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1、3 6 0 广西医科大学学报2 0 1 0J u n ；2 7 ( 3 ) 异有氨基酸置换，4 个为同义置换。开放阅读框的保守区域 以及核心启动子区的特异性碱基无变化 B ，根据乙肝病毒 H B x 分型办法 8 J 确认P C R 扩增产物属于人类乙肝病毒C 亚型H B x 基因变异体。 G F P 已广泛作为一种新型的报告分子，用于检测细胞的 基因表达和蛋白定位。G F P 与其它发光性报告分子不同， G F P 不需要另外的蛋白质、底物或共同因子，但只有完整的 G F P 才能发出荧光。它在暴露于紫外线后即可发出明亮的 绿色荧光，并可在荧光显微镜下观察到这种绿色荧光。本实 验中应用的p
2、E G F P - N 1 是一种突变型绿色荧光蛋白。有一个 更适合于在人类细胞中表达的开放阅读框，而且p E G F P - N 1 的翻译效率高，表达强，所产生的荧光比G F P 强3 5 倍 1 。 在实验中发现p E G F P - N 1 - 一H B x 荧光表达质粒在L i p o f e c t a m i r e2 0 0 0 转染肝癌细胞H e p G 2 后，1 2h 即开始表达，但强度 较弱。2 4h 发光细胞明显增多，多为明亮的绿色荧光，少数 发生弱荧光。在细胞质和细胞核中均有表达，但在表达水平 上存在差异，多数细胞为强荧光。表达数量及荧光强度均以 转染后4 8h 为
3、最高。 在经基因测序、双酶切鉴定、R T P C R 检测以及荧光检测 均说明p E G F P - N 1 一H B x 荧光表达质粒成功构建并且能在肝 癌细胞株H e p G 2 中表达，研究结果为进一步研究H P x 在肝 细胞恶变过程中作用创造了条件。 参考文献： 1 3C o l g r o v eR ，S i m o nG ，G a n e mD T r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o no fh o m o l o g o u sa n dh e t e r o l o g o u sg e n e sb Yt h e h e
4、 p a t i t i sBv i r u sXg e n ep r o d u c ti nc e l l sp e r m i s s i v ef o r v i l a lr e p l i c a t i o n F J - I JV i r o l ，1 9 8 9 ，6 3 ( 9 ) ：40 1 9 40 2 6 2 K o i k eK ，S h i r a k a t aY ，Y a g i n u m aK ，e ta I O n c o g e n i c p o t e n t i a lo fh e p a t i t i sBv l r u s J M o lB
5、 i o lM e d ，1 9 8 9 ， 6 ( 2 ) ：1 5 1 1 6 0 广西医科大学学报2 0 1 0J u n ；2 7 ( 3 ) 3 R o s s n e rM T R e v i e w ：h e p a t i t i sBv i r u sX - g e n ep m d - 。 t ( t ：a 岫u o u $ t r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t o r E J JM e d V q r o l ，1 9 9 2 ，3 6 ( 2 ) ：1 0 1 - 1 1 7 4 K i mJ H ，R h oH M A
6、c t i v a t i o no f1 h eh u m a nt r a n s f o r 。 m i n gg r o w t hf a c t o ra l p h a ( T G F - a l p h a ) g e n eb yt h e h e p a t i t i sBv i r a lXp r o t e i n ( H B x ) t h r o u g hA P - 2s i t e s J M o lC e l lB i o c h ( r n ，2 0 0 2 ，2 3 1 ( 1 - 2 ) ：1 5 5 1 6 1 5 2D a n d r iM ，B u
7、 r d aM R ，B t i r k l eA ，e ta 1 I n c r e a s ei nd e n o v oH B V D N Ai n t e g r a t i o n si nr e s p o n s et oo x i d a t i v e D N Ad a m a g eO ri n h i b i t i o no fp o l y ( A D P - r i b o s y l ) a t i o n 口 H e p a t o l o g y ，2 0 0 2 ，3 5 ( 1 ) ：2 1 7 “ 。2 2 3 6 3T r u a n tR ，A n
8、t u n o v i cJ ，G r e e n b l a t tJ ，e ta 1 D i r e c ti n - r e a c t i o no ft h eh e p a t i t i sBv i r u sH B xp r o t e i nw i lhp 5 3 l l e a d st Oi n h i b i t i o nb yH B xcfp 5 3r e s p o n s ee l e m e n t - 。d i r e c t e dt r a n s a c t i v a t i o n J JV i r o l ，1 9 9 5 ，6 9 ( 3 )
9、；18 5 1 - 1 8 5 9 7 Z h a oJ ，W a n gH ，W e iL ，e ta 1 T h ec y t o t o x i ce f f e c to f E 1B5 5 一k D am u t a n ta d e n o v i r u so nh u m a nh e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m ac e l ll i ( s J C a n c e rG e n eT h e r ，2 0 0 1 ，8 ( 5 ) ：3 3 3 3 4 1 8 K i d d - l j u n g g r e nK ，O
10、 b e r gM 。K i d dA H T h eh e p a t i t i s Bv i r u sX g e n e ：a n a l y s i so ff u n c t i o m ld o m a i nv a r i a t i o n a n dg e n ep h y l o g e n yu s i n gm u l t i p l es e q u e n e e s E J - I JG ( n V “ i r o l ，1 9 9 5 ，7 6 ( P t9 ) ：21 1 9 - 21 3 0 9 K i d d - l j u n g g r e n ，M
11、 i y a k a w aK Y ，K i d dA H G e n e t i c v a r i a b i l i t yi nh e p a t i t i sBv i r u s e s J JG e nV i r o l ，2 0 0 2 ， 8 3 ( F t6 ) ：12 6 7 12 8 0 1 0 Y a n gT T ，S i n a iP ，G r e e nG ，e ta 1 I m p r o v e df l u o r e s - - c e n e ea n dd u a l 【c o l o rd e t e c t i o nw i t he n h a
12、 n c , e e lb l u ea n d g r e e nv a r i a n t so f1h eg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n J JB i 0 1C I h e m ，1 9 9 8 ，2 7 3 ( 1 4 ) ：82 1 2 82 1 6 应用斜面汉密顿微量注射器针头脑内注射 6 一羟基多巴胺制作大鼠帕金森病模型 沈岳飞 ( 广西医科大学第一附属医院神经内科南宁5 3 0 0 2 1 ) 摘要目的：探讨应用斜面汉密顿微量注射器针头代替平面汉密顿微量注射器针头，6 一羟基多巴胺( 6 - h y d r o x y d
13、 o p a m i n e ，6 O H D A ) 中脑黑质单侧单点立体定向注射法制作单侧帕金森病( P a r k i n s o n sd i s e a s e ，P D ) 模型的可行性。方法：采用雌性s D 大 鼠，在脑立体定位技术下，应用斜面汉密顿微量注射器针头将6 - O H D A 注入大鼠右侧的中脑黑质部位，用动物旋转行为监测 仪记录阿扑吗啡( A p o m o r p h i n e ，A p o ) 诱发的大鼠异常旋转行为，并测定脑组织液生化改变，并与平面汉密顿微量注射器针头 * 基金项目；广西自然科学基金资助项目( N o 桂科白0 8 3 2 1 4 0 ) 收
14、稿日期；2 0 0 9 - - 0 9 1 I 注射组相比较。结果：实验组和对照组的F D 动物模型成功率 分别为7 3 3 3 ( 1 1 1 5 ) 和8 0 c o ( 1 2 1 5 ) ，两者比较差异无 统计学意义( P o 0 5 ) 。两种针头制作的P D 鼠损毁侧脑组织 万方数据 沈岳飞应用斜面汉密顿微量注射器针头脑内注射6 一羟基多巴胺制作大鼠帕金森病模型 3 6 1 液中多巴胺( D o p a m i n e ，D A ) 代谢产物3 ，4 一二羟基乙酸( d i h y d r o x y p h e n y l a c e t i ca c i d ，D O P A
15、C ) 和高香草酸( h o m o v a n i l l i ca c i d ， H V A ) 明显低于未损毁侧( P 0 0 5 ) 。 2 1 2A p o 诱发的旋转行为的记数：在给予6 - O H D A 后6 周观察，实验组和对照组各死亡1 只，其余动物均不同程度 地出现少食少动，尾部强直、肢体震颤、嗅探、觅食动作，个别 偶有自发性旋转。对照组动物饮食行为如常。皮下注射 A p o 后，实验组存活的1 4 只大鼠有1 1 只出现恒定左转，对照 组存活的1 4 只大鼠有1 2 只出现恒定左转，空白对照组则没 有动物出现旋转行为。旋转时，以左侧后肢为支撑点，头尾 相接呈环状。其中
16、实验组有l o 只大鼠，对照组有1 1 只大鼠 旋转3 0 0 圈r a i n 大于7 圈m i n ，被认为是模型成功大鼠。空 白对照组没有死亡，实验动物也未见旋转行为。 2 1 3 儿茶酚胺类物质含量的变化：我们采用H P L C A 技 术测定纹状体微透析液中的D A 及其代谢产物的含量。单次 损毁术后8 周测定P D 大鼠脑纹状体部位组织微透析液高压 液相层析分析表明，各组损毁侧( 右侧) 黑质组织中的D A 、 D O P A C 、H V A 含量均低于未损毁侧( 左侧) ，其中D o P A C 、 H V A 明显低于未损毁侧，3 组比较差异均有统计学意义( P 0 0 5
17、) 。但模型损毁侧与非损毁侧的D A 及其代谢产物比较， 差异均有统计学意义( P O 0 5 ) ，说明两种方法都可以成功 地制作偏侧P D 模型。 在应用斜面汉密顿微量注射器针头代替汉密顿微量注 射器针头时，操作的关键是：用斜面汉密顿微量注射器针头 一直进针到感觉轻微的阻力为止，然后轻退针约0 3m m 后 以1g L m i n 的注射速度注射6 - O H D A 。其理由是斜面汉密 顿微量注射器针头下端为一个斜面，我们所用的微量注射器 针头斜面的长度为1 9m m ，而当注射速度很慢时( 1 ”L m i n ) ， 注射液一般从斜面的上端出来，根据立体定位图谱上的资 料 3 ，我们
18、选择的注射点距离下面的骨性结构约有2 2m m 左右，所以在实际操作时可以一直进针到感觉轻微的阻力为 止，然后轻退针约0 3m m 后再缓慢注射，这样就可以达到成 功制作P D 模型的目的，此方法值得在以后的试验中推广。 参考文献： 5 6 3 D e u m e n sR ，B l o k l a n dA ，P r i c k a e r t sJ M o d e l i n gP a r k i n s o n sd i s e a s ei nr a t s ：a ne v a l u a t i o no f6 - O H D Al e s i o n so ft h en i g
19、r o s t r i a t a lp a t h w a y J E x pN e u r o l ， 2 0 0 2 ，1 7 5 ( 2 ) ：3 0 3 3 1 7 王涛，左萍萍帕金森病实验动物模型研究进展 J 中国神经免疫学和神经病学杂志，2 0 0 8 ，1 5 ( 6 ) ：4 5 5 4 5 7 S m i t hM P ，C a s sW A G D N Fr e d u c e so x i d a t i v es t r e s s i na6 - h y d r o x y d o p a m i n em o d e lo fP a r k i n s o n S
20、d i s e a s e J N e u r o s c iL e t t ，2 0 0 7 ，4 1 2 ( 3 ) ：2 5 9 2 6 3 P a x i n o sG ，W a t s o nC T h eR a tB r a i ni nS t e r e o t a x i cC o o r d i n a t e s - M 2 n de d N o r t hR y d e ：A c a d e m i cP r e s s ， 1 9 8 6 ：3 6 5 6 M a t s u y aT ，T a k u m aK ，S a t oK ，e ta 1 S y n e r
21、g i s t i ce f f e c t s o fa d e n o s i n eA 2 Aa n t a g o n i s ta n dL - D O P Ao nr o t a t i o n a l b e h a v i o r si n6 - h y d r o x y d o p a m i n e - i n d u c e dh e m i P a r k i n - s o n i a nm o u s em o d e l J JP h a r m a c o lS c i 。2 0 0 7 ，1 0 3 ( 3 ) ：3 2 9 3 3 2 B o v 6J ，P r o uD ，P e r i e rC ，e ta 1 T o x i n - i n d u c e dm o d e l s o fP a r k i n s o n sd i s e a s e J N e u r o R x 。2 0 0 5 2 ( 3 ) ：4 8 4 4 9 4 j = J 口 口 万方数据