科学基金项目( 0 4 0 2 0 0 5 0 ) 及河北省医学科学研究重点课题计划项目( 0 5 0 8 6 ) 0 作者简介: 杨维青， 女， 生于1 9 6 3 年， 在读博士研究生。 研究方向: 抗感染及细菌耐药性研究。 通讯作者， E - m a i l : j i a w e n x i a n g s in a . c o m 定量分析铜绿假单胞菌第一类整合酶基因的表达杨维青等 随着抗生素在临床抗感染治疗上的广泛使用， 细 菌耐药性问 题日 益 严重。 整合子( i n t e g r o n ) 系 统具有 捕 获和表达外来耐药基因

15、盒的能力， 细菌可以通过该系 统中的整合酶基因( i n t l ) 编 码的 整合酶( i n t e g r a s e ) 不 断地从周围环境中捕获和积累耐药基因盒， 在微生物 基因组中形成巨大的多重耐药基因座。 细菌在自然界可以浮游状态和生物被膜形式存 在， 关于整合子系统整合酶基因在细菌不同生长状态 的表达目 前未见报道。 本研究就本实验室已鉴定的第 一类整合子阳性的铜绿假单胞菌进行研究， 用竞争 R T 一 P C R 方法定量检测该菌的液相培养菌、 生物被膜 菌和被膜脱落菌三种生长状态下第一类整合酶基因 ( i n x l l ) m R N A表达的水平， 探讨在整合子的作用机

16、制。 1 材料和方法 1 . 1 菌株 两株临床分离铜绿假单胞菌( P A 1 , P A 2 ) ， 已鉴定 携带第一类整合子( 由 华南理工大学提供) 。 1 . 2 铜绿假单胞菌的浮游菌和生物被膜的培养 1 . 2 . 1 铜绿假单胞菌的液相培养将 P A 1 和P A 2 分别接种于3 m l L B 培养基中过夜培养， 将液相培养菌 离心洗涤备用。 1 . 2 . 2 铜绿假单胞菌生物被膜培养取上述过夜培 养的 菌 液 接 种于6 孔 平 底组 织 培 养 板中 ( 每 孔1 0 0 闪 ， 且已含2 . 5 m 1 1 : 5 0稀释的L B 培养基) , 3 7 静止培 养4 8

17、 h ， 换液; 当培养7 2 h 时， 用生理盐水冲洗， 收集被 膜脱落菌; 然后用刮刀刮取生物被膜， 将收集的被膜 菌在漩涡振荡器上将菌体打散， 洗涤。 1 . 3铜绿假单胞菌总R N A的提取 分别取菌株P A 1 和P A 2 的生物被膜菌、 被膜脱落 菌和液相培养菌1 0 7 C F U ， 使用R N A f a s t 2 0 0 R N A提取 试剂盒( 上海飞捷公司产品) 提取菌体总R N A 。 用紫外 分光光度计测提取液在2 6 0 和2 8 0 n m吸光度， 确定 R N A的纯度和浓度。 将A 2 6 o / A z s 。 比 值在 1 . 8 左右的样 本调整为

18、5 0 n g / 闪， 一 8 0 保存备用。 1 . 4 竞争体R N A ( c R N A ) 的构建和制备 首先制备竞争体D N A ( c D N A ) ， 再以c D N A为模 板在体外进行转录合成c R N A O 1 . 4 . 1 引物设计遵循竞争R T - P C R定量m R N A的 原则， 与待测模板m R N A竞争的竞争体R N A ( c R N A ) 应与待测模板的引物结合区的序列应完全一样， 序列 基本一致， 两者扩增的产物大小差别不大， 以 保证待测 模板和c R N A与引物的结合达到“ 公平竞争” ， 扩增 效率基本相同。 同时考虑c R N

19、A需由c D N A在体外转 录而成， 故设计制备 c D N A的引物包含 T 7 启动子: c i n t l - U ( T 7 + i n t l l - U ) : 5 - G C G T A A T A C G A C T C A C T A T - A G G g t t c g g t c a a g g t t c t g - 3 ; c i n t l - D ( i n t l l - D + i n t l l - D 2 ) : 5 - g c c a a c t t t c a g c a c a t g T T C G T G A T G C C T G C TT

20、G T T C - 3 ( T a b . 1 , F i g . 1 ) 。 1 . 4 . 2 c D N A模板的制备将菌株P A 1 ( 或P A 2 ) 接 种在3 m 1 L B培养基中过夜培养; 取菌液5 0 u 1 , 悬浮于 4 5 0 闪双蒸水中， 在沸水中煮l 0 m i n 后， 立即在冰中 冷 却， 稍后 1 0 0 0 0 r / m i n 离心2 m i n ， 上清液为粗提D N A . 以粗提D N A为模板， 以 c i n t l l - U和 c i n t l l - D为引物进 行P C R制备c D N A . 5 0 0反应体系的组成是: 1

21、0 x P C R 缓冲液5 W 1 , d N T P 4 w 1 ， 引物各3 w 1 , D N A模板4 p ,1 , 0 . 2 5 1A T a q D N A聚合酶( 5 U / 闪 ) ， 无菌去离子水 3 0 . 7 5 W 1 . P C R条件: 9 4 裂解5 m i n ; 每个循环为9 4 9 0 0 . 5 m i n , 5 0 9 C 0 . 5 m i n , 7 2 9 C l m i n , 3 0个循环; 最后 7 2 延伸7 m i n . P C R产物在1 . 5 %的琼脂糖凝胶上电 泳， 凝胶经 E B染色后用凝胶成像系统照像， 若有 8 2

22、2 b p的产物生成， 则为 。 D N A 。 将 P C R产物用 T a K a R a * D N A F r a g m e n t P u r i f i c a t i o n K i t V e r . 2 . 0 提纯备 用。 1 . 4 . 3 c R N A模板的制备以纯化的c D N A为模板 在体外转录合成c R N A . 2 0 时反应体系含有1 0 x T 7 R N A聚 合酶缓冲液2 t,1 , D T T ( 5 0 m m o 1 / L ) 2 ,1 , N T P 混 合物( 2 . 5 m m o 1 / L ) 4 w 1 , R N a s e

23、 抑制剂( 4 0 U / L I ) O . 5 w 1 , 纯化的c D N A 5 w 1 , T 7 R N A聚合酶 2 p 1 , D E P C水 Ta b . 1 T h e p r i m e r s u s e d f o r q u a n t i f i c a t i o n o f i n l I l m R N A a n d c o n s t r u c t i o n o f c R N A a n d t h e i r p r o d u c t i o n s P r i me r T a r g e t ma l l - U i n t l l -

24、D c i n t l - ( T 7 +h u l l - U ) c i n t l - D ( i n t l l - D+m i l l - D 2 ) i n t l l - U i n t l l - D 5 一 g tt c g g t c a a g g t t c t g - 3 5 一 g c c a a c t t t c a g c a c a t g - 3 5 - G C G T A A T A C G A C T C A C T A T A G G g tt c g g tc a a g g tt c t g - 3 5 - g c c a a c t t t c

25、 a g c a c a t g T T C G T G A T G C C T G C T T G T T C - 3 5 一 g t t c g g t c a a g g t t c t g - 3 - 5 一 g c c a a c t t t c a g c a c a t g - 3 h u l l ( D N A a n d m R N A ) 9 2 3 b p h u l l e RNA 8 2 2 帅 ( c D N A ) 8 0 0 b p 中国抗生素杂志2 0 0 6 年3 月第3 1 卷第3 期.1 5 1. i n i l I 一 D i nt l l - D t

26、 o t a l DNA 县 P C R T 7 h a ul - t )D2 i n t l l - D i n i l l - UD2 i n d l - D T R 日只 F i g . 1 S c h e m a t i c p r o c e d u r e o f p r e p a r a t i o n f o r c R N A 4 . 5 闪( T a K a R a 生物工程公司) 。 转录条件是: 3 7 9 C 5 0 9 0 1 5 m i n , 9 4 9 0 2 m i n ; 再链接到 i n t l l 扩增循环条 4 5 m i n 。 转录反应结束后在

27、体系中加人 10U的D N a s e件: 裂解温度9 4 C 5 m i n ; 每个循环为9 4 9 C 0 . 5 m i n , ( 无R N a s e ) 消化体系中的D N A , 3 7 反应 l 0 m i n ; 加5 0 % 0 . 5 m i n , 7 2 9 C 1 . 5 m i n , 3 0 个循环; 最后延伸7 2 9 C 人3 0 闪D E P C 水及等量的苯酚， 氯仿: 异戊醇( 2 5 : 2 4 : 7 m in o R T - P C R产物在1 . 5 %的琼脂糖凝胶上电泳， 凝 1 ) ， 充 分混 匀; 1 5 0 0 0 r / m in

28、 离心5 m in ， 取 上 层 移 至 另 一胶经E B 染色 后在凝 胶成像系 统下 照像， 比 较条 带的 支1 . 5 m l 的离心管中， 加人5 0 闪氯仿: 异戊醇( 2 4 : 1 ) ，灰度。 若两条产物带的灰度比 值接近1 ， 那么c R N A的 充分混匀; 1 5 0 0 0 r / m i n 离心5 m i n ， 取上层液移至另一初始浓度接近于待测样本中目 的R N A 浓度; 进一步将 离心管中; 加人5 w l 的3 m o l / L N a O A c ( p H 5 . 2 ) 和此点的c R N A 浓度向 左或右进行稀释( 稀释梯度缩 1 2 5

29、闪的冷无水乙醇, - 2 0 放置3 0 - 6 0 m i n ; 离心回小) ， 进行新一轮的c R T - P C R ， 最终找到竞争产物和目 收沉淀， 用7 0 %的冷乙醇清洗沉淀， 真空干燥后加人的产物的条带灰度相等的点， 此点c R N A初始浓度与 2 0 闪的D E P C 水， 即 得到由c D N A 转录合成的c R N A 。样本目 的R N A的初始浓度相同， 从而检测出各样本 1 . 4 . 4 c R N A验证和浓度测定以上述制备的i n t I l m R N A的表达量。 c R N A为模板， i n t l l - U和 i n t 7 1 - D为引

30、物使用R e a d y - 2 结果 T o - G o R T - P C R B e a d s ( A m e r s h a m B i o s c i e n c e s U K L i m - 2 . 1 铜绿假单胞菌总R N A的提取 i t e d 产品) 。 进行R T - P C R , 2 5 闪反应体系中分别含有 分别提取菌株P A 1 0 和P A 3 9 的 生物 被膜菌、 被膜 i n t l l - U和i n t l l - D引物各1 闪， C R N A 1 闪 。 其反应条件脱落菌和液相培养菌总R N A ， 用紫外分光光度计测提 是: 5 0 9 0

31、 1 5 m i n , 9 4 9 C 2 m i n ; 再链接到 i a t l l 扩增循环取液在2 6 0 n m及2 8 0 n m吸光度， 其A z s o / A a so 比值在 条件: 裂解温度9 4 9 0 5 m i n ; 每个循环为9 4 9 C 0 . 5 m i n , 1 . 7 一 1 . 8 左右， 将提取液R N A 浓度 调整为5 0 n g / w 1 o 5 0 9 0 0 . 5 m i n , 7 2 9 C 1 . 5 m i n , 3 0 个循环; 最后延伸7 2 9 0 2 . 2 竞争体R N A的 验证 7 m i n o R T

32、- P C R 产物在 1 . 5 %的琼脂糖凝胶上电泳， 凝以所制备的c R N A为模板进行R T - P C R ， 结果有 胶经E B 染色后在凝胶成像系统下照像。 若有8 0 0 b p 8 0 0 b p 的 产物生成， 与预期结果一致( F i g . 2 ) ， 说明 所 的条带产生， 说明制备的c R N A可作为模板与菌体制备的c R N A可作为竞争体R N A即内标物用于c R T - i ru I l 的m R N A 进行c R T - P C R 。 在紫外分光光度计上测P C R 。 经检测c R N A的浓度为1 7 6 n g / 闪， A 2 6 Q /

33、A 2 8 。 比 定。 R N A的浓度和纯度， 一 8 0 保存备用。值为 1 . 8 8 ， 纯度较高。 1 . 5 竞争R T - P C R定量分析P A菌株 i n t I l 的m R N A 2 . 3 铜绿假单胞菌浮游菌和生物被膜菌及被膜脱落 表达菌 i n t I l 的m R N A表达水平的定量分析 首先将竞争模板c R N A原液 1 0 倍系列稀释， 然后分别将P A 1 和P A 2 的液相培养菌、 生物被膜菌和 使用R e a d y - T o - G O T R T - P C R B e a d s 将待测 样品 与已 知被膜脱落菌的 总R N A 与 一

34、定浓度的c R N A同 时 进行 浓度的c R N A进行。 R T - P C R o 6 个2 5 闪反应体系中 分R T - P C R ， 即c R T - P C R ， 产物经凝胶电泳分析， 竞争产 别含有 i n t l l - U和 i n t I l - D引物各 1 闪， 待测菌株总物和目 的 产物条带的灰度相等者， 表明 两者初始的 R N A 1 闪及不同浓度的c R N A 1 闪。 其反应条件是:目标R N A含量相同， 即以c R N A的量确定待检菌株 1 5 2 定量分析铜绿假单胞菌第一类整合酶基因的表达杨维青等 较被膜脱落菌高4 倍以 上( T a b .

35、 2 ) 。 3 讨论 整合子系统介导的细菌耐药机制正越来越引起研 究者们的关注， 整合子可以通过该系统中的整合酶基 因编码的整合酶不断地从周围环境中捕获和积累耐药 基因盒， 还可存在于质粒、 转座子等可移动基因元件 上， 在同种或不同种属的细菌之间进行基因的水平转 移 1 . 2 1 ， 是细菌多重耐药性形成和扩散的重要原因之 L a n e 1 : n e g a t i v e c o n t r o l ; L a n e 2 : R T - P C R p r o d u c t s o f c R N A ; L a n e M : 4 0 0 0 b p D N A M a r

36、k e r F i g . 2 A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f R T - P C R p r o d u c t s o f c R N A i n t I l m R N A的量( F i g . 3 ) 。 经检测两株铜绿假单胞菌 i n d l 在三种状态下 i n d l 都有 m R N A表达， 但两菌在 三种状态下 i n d l m R N A的表达量不同， 其中生物被 膜菌表达最高， 被膜脱落菌次之， 液相培养物最低; 生 物被膜菌 i n t l l m R N A的量较液相培养物高约 1 5 倍

37、， 细菌在自 然界除了浮游生长于液体中， 还可豁附 于固相物体如河床、 机体勃膜或生物医学材料表面， 分 泌多糖基质将菌体克隆聚集缠绕其中形成生物被膜， 被膜中的菌体也可从被膜中脱落而游离于液相中。 当 细菌密度达到一定程度时， 细菌自 身产生的信号即可 达到基因激活所需要的浓度， 调整基因的表达 13 1 0 W h i t e l e y 等【 1 4 1 对铜绿假单胞菌P A 0 1 研究时发现， 与 A : Q u a n t i t a t i o n o f P A l i n t I l e x p r e s s i o n b y c R T - P C R i n b i

38、o fi l m c e l l s . L a n e l 一 7 : t h e c R N A c o n c e n t r a t i o n w e r e 2 . 1 7 5 2 , 2 . 0 3 0 1 , 1 . 8 9 4 7 , 1 . 7 6 8 3 , 1 . 6 5 0 1 , 1 . 5 4 0 4 a n d 1 . 4 6 7 8 n g / p .l . L a n e M : 4 0 0 0 6 p D N A M a r k e r ; B : Q u a n t i t a t io n o f P A 1 i a t I I e x p r e s

39、 s i o n场 c R T - P C R i n p l a n c t o n i c c e l l s . L a n e - 7 : t h e c R N A c o n c e n t r a t io n w e r e 0 . 1 6 5 2 , 0 . 1 5 4 2 , 0 . 1 4 3 9 , 0 . 1 3 4 3 , 0 . 1 2 5 4 , 0 . 1 1 7 0 a n d 0 . 1 0 9 2 n g / w l . L a n e M : 4 0 0 0 6 p D N A M a r k e r ; C : Q u a n t i t a t i

40、 o n o f P A 1 i n t I l e x p r e s s i o n勿 c R T - P C R i n a m o t i c c e l l s . L a n e l 一 7 : t h e c R N A c o n c e n t r a t i o n w e r e 1 . 3 7 4 5 , 1 . 0 9 9 6 , 0 . 8 7 9 7 , 0 . 7 0 3 8 , 0 . 5 6 3 0 , 0 . 4 5 0 4 , 0 . 3 6 0 3 . L a n e M : 4 0 0 0 6 p D N A M a r k e r ; D : Q

41、u a n t i t a t i o n o f P A 2 i n t 1 1 e x p re s s i o n b y c R T - P C R i n b i o f i l m . L a n e l 一 7 : t h e c R N A c o n c e n t r a t i o n w e re 2 . 1 7 5 , 2 . 0 3 0 , 1 . 8 9 4 , 1 . 7 6 8 3 , 1 . 6 5 0 , 1 . 5 4 0 4 a n d 1 . 4 6 7 8 n g / w l . L a n e M : 4 0 0 0 6 p D N A M a

42、r k e r ; E : Q u a n t i t a t i o n o f P A 2 i n t I l e x p r e s s i o n b y c R T - P C R i n t h e a q u e o u s p h a s e . L a n e 一 7 : t h e c R N A c o n c e n t r a t io n w e r e 0 . 1 4 3 9 , 0 . 1 3 4 3 , 0 . 1 2 5 4 , 0 . 1 1 7 0 , 0 . 1 0 9 2 , 0 . 1 0 1 9 a n d 0 . 0 9 5 2 n g / p

43、 l ; F : Q u a n t i t a t i o n o f P A 2 i r a I l e x p r e s s i o n b y c R T - P C R i n a m o t i c c e l l s . L a n e l 一 7 : t h e c R N A c o n c e n t r a t io n w e r e 0 . 8 7 9 7 , 0 . 7 0 3 8 , 0 . 5 6 3 0 , 0 . 4 5 0 4 , 0 . 3 6 0 3 . 0 . 2 8 8 2 , 0 . 2 3 0 6 . L a n e M : 4 0 0 0

44、6 p D N A M a r k e r F i g . 3 A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s f o r t h e q u a n t i t a t i o n o f P . a e r u g i n o s a i n I I I e x p r e s s i o n b y c R T - P C R w i t h c R N A 中国抗生素杂志2 0 0 6 年3 月第3 1 卷第3 期1 5 3. Ta b . 2 Q u a n t i t a t i o n o f I n t 7 1 m R N A

45、 u n d e r d i ff e r e n t c o n d i t i o n s C e l l s u n d e r d i ff e r e n t c o n d i t i o n s i n t l l m R N A ( n g / 闪)i n t / 1 m R N A / t o ta l R N A ( n g / m g ) P l a n k t o n i c c e ll s B i o f i l n t c e l l s Amo t i c c e l l s 0 . 1 2 5 4 1 . 8 9 4 7 0 . 45 0 4 0 . 1 0

46、1 9 1 . 7 6 8 3 0 . 3 6 0 3 2 . 5 0 8 x 1 0 3 . 7 8 9 x 1 0 -2 9 . 0 0 8 x 1 0 2 . 0 3 8 x 1 0 3 . 5 3 7 x 1 0 2 7 . 2 0 6 x 1 0 浮游于液相中的菌体比， 生物被膜中菌体约有 1 %的 基因表达水平不同， 其中约0 . 5 % 的基因表达上调， 约0 . 5 % 的基因表达下调。 本研究采用竞争 R T - P C R 技术定量分析了两株携带第一类整合子的铜绿假单 胞菌的整合酶基因在其液相培养菌、 生物被膜菌和被 膜脱落菌， 三种不同的存在状态下一类整合酶基因 m R

47、N A的表达水平。 结果两株铜绿假单菌的生物被膜、 被膜脱落菌和液相培养菌三种生长状态都检测到整 合酶基因m R N A的表达。 其中生物被膜菌整合酶基因 m R N A的表达水平最高， 较液相培养菌高约 1 5 倍; 较 被膜脱落菌高约4 倍。 本实验结果提示整合子在生物 被膜菌中可进行更活跃的基因盒捕获和重组; 随着菌 体从被膜中脱落， 及长期浮游生长， 其整合酶基因的 表达下降。 L a u r a 等6 . 9 . 10 1 研究观察到生物被膜中菌体 间质粒的传递率较其在液相即浮游状态显著提高。 整 合子也可存在于质粒， 接合是基因水平传递最常见的 方式， 所以当细菌以生物被膜存在时，

48、 在整合子介导 下细菌可捕获和积累获得更多的外源基因， 同时这些 新的基因盒组合又可在细菌间发生频繁的传递， 从而 使细菌获得新的遗传物质和耐药性， 同时也使新的耐 药性在细菌间扩散。 整合子中的基因盒大多编码适应 功能蛋白， 很少编码细菌生命活动所必需的功能蛋 白， 这种古老的结构长期指导宿主基因的进化。 参考文献 1 H a ll R M , C o ll i s C M . M o b i l e g e n e c a s s e t t e s a n d i n t e g r o n s : c a p t u r e a n d s p r e a d o f g e n e

49、s b y s i t e - s p e c i f i c r e c o m b i n a t i o n j . M o l M i c r o b i o l , 1 9 9 5 , 1 5 : 5 9 3 2 1 R o w e - M a g n u s D A , G u e r o u t A M , M a z e l D . B a c t e r ia l r e s i s - t a n c e e v o l u t i o n b y re c r u i t m e n t o f s u p e r - i n t e g r o n g e n e c a s s e t t e s J . M o l Mi c r o b i o l , 2 0 0 2 , 4 3 : 1 6 5 7 3 P a t z e r J , T o l e m a n M A , D e s h p a n d e L M , e t a l . P s e u d o m o n a s a e r u