微小牛蜱幼蜱CDNA表达文库的构建.pdf

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1、 微小牛蜱幼蜱c D N A表达文库的构建 李文卉,罗建勋,殷 宏,高金亮,关贵全,刘志杰, 党志胜,马米玲,刘爱红,任巧云 ( 中国农业科学院 兰州兽医研究所 甘肃省动物寄生虫病重点实验室,甘肃 兰州 7 3 0 0 4 6) 摘要:为了研究微小牛蜱功能性抗原基因, 从微小牛蜱(B o o p h i l u sm i c r o p l u s) 幼蜱中提取总 R NA并分离纯化mR NA。采用O l i g o(d T) 引物合成双链c D NA, 在其两端加E c oR、H i nd定 向接头, 用M i n iC o l u m nF r a c t i o n a t i o n凝

2、胶过滤柱纯化后定向克隆到S C R E E N载体。经体外包 装, 成功构建了我国微小牛蜱幼蜱c D NA表达文库, 铺板测定原始库容量为4. 51 0 5P F U, 扩增后 的滴度为7. 21 0 1 0P F U /m L。 关键词:微小牛蜱;c D NA表达文库;抗原基因 中图分类号:S8 5 2. 7 4 6:Q7 8 6 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 0 - 6 4 1 9( 2 0 0 5)1 2 - 0 9 9 4 - 0 3 C o n s t r u c t i o no f c D N Ae x p r e s s i o n l i b r a r yf r o

3、 ml a r v a e o fB o o p h i l u s i c r o p l u s L IW e n - h u i,L UOJ i a n - x u n,Y I N H o n g,GAOJ i n - l i a n g,GUANG u i - q u a n,L I UZ h i - j i e, D ANGZ h i - s h e n g,MA M i - l i n g,L I U A i - h o n g,R E NQ i a o - y u n (K e yL a b o r a t o r yo fA n i m a lP a r a s i t o l

4、 o g yo fR a n s uP r o v i n c e,L a n z h o uV e t e r i n a r yR e s e a r c hI n s t i t u t e, C h i n e s eA c a d e m yo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s,L a n z h o u7 3 0 0 4 6,C h i n a) A b s t r a c t:T h e t o t a lR NAa n ds u b s e q u e n t l ymR NAw e r e i s o l a t e df r o

5、 mt h e l a r v a eo fB o o p h i l u sm i c r o - p l u st os t u d y f u n c t i o n a l g e n e so fB. m i c r o p l u s. O l i g o(d T)- p r i m e dc D NAw i t hd i r e c t i o n a lE c oR /H i nd l i n k e r sw a ss y n t h e s i z e da n df u r t h e rp u r i f i e db y M i n iC o l u m nF r a

6、 c t i o n a t i o nK i t,a n dt h e nl i g a t e dt ot h e E c oR/H i nd a r m so ft h es c r e e nv e c t o r .T h ec D NAe x p r e s s i o nl i b r a r yw a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y w i t h4. 51 0 5P F Us i z eo f t h ep r i m a r yl i b r a r ya n d7. 21 01 0P F U /m Lt i t

7、e ro f t h ea m p l i f i e dl i b r a r y . K e yw o r d s:B o o p h i l u sm i c r o p l u s;c D NAe x p r e s s i o nl i b r a r y;a n t i g e ng e n e 微小牛蜱(B o o p h i l u sm i c r o p l u s) 是严重危害畜 牧业发展的重要外寄生虫之一, 分布于我国大部分 省区 1, 可传播牛巴贝虫( B a b e s i ab o v i s) 和双芽巴 贝虫( B.b i g e m i n a) 等血液原虫病

8、 2。目前, 蜱的防 制主要采用化学药物, 但是蜱耐药性的产生以及化 学药物对环境污染和药物残留等公共卫生问题的日 益严重, 迫使人们寻求新的防制途径。在众多控制 蜱的方法中, 免疫学技术已成为研究热点。国外已 有用来自于微小牛蜱肠道的B m 8 6抗原基因研制生 产的商品化疫苗T i c k GAR D和G a v a c, 田间试验表 明, 这2种疫苗对免疫牛均有很好的抗蜱作用 35。 但试验证明, 以单一抗原为基础的抗蜱疫苗对动物 的保护效果往往不如以几种靶抗原为基础的抗蜱疫 苗, 于是人们仍在不断地寻找微小牛蜱的其他保护 性抗 原。G a r c p a - G a r c p a等

9、6从 微 小 牛 蜱 分 离 出 B m 9 5基因并在毕赤酵母(P i c h i ap a s t o r i s) 中进行 了表达, 以其表达产物为基础的疫苗对不同地域微 小牛蜱的侵袭具有更广谱的保护性。R i d i n g等 7 从半饱血微小牛蜱雌蜱唾液腺和肠道中分离出了 B m 9 1基 因。W i l l a d s e n等 8证 实, B m 9 1能 增 强 B m 8 6作为疫苗抗原对微小牛蜱的抵抗作用。在我 国, 微小牛蜱分子疫苗的研究工作起步较晚。本研 究旨在构建微小牛蜱幼蜱c D NA表达文库, 为筛 选、 研究微小牛蜱功能性抗原基因奠定基础。 收稿日期:2 0 0

10、 5 - 0 8 - 1 5;修回日期:2 0 0 5 - 1 1 - 2 8 基金项目:国家高技术研究发展计划(8 6 3) 项目(2 0 0 3 AA 2 4 1 1 1 0) ; 国家自然科学基金与J S P S国际合作项目(3 0 2 7 0 9 9 2) 作者简介:李文卉(1 9 7 7) , 女, 甘肃天水人, 硕士。罗建勋为通讯作者,E - m a i l:t t b d l v r i p u b l i c . l z . g s . c n 中国兽医科技 2 0 0 5, 3 5(1 2) :9 9 4 - 9 9 6 C h i n e s eJ o u r n a l

11、o fV e t e r i n a r yS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y 1 材料与方法 1. 1 微小牛蜱 试验用微小牛蜱采集于四川省甘孜州黄牛体表 的微小牛蜱饱血雌蜱, 由本实验室人工饲养传代培 养成饥饿幼蜱。 1. 2 试剂 焦碳酸二乙酯(D E P C) 、 二甲基亚砜(DMS O) 均 购自S i g m a公司;T R I z o l和mR NA纯化试剂盒均 购 自I n v i t r o g e n公 司;O r i e n t E x p r e s s O l i g o(d T) c D NA表达文库构建试剂盒购自N o v

12、a g e n公司。 1. 3 微小牛蜱总R N A的提取 称取1 0 0m g微小牛蜱幼蜱, 加入1m LT R I z o l 研磨后离心, 取上清液用氯仿分离, 异丙醇沉淀, 再 用7 5 0m L/L乙醇洗涤, 最后将R NA溶于无R NA 酶水中, 用微量核酸蛋白检测仪测定总R NA( 用 Q2 6 0n m/Q2 8 0n m值表示) , 并对其进行凝胶分析。其余 总R NA样品置-7 0保存备用。 1. 4 m R N A的分离纯化 利用O l i g o( d T)- C e l l u l o s e纤维素柱对mR NA 进行纯化, 具体操作步骤按说明书进行。 1. 5 c

13、D N A的合成 以4gmR NA为模板,O l i g o( d T) 为引物, 在 鼠白血病病毒反转录酶(M - M u L V) 作用下合成第 一链c D NA; 加入甲基化d NT P混合物、D NA聚合 酶和R NA酶H合成第二链c D NA。取2L合 成的c D NA用于琼脂糖凝胶电泳检测, 其余的进行 末端修饰。 1. 6 c D N A的末端修饰 在T 4D NA聚合酶作用下补平c D NA的末端 后, 在其两端加E c oR、H i nd定向接头, 并用 E c oR、H i nd 进行双酶切, 得到5 端为E c oR、 3 端为H i nd酶 切 位 点 的 黏 性 末

14、端, 用 于 去 除 c D NA小片段。 1. 7 c D N A的纯化 将双链c D NA通过凝胶过滤树脂柱层析, 除去 多余的接头和长度小于3 0 0b p的c D NA片段。 1. 8 c D N A与载体“S C R E E N的连接、 体外包装及 原始库容量的计算 将c D NA与载体在1 6过夜连接, 2 2放置2 h, 加入噬菌体包装稀释液S M(0. 1m o l/L N a C l, 0. 0 5 m o l/L M g S O4,0. 2 5 m o l/L T r i s - HC l, p H 7. 5,0. 1g/L明胶) 和5L氯仿, 混匀后轻微离心。 将上层水相

15、移到新管中, 取5L作梯度稀释后, 转 染宿主菌E R 1 6 4 7。将噬菌体-细菌混合物与顶层琼 脂糖( 每1L含蛋白胨1 0g, 酵母浸出物 5g , 氯化钠 5g , 琼脂糖 6g , 高压灭菌) 混匀, 铺L B平板, 计数平 板上的噬斑数并计算c D NA文库的原始库容量。 1. 9 c D N A原始文库的扩增 按每0. 2 5m L宿主菌(Q6 0 0n mi1. 0) 与11 0 5 个噬菌体的比例, 将原包装菌液全部铺H琼脂平板 ( 每1L含蛋白胨1 0g, 氯化钠8g, 琼脂1 5g, 高压 灭菌) , 加1 0m LS M, 置4过夜培养, 收集培养液 于新管中, 加0

16、. 5m L氯仿摇匀, 30 0 0r/m i n离心5 m i n, 将上清液移到新管中, 铺板测定扩增后的滴 度。加DMS O至终浓度为7 0m L/L, 分装保存于 -7 0。 1. 1 0 c D N A文库的P C R鉴定 从测定c D NA文库库容量的平板上随机挑取 单噬斑5 0个, 分别加入2 5LS M溶液中, 室温放 置2h, 沸水浴5m i n, 分别取2L作为模板, 用 S C R E E N - 1载体S P 6启动子和T 7终止子特异性引 物进行P C R扩增。扩增条件为9 4预变性3m i n; 9 41m i n,5 5 1m i n,7 2 2m i n,3 5

17、个循环后 7 2延伸6m i n。最后用琼脂糖凝胶电泳检测重组 率和插入片段的大小。 2 结果 2. 1 总R N A的提取 经 微 量 核 酸 蛋 白 检 测 仪 检 测,总R NA的 Q2 6 0n m/Q2 8 0n mi1. 9,于琼脂糖凝胶中电泳后可看 到总R NA条带( 见图1) 。 图1 微小牛蜱总R N A的电泳 F i g . 1 A n a l y s i so f t h e t o t a lR N Af r o mB o o p h i l u s i c r o p l u s 2. 2 c D N A的电泳 合成的双链c D NA经琼脂糖凝胶电泳, 可观察 到分布

18、在1 0 020 0 0b p的条带, 而且纯化后的 c D NA片段在3 0 0b p以上( 见图2) 。 2. 3 c D N A原始文库的库容量及扩增后的滴度 将包装 后 的 噬 菌 体 液 用S M稀 释 至 适 当 浓 599 第1 2期 李文卉等: 微小牛蜱幼蜱c D NA表达文库的构建 图2 微小牛蜱c D N A的分析 F i g . 2 A n a l y s i so f t h ec D N Ao fB o o p h i l u s i c r o p l u s M. D NA分子质量标准;1.纯化前的c D NA;2.纯化后的c D NA M. D L 2 0 0

19、0D NA M a r k e r;1. T h eu n p u r i f i e dc D NA;2. T h ep u r i f i e d c D NA 度, 与相应的宿主菌混合铺板培养后, 根据平板上的 噬斑数计算库容量。结果显示, 所构建的微小牛蜱 幼蜱c D NA表达文库的原始库容量约为4. 51 0 5 P F U, 扩增后的滴度为7. 21 0 1 0P F U /m L。 2. 4 c D N A文库重组率和插入片段的测定 对随机挑取的5 0个噬菌斑进行P C R鉴定, 此 文库的重组率为9 8%, 插入片段为0. 42. 0k b。 3 讨论 3. 1 F u e n

20、 t e等 9成功构建了微小牛蜱孵育期的卵 胚胎基因组文库和幼蜱c D NA文库, 琼脂糖凝胶电 泳分析表明微小牛蜱总R NA与其他真核生物总 R NA有所 不 同, 类 似 于 部 分 降 解 的 真 核 生 物 总 R NA; 从微小牛蜱不同发育阶段( 胚胎、 幼虫、 若虫) 分别提取的总R NA电泳后都得到相似结果; 但 N o r t h e r n - b l o t t i n g分析证明, 总R NA未发生降解。 本研究以人工饲养传代培养的微小牛蜱幼蜱为材 料, 提取的总R NA电泳结果也证实有此现象。微 小牛蜱总R NA的异常迁移可能与其核糖体R NA 的某些特性有关。 3.

21、2 在构建c D NA表达文库的过程中, 选用 O l i g o ( d T) 纤维素纯化R NA时, 所得P o l y A+R NA是 mR NA的 典 型 代 表, 保 证 了c D NA合 成 的 有 效 性 1 0。在c D NA过柱分离时, 根据分子质量大小分 管收集c D NA, 选择分子质量大的c D NA, 可提高文 库全长c D NA克隆的比例, 减少筛选工作量, 增加 了从文库中筛选出重要功能基因克隆的可能性。 3. 3 本研究构建的c D NA表达文库原始库容量为 4. 51 0 5P F U, 理论上讲, 这样的库容量可以涵盖 与重要功能蛋白相对应的稀有mR NA的

22、克隆, 而且 可以对此表达文库直接进行免疫学筛选, 获得抗原 性基因。微小牛蜱幼蜱c D NA表达文库的成功构 建对功能性抗原的克隆和微小牛蜱生理生化特性的 研究具有重要意义。 参考文献( R e f e r e n c e s) 1 邓国藩, 姜在阶.中国经济昆虫志( 蜱螨亚纲硬蜱 科)M.北京: 科学出版社, 1 9 9 1. D e n gGF,J i a n gZJ . E c o n o m i c I n s e c tF a u n ao fC h i n a, A c a r i:I x o d i a t eM.B e i j i n g:S c i e n c eP r e

23、 s s,1 9 9 1.(i n C h i n e s e) 2 吕文顺, 殷宏, 余丰, 等.微小牛蜱对牛巴贝西虫和双 芽巴贝西虫 传 播 能 力 的 研 究 J.中 国 兽 医 科 技, 1 9 8 9, (7) :1 0 - 1 1. L jWS,Y i nH,Y uF,e ta l. S t u d i e so nt r a n s m i s s i o n a b i l i t yo fB a b e s i ab o v i sa n dB.b i g e m i n a b y B o o p h i l u s m i c r o p l u sJ. C h i n

24、e s eJ o u r n a lo fV e t e r i n a r yS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y,1 9 8 9, (7) :1 0 - 1 1. ( i nC h i n e s e) 3 W i l l a d s e nP,B i r dP,C o b o nGS, e t a l.C o mm e r i a l i s a - t i o no f a r e c o m b i n a n t v a c c i n e a g a i n s tB o o p h i l u sm i c r o - p l u sJ

25、. P a r a s i t o l o g y,1 9 9 5,1 1 0(S) :4 3 - 5 0. 4 R o d r i g u e zM,P e n i c h e tM L,M o u r i sAE, e t a l. C o n - t r o l o fB o o p h i l u sm i r c o p l u sp o p u l a t i o n i ng r a z i n gc a t t l e v a c c i n a t e dw i t har e c o m b i n a n tB m 8 6a n t i g e np r e p a r

26、a - t i o nJ.V e tP a r a s i t o l,1 9 9 5,5 7:3 3 9 - 3 4 9. 5 C a n a l e sM,E n r p q u e zA,R a m o sE,e t a l. L a r g es c a l e p r o d u c t i o ni nP i c h i ap a s t o r i so ft h er e c o m b i n a n tv a c - c i n eG a v a c TMa g a i n s t c a t t l e t i c k J. V a c c i n e,1 9 9 7,1

27、 5: 4 1 4 - 4 2 2. 6 G a r c p a - G a r c p aJC,M o n t e r oC,R e d o n d oM,e t a l. C o n t r o l o ft i c k sr e s i s t a n tt oi mm u n i z a t i o nw i t hB m 8 6 i nc a t t l ev a c c i n a t e dw i t ht h e r e c o m b i n a n t a n t i g e nB m 9 5 i s o l a t e d f r o mt h e c a t t l e

28、 t i c k,B o o p h i l u sm i c r o p l u sJ. V a c c i n e,2 0 0 0,1 8:2 2 7 5 - 2 2 8 7. 7 R i d i n gG A,J a r m e yJ,M c k e n n aR V,e t a l.Ap r o - t e c t i v ec o n c e a l e da n t i g e nf r o mB o o p h i l u sm i c r o p l u s: p u r i f i c a t i o n,l o c a l i z a t i o n,a n dp o s

29、s i b l ef u n c t i o n J. T h eJ o u r n a l o f I mm u n o l o g y,1 9 9 4,1 5 3:5 1 5 8 - 5 1 6 6. 8 W i l l a d s e nP,S m i t hD,C o b o nG,e t a l. C o m p a r a t i v e v a c c i n a t i o no fc a t t l ea g a i n s tB o o p h i l u sm i c r o p l u sw i t h r e c o m b i n a n ta n t i g e

30、n B m 8 6 a l o n e o ri n c o m b i n a t i o n w i t hr e c o m b i n a n tB m 9 1J. P a r a s i t eI mm u n o l o g y, 1 9 9 6,1 8:2 4 1 - 2 4 6. 9 d e l aF u e n t eJ .R e c o m b i n a n tV a c c i n e sf o rt h eC o n t r o l o fC a t t l eT i c kM.H a v a n a:E l f o sS c i e n t i a e,1 9 9

31、5. 1 0 H o r r iT,B z i kDJ,I n s e l b u r gJ,e t a l. C h a r a c t e r i z a - t i o no fa n t i g e n - e x p r e s s i n gP l a s m o d i u m f a l c i p a r u m c D NAc l o n e s t h a t a r e r e a c t i v ew i t hp a r a s i t e i n h i b i t o r y a n t i b o d i e sJ.M o lB i o c h e mP a r a s i t o l,1 9 8 8,3 0(1) : 9 - 1 8. 699 中国兽医科技第3 5卷