干细胞诱导形成软骨细胞研究进展.pdf

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1、国 际 生 物医 学I 程杂 志2 0 0 6 年6 月 第2 9 卷 第3 期 I n t J B io m e d E n g , J u n e 2 0 0 6 , V o l . 2 9 , N o .3 综 述 干细胞诱导形成软骨细胞研究进展 谢峰张文杰曹谊林 摘要 组织工程技术构建软骨需要大量的软骨细胞， 成熟的软骨细胞扩增能力有限， 难以满足组 织构建需要。干细胞， 包括胚胎干细胞、 成体干细胞， 均具有强大的自 我更新能力及多向分化潜能。在适 当的诱导条件下， 这些干细胞均可被诱导分化为软骨细胞， 从而满足组织工程需求。 【 关扭词I 胚胎干细胞;骨髓基质干细胞; 脂肪干细胞;

2、 软骨细胞; 分化 中圈分类号: R 3 1 8 ; Q 8 1 3 . 1文献标识码: A文章编号: 1 6 7 3 - 4 1 8 1 ( 2 0 0 6 ) 0 3 - 0 1 3 8 - 0 4 P r o g r e s s o f s t u d i e s o n c h o n d r o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o n f r o m s t e m c e ll s X I E F e n g , Z H A N G W e n 一 ie ， C A 0 Y i - l i n D e p a r t m e n t of P

3、 l a s t ic a n d R e c o n s t r u c t iv e S u r g e r y ，T h e N i n t h P e o p l e H o s p i t a l of S h a n g h a i S e c o n d M e d ic a l U n iv e r s i t y ， S h a n 动a i T i s s u e E n g i n e e r i n g D e v e 娜m e n t a n d R e s e a r c h C e n t e r ， S h a n 动a i 2 0 0 0 1 1 ， C h

4、i n a ( A b s t r a c t L a r g e q u a n t i t y o f c h o n d r o c y t e s i s r e q u ir e d f o r c a rt i l a g e t i s s u e e n g in e e r in g . M a t u r e d c h o n d r o - c y t e s a r e n o t s u i t a b l e f o r t i s s u e - e n g i n e e r i n g d u e t o t h e i r l i m i t e d p

5、r o l i f e r a t i n g p o t e n t i a l . S t e m c e l l s , i n c l u d i n g e m - b ry o n i c s t e m c e l l a n d a d u l t s t e m c e ll , h a v e s t r o n g p o t e n t i a l f o r s e l f - r e n e w i n g a n d m u l t i - l i n e a g e d i ff e r e n t i a t i o n . T h e y c a n b e

6、 d i ff e re n t i a t e d i n t o c h o n d r o c y t e s w h e n c u l t i v a t e d i n t h e p r e s e n c e o f p ro p e r i n d u c e r s , t h e r e f o r e , m e e t t h e d e m a n d o f c a rt i l a g e t i s s u e - e n g i n e e r i n g . ( K e y w o r d s I e m b ry o n ic s t e m c e l

7、l ;b o n e m a r r o w s tr o m a l c e lls ;a d i p o s e - d e r iv e d s te m c e ll ;c h o n d r o c y t e ; d i ff e r e n t i a t i o n 应用组织工程技术体内外构建组织工程化软 骨已完全可能， 特别是C a o 等【1l应用该技术构建人 耳模型的成功， 更显示出软骨组织工程的广阔应用 前景。然而， 将组织工程技术真正应用于临床软骨 缺损的修复尚有不少难题需要克服。 如何获得足够 数量的软骨细胞便是SIR 待解决的问题之一。 与所有组织构建相同， 软骨

8、组织构建的首要条 件是能获得足够量的种子细胞。 软骨组织工程的最 初设想是通过切取一小块自 体软骨组织， 经体外培 养扩增后获得足够量的种子细胞， 再与可降解生物 材料复合后，构建具有一定形态和功能的软骨组 织。但多年来的研究发现， 成熟的软骨细胞扩增能 力有限， 随着传代次数的增加， 细胞逐渐老化而丧 失增殖能力， 难以满足组织构建需要。干细胞研究 的发展为解决这一难题提供了可能。 干细胞按照来 源可分为胚胎干细胞和成体干细胞， 两者均具有强 大的自 我更新能力及多向分化潜能。 理论上只要将 干细胞进行体外大量扩增后， 进一步向软骨细胞诱 导分化， 便可以得到足够的软骨细胞， 满足软骨组 织

9、工程需求。因此， 干细胞已成为目 前组织工程研 基金项目: 国家重点基础研究发展计划( 9 7 3 计划) 基金资助项 目( 2 0 0 5 C B 5 2 2 7 0 5 ) 作者单位: 2 0 0 0 1 1上海第二医科大学附属第九人民医院整形 外 科 上海市组织工程研究与开发中心 究的热点。 1 软骨的发育过程 无论对胚胎干细胞或成体干细胞， 如何诱导干 细胞向特定细胞分化是目 前的难点。 若要诱导干细 胞向软骨方向分化，首先需要了解软骨的发育过 程， 了解每一步分化的机理及调控因素， 这样才能 在探索干细胞诱导方案时做到有的放矢。 软骨细胞 来源于胚胎时期的两种中胚层细胞: 轴旁中胚层

10、细 胞和侧中胚层细胞。 轴旁中 胚层发育为体节， 后者进 一步分化为生肌节( m y o t o m e ) 和生骨节( s c l e r o t o m e ) o 生骨节经过软骨阶段， 最终分化为中轴骨和肋骨。 侧中胚层的一部分发育为肢芽， 进一步经过软骨阶 段发育为附属骨。 从未分化的间充质细胞到软骨细 胞要经历多个步骤:首先是软骨前体细胞的聚集。 具有软骨分化潜能的间充质细胞， 在特定的区域发 生聚集并且开始分化为软骨细胞。 软骨细胞分泌基 质并且把自己包围其中。聚集区周边的细胞分化程 度较低， 形成一层梭形细胞膜性结构， 以后发育为 软骨膜， 包绕软骨原基。在软骨形成的过程当中，

11、间 充质细胞首先分化为表达I I 型胶原( Col-II) 的软骨 细胞， 然后进一步分化为肥大的软骨细胞( h y p e r - t r o p h i c c h o n d r o c y t e s ) ， 后者表 达X 型 胶 原。 肥 大的 软 骨细胞再通过一系列进程发育演化为骨细胞。 研究 国际生物医 学工程杂志2 0 0 6 年6 月第2 9 卷第3 期 I n t J B io m e d E n g , J u n e 2 0 0 6 , V o l . 2 9 , N o .31 3 9 证实， 有些细胞因子在软骨的分化中起着重要的作 用。 例如: 研究中 发现转化生长

12、因 子例t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b e t a , T G F - (3 ) 1 , 3 可以 促使原始间充质 细胞的聚集，并促进原始的间充质细胞向软骨分 化， 还能抑制软骨细胞的 成熟及老化2 1。 除了T G F - (3 以 外， 骨形态形成蛋白( b o n e m o r p h o g e n e t i c p r o t e i n , B M P ) 2 , 4 在软骨的形成过程中亦有非常重要的作 用。 B M P - 2 , 4 在软骨形成早期能促进原始间充质细 胞的聚集， 促进软骨细胞的增殖和成熟，

13、维持软骨 细胞的表型等。同T G F - p 相似， B M P - 2 , 4 可以抑制 软骨细胞的 过度分化( h y p e rt r o p h y ) 31。另外， 软骨与 骨的发育过程中不同胚层细胞间的相互作用也有 很大关系。例如在颅面骨和肢芽的发育过程中， 上 皮一 间充质间的相互作用是非常关键的4 1 ， 中轴骨的 形成是生骨节和脊索相互作用的结果阎 ， 而成纤维 细 胞生长因 子2 ( f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r 2 , F G F - 2 ) , S o n ic h e d g e h o g 和W n t -

14、7 a 在这些过程中 起了重要的 作用。 有几个转录因子被认为在软骨形成过程中起 重要作用。S c l e r a x i s 是一种b a s i c - h e l i x - l o o p - h e l i x 蛋 白， 在软骨发生的早期表达。在小鼠胚胎发育的过 程中，部分间充质细胞聚集并最终发育为软骨细 胞， 这些间充质细胞高表达S c l e r a x i s ， 其主要作用被 认为可以激活一些软骨特异性基因， 比 如c o l - 1 1 等19 1, S o x - 9 是一种h i g h - m o b i li ty - g r o u p b o x 蛋白。1 9

15、9 5 年， W r i g h t 等19 1报道， 发现其与软骨发生发育密切相关。 在胚胎发育过程中， 软骨前体细胞以及软骨细胞都 表达S o x - 9 。 在S o x - 9 基因突变引起功能缺陷的小鼠 中， 会导致骨骼发育不良， 而异位S o x - 9 的表达可以 使非软骨组织表达c o l - 1 1 e , t0 1 ， 可见S o x - 9 在软骨的 发生发育中 起关键作用。 因 此， S o x - 9 通常也被用做 检测软骨分化的重要标志。 2 千细胞向软骨分化 目 前体外证实具有软骨分化潜能的干细胞包 括: 胚胎间充质来源的干细胞系I 火 胚胎干细胞 ( e m b

16、 ry o n ic s t e m c e l l s , E S ) ; 骨髓基质干细胞( b o n e m a r r o w s t r o m a l c e l l s , B M S C s ) ; 脂肪干细胞( a d i - p o s e -d e r iv e d s te m c e l ls , A D S C s ) 。 关 于 第 一 种 细 胞， 它是一种从小鼠胚胎中分离的具有多向分化潜能 的间充质干细胞， 相关报道不多。下面主要介绍后 三种干细胞的 软骨诱导分化。 2 . 1 胚胎干细胞 关于E S 细胞诱导分化的研究很多，主要集中 于向神经、 血液和血管内

17、皮等细胞的分化， 而向软 骨细胞分化的研究相对较少，大都使用小鼠的E S 细胞为研究对象。 K r a m e 等1睬用类胚体( e m b ry o i d b o d y , E B ) 贴壁法， 诱导E S 细胞向 软骨细 胞分化。 他 们先将E S 细胞体外悬浮培养5 d 形成类胚体， 其中 包含有三个胚层的原始细胞。然后将第5 天类胚体 贴壁培养4 周， 最终可以检测到软骨细胞。研究证 实， 在含有胎牛血清( f e t a l c a l f s e r u m , F C S ) 的培养液 中， E S 细胞就能自 发分化为软骨细胞，而不需要添 加特殊的生长因子; 当在培养液中添

18、加了B M P - 2 或 B M P - 4 以 后， 可以明 显增加软骨细 胞形 成的 量。 该实 验中， E S 细胞向软骨分化的过程再现了软骨发育的 一系列过程。 首先类胚体形成过程模拟了 胚胎的 早期 发育， 三个胚层原始细胞相继形成， 然后软骨前体细 胞经过聚集形成聚集体， 聚集体首先表达S c l e r a x i s , 随后表达c o l - 1 1 ， 最终分化形成一个软骨细胞团。 软骨 细胞团 继续分化则出现肥大现象( h y p o t r o p h ic ) ， 表达 c o l - X ， 象征着 进一步向 成骨分化的 开始。 N a k a y a m a V

19、 q 则通过另一种方法将小鼠E S 细胞诱导分化为软骨 细胞。他们的起始步骤也是将E S 细胞初步分化为 E B ， 将第5 天的类胚体酶解消化为单细胞后， 以血 管内 皮生长因子1 1 型受体 ( v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 2 , V E G F R - 2 / F l k - 1 ) 和血小板 源生长因 子a 受体( p l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r r e - c e

20、 p t o r - a , P D G F R - a ) 作为 细 胞 表 面 标 记 进 行 免 疫 荧 光染色， 通过流式细胞仪对细胞分群并分选， 分选 后的细胞经过离心后形成小球( p e l l e t ) ， 进一步在软 骨诱导液中培养3 周后形成软骨团块。 研究结果发 现， 无论是F l k - 1 或P D G F R 。阳 性细胞均具有成软 骨能力。 该实验中采用了无血清( s e r u m - f r e e ) 培养体 系， 排除了血清中各种未知生长因子的作用。实验 中发现， 若不添加生长因子， 几乎没有软骨细胞团 形成。而同时添加T G F - p 3 , P D

21、G F - B B 和B M P - 4 后， 可以使小球内细胞完全分化为软骨细胞。 如果在培 养液中加人硫代甘油和甲状腺素， 软骨细胞则进一 步分化为肥大的软骨细胞 ( h y p e rt r o p h i c c h o n d r o - c y t e s ) 。 后者可以 进一步发生矿化， 向 骨组织分化。 N a k a y a m a 的实验中 使用小球培养( p e l l e t c u l t u r e ) 方 法得到的软骨细胞， 无论在形态与软骨特异性染色 方面， 较 K r a m e r 的结果更具说服力， 原因之一可能 是前者使用的立体三维培养体系更符合软骨的

22、生 理环境， 因而更有利于软骨的分化。 诱导人类E S 细胞向软骨细胞分化的研究报道 则相对更少。 有一例报道来自 于L e v e n b e r g 等 11 4 1的 研 究， 他们在实验中也采用了三维培养体系， 但不是 小球培养法，而是应用了可降解的三维支架材料。 国 际生物医学工程杂志2 0 0 6 年6 月第2 9 卷第3 期 I n t J B i o m e d E n g , J u n e 2 0 0 6 , V o l . 2 9 , N o .3 人E S 细胞首先经过初步分化形成类胚体， 再消化成 单细 胞后， 同M a t r ig e l 混合后种植于P L L

23、A ( p o l y la c t ic - c o - g l y c o l i c a c i d ) 和P L G A ( p o l y L - l a c t i c a c i d ) ( 5 0 :5 0 ) 的 混合物制成的多孔海绵状支架上， 培养 1 4 d ， 培养 体系为 无血清培养 体系。 当 在培养液中 添加T G F - R , 时， 可以在合成物中检测到酸性蛋白多糖及软骨基 质蛋白( c a rt i l a g e m a tr ix p r o t e i n ) 。 这一证据可以 提示 软骨分化， 但是没有提供例如软骨样组织切片等更 令人信服的证据。人类

24、E S 细胞向软骨细胞分化的 研究对阐明人类软骨细胞的发育分化、 相关基因的 调控， 以及将来的临床应用具有重要的意义， 这方 面的研究有待进一步深化。 2 . 2 骨髓基质干细胞 骨髓基质干细胞诱导形成软骨的方法现已较 成熟115 1 。骨髓基质干细胞是目 前发现的骨髓中除造 血干细胞以外的另一类干细胞， 它具有向骨、 软骨 和脂肪细胞等中胚层细胞分化的潜能， 甚至有报道 认为它具有向外胚层细胞分化的多向分化能力。 时 a c k a y 等 1161将 人 的 骨 髓 基 质 干 细 胞 用 小 球 培 养 的 方法， 在加人一定的生长因子后， 可以诱导骨髓基 质干细胞分化形成软骨组织。

25、加人的生长因子包括 1 0 -5 m o l / L 地塞米松， 1 0 n g / m l 的T G F - 印 或T G F - p 3 ，以 及2 .5 x 1 0 m o l / L 维生素C 。比 较T G F - 日 3 和 T G F - p 1 的 作用， 认为前者的软骨诱导作用强于后 者。 形成的“ 软骨样小球” 外周部分细胞呈梭形， C O W 染色呈阳性， C o l - 1 1 染色为阴性， 类似于软骨膜的结 构。 小球内 部的细胞可见软骨陷窝结构， C o l - I I 染色 阳 性。小球用软骨诱导液培养两周后， 撤除T G F - 民 和地塞米松， 加人甲状腺素(

26、 t h y r o x i n e ) 5 0 n g / m l 及 R 磷酸甘油( R - g l y c e r o l ) 2 0 m m o l / L ， 软骨细胞可进一 步诱导分化为肥大( h y p o t r o p h i c ) 软骨细胞， 进而向成 骨方向 分化。除了 生长因子外， M a c k a y 在实验中 应 用高糖D M E M培养液， 高糖培养条件可促进B M S C s 向软骨方向分化: 一是高糖的培养条件下能减少因 缺氧引起的细胞调亡;另一个原因是高糖培养条 件可以抑制有氧呼吸， 促使B M S C s 向软骨细胞分 化。该实验的另一个特点也是采用了

27、小球培养的三 维立体培养方法， 诸多研究证实三维培养方法更有 利于软骨细胞分化， 该方法目 前已被广泛应用于软 骨诱导实验。小球培养法可以促进细胞一 细胞间及 细胞一 基质间的相互作用，而这对于软骨形成非常 重要。小球培养法使细胞形成一个团块样立体结 构， 而不是在培养皿表面延展生长， 它通过阻止细 胞的延展生长， 促进软骨分化， 并可以使去分化的 软骨细胞重新获得软骨表型， 而软骨细胞在平面培 养时便很容易发生去分化现象。 骨髓基质干细胞不 仅被证实在培养条件下能分化成软骨细胞， 在动物 体内 研究也被证实具有修复关节软骨缺损的能力切 ， 可以说它是现阶段组织工程化软骨构建的最佳种 子细胞。

28、 2 .3 脂肪干细胞 脂肪干细胞( a d i p o s e - d e r i v e d s t e m c e l l s , A D S C s ) 是一种来源于脂肪组织的间充质干细胞， 目 前被证 明具有与骨髓基质干细胞类似的多向分化潜能。 O g a w a 等n 81 将脂肪干细胞传代2 次后， 加人软骨诱 导培养液( D M E M培养液， 1 % 胎牛血清， 6 .2 5 N .g / m l 的胰岛素， 1 0 n g / m l T G F - R , ) 后， 应用微球培养的方 法培养4 周， 可以检测到a g g r e c a n 和c o l - 1 1 ,

29、C o l - X等 基因表达，组织学染色可以发现阿丽辛蓝( a l c i a n b l u e ) 染色阳 性细胞， 这些都证明 脂肪干细胞可以向 软骨细胞分化。实验中采用的微球培养( m i c r o m a s s c u l t u r e ) 方法是先将细胞悬液滴加在培养皿上( 2 x 1 0 5 c e ll s / 1 0 闪) , 5 h 后细胞聚集形成微球， 随后加人软 骨诱导培养液， 其目的同样是为了 创造一个有利于 软骨诱导分化的立体培养环境。 脂肪干细胞如能高 效地向软骨细胞分化并形成组织， 将为组织工程软 骨构建提供更佳的种子细胞来源。因为脂肪肝细胞 可以通过抽

30、吸脂肪的方式从患者身体获得， 而这种 抽吸手术本身不会对患者形成严重伤害， 与抽取骨 髓相比， 患者更易接受。对部分因肥胖而要求做体 型重塑的病人来说， 还能起到一箭双雕的效果。 3 共培养诱导模式 无论是胚胎干细胞还是骨髓基质干细胞的诱 导分化， 都需要在培养过程中添加与软骨发育相关 的生长因子来诱导细胞向软骨分化， 其目的也是为 了在体外尽可能模拟体内软骨细胞的发育生长微 环境， 达到好的诱导分化效果。这一体内微环境不 仅包括了细胞分泌的生长因子， 同时还包括了相邻 细胞间的相互作用， 以及组织局部所受的力学刺激 等等。能否在体外模拟这一微环境， 将是诱导分化 成功的关键。应用软骨细胞与骨

31、髓基质干细胞体外 共培养的方法， 在无需添加生长因子的条件下， 就 能成功诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化， 在体 外构建组织工程化的软骨组织t9 ， 这一研究结果提 示成熟软骨细胞能够提供充分的诱导骨髓基质干 细胞向软骨细胞分化的微环境。软骨细胞不仅可分 泌多种生长因子如T G F - p 2q ， 同时还能分泌组成软 骨微环境的特异性细胞外基质，如1 1 型胶原以及 A g g r e c a n 等， 对软骨细胞的分化、 增殖、 猫附及细胞 国际生物医 学工程杂志2 0 0 6 年6 月第2 9 卷第3 期 I n t J B io m e d E n g , J u n e 2 0 0

32、 6 , V o l . 2 9 , N o .3 1 4 1 间信号传导起着非常重要的 作用2 1- 13 1 。软骨细胞共 培养诱导方法的成功， 提示除了传统添加生长因子 的诱导方法以外， 与同类细胞共培养的方法可能是 更经济而有效的干细胞诱导分化方法。 软骨细胞共 培养模式为干细胞诱导分化提供了新的思路， 也为 研究其它细胞的分化提供了极有意义的参考。 4 结语 随着对胚胎干细胞以及成体干细胞研究的深 人， 特别是应用骨髓基质干细胞在动物关节软骨缺 损修复的成功， 预示着应用组织工程技术构建组织 工程化软骨并用于临床修复的缺损已不再遥远， 而 干细胞诱导分化的研究也将有助于全面了解人类

33、个体发育与组织的形成过程。 参考文献 1 C a o Y i - l i n , V a c a n t i J P , P a i g e K T , e t a l . T r a n s p l a n t a t i o n o f c h o n d ro - c y t e s u t i l i z i n g a p o l y e r - c e ll c o n s t r u c t t o p ro d u c e t i s s u e - e n g i n e e r e d c a rt i l a g e i n s h a p e o f h u m a n

34、 e a r 仁 J . P l a s t R e c o n s t r S u r g , 1 9 9 7 , 1 0 0 : 2 9 7 - 3 0 2 2 Z h o u S , E i d K , G l o w a c k i J . C o o p e r a t i o n b e t w e e n T G F - b e t a a n d W r i t p a t h w a y s d u r i n g c h o n d ro c y t e a n d a d i p o c y t e d i ff e re n t i a t i o n o f h u

35、m a n m a r ro w s t ro m a l c e l l s J . J B o n e M i n e r R e s , 2 0 0 4 , 1 9 ( 3 ) : 4 6 3 - 4 7 0 3 C a p d e v i l a J , J o h n s o n R L . E n d o g e n o u s a n d e c t o p i c e x p r e s s i o n o f n o g - g in s u g g e s t s a c o n s e r v e d m e c h a n i s m f o r r e g u l a

36、 t io n o f B M P f u n c t i o n d u r i n g li m b a n d s o m i t e p a t t e r n i n g J . D e v B i o l , 1 9 9 8 , 1 9 7 : 2 0 5 - 2 1 7 . 4 L a u f e r E , N e ls o n C E , J o h n s o n R L , e t a l . S o n i c h e d g e h o g a n d F g f 4 a c t t h ro u g h a s i g n a l i n g c a s c a d

37、 e a n d f e e d b a c k l o o p t o i n t e g r a t e g ro w t h a n d p a t t e r n i n g o f t h e d e v e l o p i n g l i m b b u d J . C e ll , 1 9 9 4 , 7 9 : 9 9 3 - 1 0 0 3 . 5 W a k i t a n i S , M i t s u o k a T , N a k a m u r a N , e t a l . A u t o l o g o u s b o n e s t ro m a l c e

38、ll t r a n s p l a n t a t i o n f o r re p a i r o f f r il l - t h i c k n e s s a r ti c u l a r c a r - t il a g e d e f e c t s i n h u m a n p a t e ll a e : T w o c a s e r e p o r t s J . C e ll T r a n s - p l a n t , 2 0 0 4 . 1 3 ( 5 ) : 5 9 5 - 6 0 0 . 6 K r u m l a u f R . H o x g e n e

39、 s i n v e rt e b r a t e d e v e l o p m e n t J . C e ll , 1 9 9 4 , 7 8 : 1 9 1 - 2 0 1 . 1 7 M o r g a n B A , T a b i n C . H o x g e n e s a n d g ro w t h : E a r l y a n d l a t e ro l e s i n l i m b b u d m o r p h o g e n e s i s J . D e v e l o p m e n t , 1 9 9 4 , 1 2 0 ( S u p p l ) :

40、 1 8 1 - 1 8 6 . 8 C s e r j e s i P , B ro w n D , L i g o n K L , e t a l . S c l e 二 二A b a s i c h e l i x - l o o p - h e l i x p ro t e i n t h a t p re f i g u re s s k e l e t a l f o r m a t i o n d u r i n g m o u s e e m b ry o- g e n e s i s J 3 . D e v e l o p m e n t , 1 9 9 5 , 1 2 1

41、: 1 0 9 9 - 1 1 1 0 . 9 Wri g h t E , H a r g r a v e M R , C h r i s t i a n s e n J , e t a l . T h e s ry - r e l a t e d g e n e S o x 9 i s e x p r e s s e d d u ri n g c h o n d ro g e n e s i s i n m o u s e e m b r y o s J ) . N a t G e n e , 1 9 9 5 , 9 : 1 5 - 2 0 . 1 0 E v a n s J F , N i

42、 u Q T , C a n a s J A , e t a l . A C T H e n h a n c e s c h o n d ro g e n e s i s i n m u l t i p o t e n t i a l p ro g e n i t o r c e l l s a n d m a t r i x p r o d u c t i o n i n c h o n d ro - c y t e s J . B o n e , 2 0 0 4 , 3 5 ( l ) : 9 6 - 1 0 7 . 1 1 H e n g B C , C a o T , L e e E

43、H . D i r e c t i n g s t e m c e ll d iff e r e n t i a t i o n i n t o t h e c h o n d r o g e n i c l i n e a g e i n v i t r o J . S t e m C e l l s , 2 0 0 4 , 2 2 ( 7 ) : 1 1 5 2 - 1 1 6 7 . 1 2 K r a m e J , H e g e rt C , G u a n K , e t a l . E m b ry o n i c s t e m c e ll - d e ri v e d c

44、 h o n - d ro g e n ic d i ffe re n ti a tio n in v itr o : A c ti v a t io n b y B M P - 2 a n d B M P - 4 J . M e c h D e v , 2 0 0 0 , 9 2 -. 1 9 3 - 2 0 5 . 1 3 N a k a y a m a N , D u ry e a D , M a n o u k i a n R , e t a l . M a c r o s c o p i c c a rt i l a g e f o r m a t i o n w it h e m

45、b ry o n i c s t e m - c e ll - d e ri v e d m e s o d e r m a l p r o g e n i t o r c e l l s J . J C e ll S c i , 2 0 0 3 , 1 1 6 ( 1 5 ) : 2 0 1 5 - 2 0 2 8 . 1 4 L e v e n b e r g S , H u a n g N F , L a v i k E , e t a l . D i ff e re n t i a t i o n o f h u m a n e m - b ry o n i c s t e m c e

46、 l l s o n t h r e e - d i m e n s i o n a l p o l y m e r s c a ff o l d s J . P r o c N a t A c a d S c i U S A , 2 0 0 3 , 1 0 0 ( 2 8 ) : 1 2 7 4 1 - 1 2 7 4 6 . 1 5 A n i t a M , A l e s s a n d ro C , M a r a 民 e t a l . F o r m a t i o n o f a c h o n d ro - o s - s e o u s r u d i me n t i n

47、 mi c ro- - c u l t u r e s o f h u ma n b o n e - ma r r o w s t rom a l c e l l s J . J C e ll S c i , 2 0 0 3 , 1 1 6 : 2 9 4 9 - 2 9 5 5 . 1 6 M a c k a y A M , B e c k S C , M u r p h y J M , e t a l . C h o n d r o g e n i c d iff e re n t i a - t i o n o f c u l t u r e d h u m a n m e s e n

48、c h y m a l s t e m c e l l s f ro m m a r r o w J . T i s s u e E n g , 1 9 9 8 , 州 4 ) : 4 1 5 一2 8 . 1 7 Z h o u G D , W a n g X Y , M i a o C I , e t a l . R e p a i r i n g p o r c i n e k n e e j o in t o s - t e o c h o n d r a l d e f e c t s a t n o n - w e i 沙t b e a r i n g a r e a b y a

49、u t o l o g o u s B M S C J . Z h o n g h u a Y i X u e Z a Z h i , 2 0 0 4 , 8 4 : 9 2 5 - 9 3 1 . 1 8 O g a w a R , M i z u n o H , Wa t a n a b e A e t a l . O s t e o g e n i c a n d c h o n d ro g e n i c d i ff e re n t i a t i o n b y a d i p o s e - d e r i v e d s t e m c e l l s h a r v e s t e d f ro m G F P t r a n s g e n i c m i c e J . B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n , 2 0 0 4 , 3 1 3 ( 4 ) : 8 7 1 - 8 7 4 1 9 Z h o u G D , M i a o C L , Wa n g X I , e t a