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1、收稿日期:2005_10_20 基金项目:国家自然科学基金(30370510,30170337),广东省自然科学 基金(31693),卫生部临床重点项目基金(2001321),高等学校博士学科 点专项科研基金(20030558058),教育部骨干教师基金(082004) Supported by National Natural Science Foundation of China (30370510, 30170337), Natural Science Foundation of Guangdong Province (31693), Key Clinical Research Fund
2、 of Ministry of Health (2001321), Research Fund for Doctoral Program of Higher Education(20030558058)and the Foundation of Backbone Teachers of the Ministry of Education (082004). 作者介绍:张雅妮(1977_),女,在读博士研究生,从事神经系统遗传性 疾病研究,电话:13719090140,E_mail: 通讯作者:张 成,电话:020_86332387,E_mail: 异体骨髓干细胞移植后假肥大型肌营养不良症模型
3、鼠膈肌 dystrophin 表 达及病理改变 张雅妮,张 成,于美娟,王淑辉,李美山,黄 慧,熊 符,冯善伟,柳太云,卢锡林(中山大学第一医院神经科,广东 广州510080) 摘要:目的 探讨骨髓干细胞移植对假肥大型肌营养不良症(DMD)模型鼠_mdx鼠膈肌的治疗效果。 方法 取雄性SD大 鼠骨髓干细胞经尾静脉植入放疗处理后的8周龄雌性mdx 鼠( nX18),于移植后4、8、12周各取6只mdx鼠的膈肌行 HE染色、抗肌萎缩蛋白(dystrophin)免疫荧光检测以及dystrophin mRNY的RT_PCR分析,同时用正常C57鼠及放疗 而未移植的mdx鼠作为对照,另进行PCR反应检测
4、实验鼠膈肌内Sry(Z染色体的性别决定区)基因。结果 移植后mdx 鼠膈肌间质内炎性细胞浸润较放疗而未移植mdx鼠有所减少;移植后核中心移位纤维比例移植后4、8、12周分别为 (15.580.91)、(12.501.87)、(10.171.17)较未移植mdx 鼠( 19.51.87)显著减少。 移植后dystrophin免疫荧光 阳性细胞比例移植后4、8、12周分别为(1.000.32)、(6.001.05)、(11.921.11)较未移植mdx 鼠( 0.170.41)显著 增加。RT_PCR结果显示C57鼠膈肌的dystrophin mRNY 相对含量(0.630.04)最高;而未移植m
5、dx鼠的膈肌中未检测 到dystrophin mRNY;移植后的mdx鼠膈肌中mRNY的表达水平(移植后4、8、12周分别为0.190.05、0.260.06、0.36 0.04)随时间推移逐渐增高;移植后各时间点mdx鼠膈肌Sry基因均为阳性。 结论 骨髓干细胞系统移植mdx鼠可以恢 复部分膈肌的dystrophin表达,改善膈肌的病理,骨髓干细胞移植有希望成为全身治疗DMD的有效方法。 关键词:假肥大型肌营养不良症;mdx鼠;膈肌;骨髓移植;抗肌萎缩蛋白 中图分类号:R392.4 R457.7 文献标识码:Y 文章编号:1673_4254(2006)01_0053_06 Dys rophi
6、n expression and pa hology of diaphragm muscles of mdx mice af er xenogenic bone marrow s em cell ransplan a ion _HYNG Za_ni , _HYNG Cheng, Z Mei_auan, bYNG Shu_hui, cd Mei_shan, HYNG Hui, edfNG Fu, FENG Shan_gei, cd Tai_yun, c ei_lin Department of Neurology, First Hospital of Sun Zat_sen niversity,
7、 Guangzhou 510080, China Abs ra : Obje ive To investigate the effect of bone marrog stem cell transplantation (BMT) on the diaphragm muscles of mdx mice, a mouse model of Duchenne muscular dystrophy (DMD). Me hods The bone marrog_derived stem cells form male SD rats gas transplanted through the tail
8、 vein into 18 female 8_geek_old mdx mice, ghich gere sacrificed at 4, 8 and 12 geeks after BMT (6 at each time point), respectively. The diaphragm muscles of the mice gere subaected to HE staining, im_ munofluorescence detection of dystrophin, reverse transcription (RT)_PCR analysis of dystrophin mR
9、NY transcripts and PCR analysis of Sry (sex_determining region on the Z chromosome) gene, gith age_matched female C57 mice and untreated mdx mice as the controls. Resul s The proportion of centrally nucleated fibers (CNF) in the diaphragm muscle of the recipient mdx mice gas (15.580.91), (12.501.87)
10、 and (10.171.17) at 4, 8 and 12 geeks after BMT, respectively, significantly smaller than that of untreated mdx mice (19.51.87), and the fibers after BMT shoged less inflammatory infiltration. Com_ pared gith the untreated mice, the recipient mdx mice shoged green fluorescence on significantly more
11、diaphragm muscle cell membranes gith the proportion of dystrophin_positive fibers of (1.000.32), (6.001.05) and (11.921.11) at 4, 8, and 12 geeks after BMT. RT_PCR of dystrophin mRNY al_ so demonstrated significantly higher relative levels of dystrophin in the recipient mdx mice (0.190.05, 0.26 0.06
12、 and 0.360.04 at 4, 8 and 12 geeks after BMT) than in untreated mdx mice, and Sry gene gas present in the recipient mice. Con lusions BMT can partially re_ store dystrophin expression and ameliorate the patholo_ gy in the diaphragm muscles of mdx mice, and has great potential to produce general ther
13、apeutic effect in pa_ tients gith DMD. Key words: Duchenne muscular dystrophy mdx mice diaphragm bone marrog transplantation dystrophin 200626(1) 南方医科大学学报(h South Med niv)53 假肥大型肌营养不良症(DMD)是一种致死性 X 鼠,观察到供体来源的,-./01234表达,建立了骨髓 移植治疗DMD的方法。=,小鼠是目前应用最广泛 的DMD模型鼠,过去的DMD细胞治疗实验侧重观 察=,鼠的肢体骨骼肌,忽视了对膈肌疗效的评价, 而后
14、者对移植疗效和预后的评价可提供不可忽视的 证据。 本实验采用大鼠骨髓干细胞经尾静脉对放疗后 的=,鼠进行移植, 观察移植后膈肌的病理改变和 抗肌萎缩蛋白的表达情况,以评价骨髓干细胞系统移 植对=,鼠膈肌的治疗效果。 )55材料和方法 )*)55实验动物 原代纯合子=,配种鼠(:;)购于美国EFCG.14实验室,实验所用=,鼠为 原代配种所生。 雄性BD大鼠(H6IJ6K)6只作为供体 鼠;正常野生型:; 鼠( J周龄)J只进入移植 治疗组;经放疗但未治疗的雌性=,鼠()(I)H周)H 只作未治疗组。 上列实验用鼠均有动物合格证。 )*(55主要实验试剂 兔抗鼠,-./01234多克隆抗体、山羊
15、抗兔LMNO:5 NK8二抗(BF4/F5:09P5公司),引物合成(上海生物工程 技术服务有限公司),OQNP1R(N4S3/01KT4公司),逆转 录试剂盒(MT0=T4/F.),DUV提取试剂盒(上海华舜生 物工程有限公司),OFK酶(M?N公司),低糖DMWM 细胞培养液(8N?:X公司)。 )*Y55实验方法 )*Y*)55=,鼠移植前放疗预处理方案在细胞移植前 Y天对=,5鼠进行放疗预处理: 放疗视野Y6*65C=5 Y6*65C=,治疗距离J6*65C=,治疗深度(*65C=,照射剂 量鼠经尾静脉进行移植, 移植细胞数为)*6 )6鼠从尾静脉注入等体积无血清 DMWM作空白对照。
16、 )*Y*Y55移植后模型鼠膈肌组织W染色分别取移植 后、J、)(周的治疗鼠和对照鼠膈肌用X:O包埋,投 入在液氮中预冷的异戊烷鼠及对照鼠的膈肌做冰冻切 片(具体同前),用冷丙酮固定)65=34后置于-J65冰 箱待用。 具体方法为:_?B洗Y;5=34;Y(X(封闭 )65=34,_?B洗Y;5=34;正常山羊血清于室温湿盒内 封闭Y65=34, 甩去封闭血清, 每种切片滴加兔抗鼠 ,-./012345;65R():(66),5过夜;室温放置Y65=34, _?B洗Y;5=34;滴加山羊抗兔NK8IMNO:():(66),室 温下湿盒内孵育H65=34,_?B洗Y;5=34。XR-=9. 荧
17、光显微镜观察结果并拍照, 每只鼠观察H张切片, 每张切片连续取HI)6个非重叠视野, 计算荧光阳性 纤维占总纤维比例,取其均值作结果。 )*Y*;55移植后膈肌组织,-./01234的逆转录a聚合酶 链反应(QOI_:Q)取新鲜:;鼠以 及治疗组各个时间点的=,鼠的膈肌按照OQNP1R 法制备QUV, 分别取)5K5QUV进行逆转录。 大鼠 555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555南方医科大学学报+E5B19/25MT,5b43S)555555555555555555555555555555555555555
18、555555555555555555第(H卷; ExonPrimer sequence for CDNAFragment length(bp) Dystrophin F : 5 ctcgtagtcctgcccaga3 444 R : 5 gtttgactgccaaccactcg3 GAPDH F: 5 accacagtccatgccatcac3 451 R : 5 tccaccaccctgttgctgta 3 表1 dystrophin及GAPDH的cDNA引物序列及 RT-PCR扩增片断长度 Tab.1 Primer sequen e of dystrophin and GAPDH DNA
19、and fragment length after RT-PCR There were significant differences in the percentage of CNF in the diaphragm muscles between any two groups (P、:=的水平证实供体细胞成功植入受体小 鼠的膈肌,进一步证实了骨髓干细胞移植有希望在今 后成为全身治疗:;:的有效方法。 参考文献: 1G?ssoni A BoneoCa DA BtriECFand G:A et aFH :ystrophin expression in the mdx mo?se restore
20、d Iy stem EeFF transpFantationJH =at?reA 1KKKA LM1NOPQ1RSTUKMVLH W张为西A 张 成A 刘焯霖A 等H 建立:?Ehenne 型肌营养不良鼠的骨 髓移植模型JH 中山医科大学学报A WMM1 A WWNWRS XKVKWH Yhang ZA Yhang GA Li? YLA et aFH staIFishment o marro transV pFantation modeF in miEe ith :?Ehenne m?sE?Far dystrophyJH V Ead J B;BATWMM1ATWWNWRSTXKVKWH UZa
21、CitaniTBATBaitoT_ATGapFanTHT;yogeniETEeFFsTderiaedTromTratT IoneTmarroTmesenEhymaFTstemTEeFFsTexposedTtoTQVabaEytidineJHT ;?sEFeT=eraeAT1KKQAT1XN1WRST1L1PVWOH LFerrariTGATG?seFFaV:eTngeFisTGATGoFettaT;ATetTaFHT;?sEFeTregeneraV tionTIyTIoneTmarroVderiaedTmyogeniETprogenitorsJH TBEienEeA 1KKXATWPKNQUQ
22、ORST1QWXVUMH QZangTLATLiTDATGhenTJATetTaFHTsEhemiETEereIraFTtiss?eTandT;GPV1TenV hanEeTratTIoneTmarroTstromaFTEeFFTmigrationTinTinteraEeTE?Ft?re JHTxpTcematoFATWMMWATUMNPRSTXU1VOH OJaECsonTdAT;aeCaTB;ATZangTcATetTaFHTJHT;oFT_herATWMM1ATLN1RSTLQVQ1H K陈松林AT张 成AT黄 文AT等HT亚致死量放疗对:?Ehenne型肌营养不 良鼠骨髓干细胞移植的影
23、响JH中山大学学报S医学版ATWMMUATWL NWRST1MKV11WH GhenTBLATYhangTGATc?angTZATetTaFHT_heTeeEtsToTs?IFethaFTdoseTraV diotherapyTonTIoneTmarroTstemTEeFFsTtranspFantationTorTmiEeTithT :?EhenneTm?sE?FarTdystrophyJHTJTB?nTDatVBenTniaN;edTBEiRAT WMMUATWLNWRST1MKV11WH 1MGraordTGATL?TfLATPartridgeT_ATetTaFHTB?ppressionT
24、oTreaertantT iIersTinTmdxTmiEeTIyTexpressionToTaT?nEtionaFTdystrophinJHT c?mT;oFTGenetATWMM1AT1MNWLRSTWPLQVQMH 11LaBargeT;A TBFa?Tc;H TBioFogiEaFTprogressionTromTad?FtTIoneT marroTtoTmonon?EFeateTm?sEFeTstemTEeFFTtoTm?Ftin?EFeateTm?sEFeT iIerTinTresponseTtoTine?ryJHTGeFFATWMMWAT111NLRSTQXKVOM1H (责任编辑:吴锦雅) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT南方医科大学学报NJTBo?thT;edTniaRTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT第WO卷QX