急性坏死性胰腺炎继发感染的幼猪模型建立.pdf

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1、急性坏死性胰腺炎继发感染的幼猪 模型建立 汪建华邵成伟左长京郑建明 张庆张峰孙高峰都骏 【摘要】 目的建立适合影像学研究的大动物A N P 继发感染模型。方法将3 0 只幼猪分为实验 组( 2 0 只) 与对照组( 1 0 只) 。先采用主胰管逆行插管注射5 牛磺胆酸钠和5 胰蛋白酶混合液( 0 5 m l k g 体重) 制备A N P 模型，并将主胰管近端结扎。2 3d 后采用C T 引导下细针穿刺技术向胰腺坏死 区内注射大肠杆菌( 1 0 8 m 1 ) 3 - 4m l ，对照组注入灭活大肠杆菌。制模后行多层螺旋C T 增强扫描，并行 C T S I 评分。检测血W B C 、血淀粉酶

2、，做血液细菌培养。注射大肠杆菌后5d 处死动物，于感染灶或坏死 灶处抽液涂片及细菌培养，周围组织常规病理检测。结果实验组A N P 继发感染成功率8 0 0 ( 1 6 2 0 ) ，共发现1 7 处感染灶，感染灶细菌培养阳性率1 0 0 ( 1 7 1 7 ) ，血培养阳性率6 8 8 ( 1 1 1 6 ) ；对照 组制模成功率7 0 O ( 7 1 0 ) ，剔除1 头污染外，仅发现l 处感染灶，细菌培养及血培养阳性率均为1 4 3 ( 1 7 ) 。两组血W B C 及淀粉酶在制模后均明显升高，变化趋势相似，但实验组血W B C 明显高于同期对照 组( P 4 分，严重程度均为中重度。

3、结论在建立A N P 模型基础上采用c T 引导下向坏死区内注射细菌的方法可成功建立A N P 继发感染大动物模型，尤其适合影像学研究。 【关键词】胰腺炎，急性坏死性；感染；模型，动物；体层摄影术，x 线计算机 E s t a b l i s h m e n to fy o u n gp i gm o d e lo fs e c o n d a r yi n f e c t i o no fa c u t en e c r o t i z i n gp a n c r e a t i t i sW A N Gf l a n - h u a ，S H A OC h e n g w e i ，Z

4、U OC h a n g - j i n g ，Z H E N G 肛，l 一蒯n g ，Z H A N GQ i n g ，Z H A N Gn ，l g ，S U NG a o 毋t a g 。 H A O 儿m D e p a r t m e n to fR a d i o l o g ya n dN u c l e a rM e d i c i n e ，C h a n g h a iH o s p i t a l ，S e c o n dM i l i t a r yM e d i c a l U n i v e r s i t y ，S h a n g h a i2 0 0 4 3

5、 3 ，C h i n a C o r r e s p o n d i n ga u t h o r ：Z U Oc h a n g - j i n g ，E m a i l ：w o x i n g w s i n s c o m ，c w s h a o s i n a c o r n 【A b s t r a c t 】 O b j e c t i v e T oe s t a b l i s hab i ga n i m a lm o d e lo fs e c o n d a r yi n f e c t i o no fa c u t en e c r o t i z i n g

6、p a n c r e a t i t i s ( A N P ) M e t h o d sT h i r t yy o u n gp i g sw e r ea l l o c a t e dt oe x p e r i m e n tg r o u p ( n = 2 0 ) o rc o n t r o l g r o u p ( n = 1 0 ) ，I I l eA N Pm o d e lw a si n d u c e db yr e t r o g r a d ei n j e c t i o no fam i x t u r es o l u t i o no f5 s o

7、 d i u m t a u r o c h o l a t ea n d5 t r y p s i n ( O 5m l k gb o d yw e i s h t ) i n t ot h em a i np a n c r e a t i cd u c ta n dl i g a t i o no ft h e p r o x i m a le n do ft h em a i np a n c r e a t i cd u c t ，a n dt h e nt h es e c o n ds t e pW $ 8i n j e c t i n g3 4m ll i v i n gE s

8、 c h e r i c h i a c o l i ( Ec o i l ) s u s p e n s i o n ( 1 0 8 m 1 ) t ot h en e c r o t i ca r e ao ft h ep a n c r e a sb yf i n en e e d l ea s p i r a t i o nt e c h n i q u e u n d e rC Tg u i d a n c ei nt h ee x p e r i m e n tg r o u p ，a n db yi n j e c t i n g3 4r a li n a c t i v a t

9、 e dEc o i l i nt h ec o n t r o lg r o u p u s i n gt h es a m em e t h o d M u l t i - s l i c es p i r a lC Td y n a m i ce n h a n c e dS C a nw a sp e r f o r m e di nb o t hg r o u p sld a ya n d 2o r3d a y sa f t e rA N Pm o d e l i n ga n d5d a y sa f t e rb a c t e r i a li n j e c t i o nt

10、 oc a l c u l a t et h eC T S Is c o r e S e r u ma m y l a s e b l o o dW B Cc o u n ta n db l o o db a c t e r i a lc u l t u r eW a sp e r f o r m e di nb o t hg r o u p s 5d a y sl a t e r t h ea n i m a l sw e r e s c a r i f i e dt oo b s e r v e 如i n f e c t e do rn e c r o s i sl o c i a n d

11、p e r f o r ms m e a r ，b a c t e r i a lc u l t u r ea n dp a t h o l o g i c e x a m i n a t i o n so ft h et i s s u ea r o u n dt h ei n f e c t e dO rn e c r o s i sl o c i R e s u l t s 耵1 eA N Ps e c o n d a r yi n f e c t i o nm o d e l w a ss u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e di n1 6

12、o ft h e2 0a n i m a l si nt h es t u d yg r o u p w i t has u c c e s sr a t eo ft h e8 0 0 ( 1 6 加) T h e r ew e r e1 7f o c iw h e r et h ep o s i t i v er a t eo fb a c t e r i a lc u l t U r ew a g1 0 0 ( 1 7 1 7f o c i ) ，a n dt h e s u c c e s sr a t eo fb l o o db a c t e r i a lc u l t u r

13、eW a s6 8 8 ( 11 1 6 ) I nt h ec o n t r o lg r o u p 。t h eA N Pm o d e lW a S - 3 6 5 论著 基金项目：国家自然科学基金( 3 0 5 7 0 5 3 5 ) ；上海市教委曙光计划基金( 0 6 S G 4 1 ) ；上海市卫生局科研基金( 2 0 0 7 J G 0 0 6 9 ，L J 0 6 0 0 6 ) 作者单位：2 0 0 4 3 3 上海，第二军医大学长海医院影像医学与核医学科( 汪建华、邵成伟、左长京、张庆、张峰、孙高峰) ，病理科( 郑建明) 普通外科( 郝骏) 通信作者：左长京，E m

14、a i l ：w o x i n g w s i n a c o l n 。c w s h a o s i n a c o r n 万方数据 e s t a b l i s h e ds u c c e s s f u l l yi n7o f1 0a n i m a l s ( 7 0 ) ，e x c e p tf o ro n ec 鹋eo fc o n t a m i n a t i o n ，o n l yo n ef o c iW a g i d e n t i f i e d ；t h ep o s i t i v er a t eo fb a c t e r i a lc u

15、l t u r ea n dt h eS u c c e s sr a t eo fb l o o db a c t e r i a lc u l t u r eW a g1 4 3 ( 1 7 ) S e r u ma m y l a s ea n dw h i t eb l o o dW B Cc o u n ti n c r e a s e dw i t hs i m i l a rt r e n d s ，W B Cc o u n ti nt h es t u d yg r o u pW a g s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt

16、h a ti nt h ec o n t r o lg r o u p ( 尸 0 0 1 ) T h en 咖C Ts e v e r i t yi n d e x ( C T S I ) W a ga l l 4 i nb o t hg r o u p s ，i n d i c a t i n gt h es e v e r i t yW a sm o d e r a t et os e v e r e C o n c l u s i o n sAs t a b l ea n dr e l i a b l em o d e lo f s e c o n d a r yi n f e c t

17、 i o no fA N Pi nb i gc o u l db ee s t a b l i s h e ds a t i s f a c t o r i l yb yi n j e c t i n g a c t i v eE c o l ii n t ot h e p a n c r e a t i cn e c r o s i st i s s u eu n d e rC Tg u i d a n c e ，w h i c hh e l p sf u r t h e rp a t h o g e n i cm e c h a n i s ms t u d i e sa n dc l i

18、 n i c a l s t u d i e s ，e s p e c i a l l yi m 晒n gs t u d i e s 【K e yw o r d s 】P a n c r e a t i t i s ，a c u t en e c m t i z i n g ；I i n f e e t i o n ； A n i m a lm o d e l ；T o m o g r a p h y ，x r a y c o m p u t e d 继发感染是S A P 治疗中最为棘手的问题之 一。因而，建立A N P 继发感染模型对研究S A P 诊治具有重要价值。周蒙滔等【2 1 采用牛

19、磺胆酸钠 混合大肠杆菌逆行胰管注射法建立大鼠A N P 感染 模型。本实验采用“两步法”，即在建立A N P 模型基 础上，采用C T 引导下细针穿刺技术向胰腺坏死区 内注射大肠杆菌的方法建立A N P 继发感染的幼猪 模型，现报道如下。 材料与方法 一、动物模型制备及分组 雌性金山枫泾幼猪( 太湖种系) 3 0 只，由第二军 医大学实验动物中心提供，体重2 0 一2 5k g 。先适应 性饲养1 周，实验前禁食2 4h ，术前4h 禁水。实验 组2 0 头，对照组1 0 头。 先肌内注射盐酸氯胺酮，后静脉滴注枸橼酸芬 太尼( 0 1m l k g 体重) 及盐酸氯胺酮( O 1m l k g

20、 体 重) 麻醉动物，并间断静脉注射1 2m l3 戊巴比 妥维持麻醉。术中气管插管，并全程心电监护。 常规备皮、消毒、铺巾。正中开腹后于主胰管开 口附近( 距幽门约9 1 5c m ) 处沿十二指肠纵轴切 开肠管，在胆总管开E l 远端5 9c m 处寻找到主胰 管的开E l 。然后用圆头深静脉留置软导管( 直径 lm m ) 自乳头插管进入胰管，采用5 牛磺胆酸钠 和5 胰蛋白酶混合液( 0 5m l k g 体重) 快速注射。 肉眼可见胰腺由水肿、苍白色转为淡黄色，最后部分 呈黑色，胰腺包膜肿胀，胰周产生渗出液( 图1 ) 。维 持3r a i n 后快速退出导管，同时结扎胰管近端。制

21、模后行c T 扫描，以确定A N P 模型制作情况并对其 严重程度进行评分。当C T 明确胰腺有坏死灶后， 在C T 引导下向胰腺坏死区穿刺注射大肠杆菌悬液 3 4I l l l ( 1 0 8 个m l ，第二军医大学微生物实验室提 供) ，对照组注入灭活大肠杆菌( 2 1 磅，3 0m i n ) 。 圈l主胰管注射磺胆酸钠与胰蛋白酶混合液后， 胰腺组织水肿，色泽变黑色( 粗箭) 。 二、观察指标 1 实验室检查：制模前、制模后1h 、2 4h 以及注 射大肠杆菌后1d 、5d 分别检测血W B C 和淀粉酶。 注射大肠杆菌后1d 取血做细菌培养。 2 C T 检查：采用S i m e n

22、 sS e n s a t i o n C a r d i a c6 4 层 螺旋C T 机行平扫加动态增强3 期扫描。扫描参 数：1 2 0k V ，1 1 0m A ，层厚3m m ，对比剂为U h r a v i s t ( 3 0 0m gI m 1 ) ，1 5m l k g 体重，注射速率2i n l s ，3 期增强扫描时间分别为注射对比剂后延迟1 5s 、 3 5s 和4 58 。于A N P 制模后1d 、2 或3d 以及注菌 后5d 行3 次C T 。由3 位有经验的影像科医师采用 单盲法对C T 图像进行分析。应用C T 严重度指数 ( C Ts e v e r i t

23、yi n d e x ，C T S I ) 评估A P 严重程度旧J 。 3 病理检查及细菌培养：注射大肠杆菌后5d 经静脉空气栓塞处死动物。完整切取胰腺，观察胰 腺大体病理变化，于感染灶或坏死灶抽液做细菌涂 片、培养。固定标本，常规病理检查。细菌性感染的 诊断标准：( 1 ) 符合A N P 病理诊断标准；( 2 ) 胰腺有 急性化脓性炎症；( 3 ) 坏死区涂片，细菌培养阳性。 由l 位有经验的病理学专家盲法诊断。 万方数据 三、统计学分析 计量数据以孟s 表示，先行正态性检验，正态 资料进行方差齐性检验，方差齐性者采用t 检验。 非正态性资料及方差不齐者采用非参数W i l c o x

24、o n 秩和检验。重复测量数据采用多变量方差分析 ( M A N O V A ) 。计数资料采用x 2 检验。统计软件为 S A S S 软件。P 0 0 5 认为差异有统计学意义。 结果 一、制模成功率 实验组3 头猪死亡，1 7 头建立A N P 模型，其中 中度1 2 头，重度5 头。1 7 头A N P 中，l 头因多器官 功能障碍综合征( M O D S ) 死亡，未完成检查，余1 6 头建立A N P 继发感染模型，共发现1 7 处感染灶，制 模成功率8 0 0 ( 1 6 2 0 ) 。对照组2 头死亡，8 头建 立A N P 模型，其中中度5 头，重度3 头。8 头A N P

25、中1 头因M O D S 死亡，未注射细菌，制模成功率 7 0 0 ( 7 1 0 ) 。 二、血W B C 及淀粉酶含量变化 两组血W B C 于制模后lh 均开始升高，注射大 肠杆菌后1d 、5d 实验组W B C 明显高于同期对照 组( P 0 0 1 ) 。两组血清淀粉酶于制模后逐渐升 高，变化趋势相似，但注射大肠杆菌后1d 实验组血 清淀粉酶明显高于对照组( 表1 ) 。 三、C T 图像改变 3 次C T 扫描均见胰腺明显肿大，胰周积液较 多，部分胰周、腹腔可见手术残留小气泡，但制模后 ld 的C T 对胰腺水肿区与坏死区鉴别困难。2 或 3d 的增强C T 见胰腺水肿区强化值升高

26、，与未强化 的坏死区分界清楚，3 名阅片者的C T s l 分值一致性 好。注射细菌5d 后，实验组C T 示胰腺密度不均， 胰腺实质内无强化区范围较前增大，感染灶可见小 气泡，气泡征出现率1 8 8 ( 3 1 6 ) ，手术残留气泡 吸收。对照组C T 示胰腺密度不均，胰腺实质内无 强化区范围较前相仿或略有缩小，胰周积液明显吸 收，手术残留气泡吸收。两组3 次C T S I 评分均4 分，严重程度均为中、重度。 四、病理改变及细菌培养 实验组开腹后见胃肠道扩张积气，部分腹腔内 有血性腹水，胰腺与周围组织严重黏连，肠系膜、网 膜、胰腺表面可见钙灶形成。胰腺大片出血、坏死， 部分表面可见多量脓

27、苔附着，胰腺横断面见出血坏 死区呈点状或片状，暗红色，坏死区呈豆腐渣样改 变，感染区呈黄色化脓性病灶，部分有不完整脓肿壁 形成( 图2 ) ，横断面见浓液流出。镜下示胰腺感染 灶中央大部分液化坏死，脂肪细胞胞质内见伊红染 色无结构物质，少数凝固性坏死。部分感染灶可见 完整或不完整脓肿壁，伴大量中性粒细胞浸润( 图 3 ) 。邻近感染灶的胰腺组织可见灶性坏死及点片 状出血，部分腺泡坏死后形成红染无结构物质，少量 中性粒细胞浸润及多核巨细胞聚集。1 7 处感染灶 细菌培养阳性率1 0 0 ，1 处为大肠杆菌与练球菌混 合感染，其余均为单纯大肠杆菌感染。1 l 头猪血培 养阳性，阳性率6 8 8 。

28、 对照组胰腺与周围组织有轻中度黏连，胰腺出 血坏死，肠系膜、网膜、胰腺表面可见钙灶形成。镜 下见胰腺组织液化坏死，间质疏松水肿，少量炎细胞 浸润及多核巨细胞聚集。对照组1 头猪有小脓肿形 成，浓液培养为金黄色葡萄球菌，阳性率1 4 3 。 余6 头猪坏死灶及血液细菌培养均阴性。 表1 血W B C 和血清淀粉酶含量变化( 孟s ) 注：与对照组比较，一P ( O O l ；与同组注射细菌后比较，。P 0 0 1 万方数据 圈2 离体胰腺大体标本横断剖面可见黄色化脓性病灶，周 围不完整薄壁形成( 细箭) ，内见脓液图3 胰腺坏死灶中 央胰腺组织及脂肪组织液化性坏死( 细箭) ，周围可见纤维 组织

29、及血管增生，形成不完整脓肿壁( 粗箭) ，伴较多中性粒 细胞浸润( H E 1 0 0 ) 讨论 肠道菌群易位是S A P 继发细菌感染的主要途 径之一【4J 。革兰阴性菌是大部分胰腺及其周围组 织感染的“元凶”J ，单菌感染以大肠杆菌为主帕J 。 因此，本实验选择大肠杆菌作为致病菌。 胰腺坏死组织细菌感染主要有3 个途径：淋巴、 血液和跨黏膜直接感染J 。应用C T 引导下细针穿 刺技术将大肠杆菌悬着液注入胰腺炎坏死组织制做 继发感染模型基本符合临床感染途径。 本法与牛磺胆酸钠混合大肠杆菌逆行胰管同时 注射法制模相比，具有以下优点：( 1 ) 可有效防止牛 磺胆酸钠抑制和杀灭大肠杆菌的作用旧

30、1 ；( 2 ) 注人 大肠杆菌既准确，又微创；( 3 ) 模型稳定性好，成功 率高，动物存活时间长。而且猪的胰腺在解剖位置、 大体形态及C T 表现等方面均与人极其相似，尤其 适合影像学研究。 通过本实验研究，我们体会到在制模时需注意 几个关键环节：( 1 ) 药物的选择及其浓度与剂量。 我们在预实验中发现单纯牛磺胆酸钠所致的幼猪胰 腺炎较轻，不符合A N P 病理改变。本实验注射5 的牛磺胆酸钠与胰蛋白酶混合溶液成功诱发猪的 A N P ，这可能与大动物较小动物耐受性强有关。 ( 2 ) 胰管梗阻及压力。本实验结扎主胰管近端，一 方面可防止药物排泄，延长药物作用时间；另一方面 可增加胰管压

31、力，加快药物弥散，从而加重A N P 严 重程度。( 3 ) 细菌注射时间及剂量。为了保证细菌 准确注射至坏死区，选择在A N P 模型建立后2 3d 内注射。周蒙滔等旧1 报道，诱发大鼠感染性A N P 时 大肠杆菌适宜浓度为1 0 4 爪m l 。在预实验中，我们 向猪的胰腺坏死区分别注射浓度为1 0 4 爪r I l l 、1 0 6 何m l 及1 0 8 个“大肠杆菌3 4r I d ，发现浓度为 1 0 8 爪I I l l 时感染效果最佳。这可能与大动物的免 疫力和抵抗力明显强于小动物有关。( 4 ) 靶区与穿 刺路径。文献报道胰腺炎继发感染的部位多位于腹 腔、胰腺坏死区等【9

32、。而猪的胰腺及其周围结构与 人类类似0 I ，胰体、尾部位是胃肠道菌群易位继发 胰腺感染的好发部位之一；此外胰体、尾部距离体表 近，实施C T 引导下穿刺相对简单，损伤小，故本实 验选择胰体、尾部坏死区作为感染靶区。本实验组 中l 头猪胰腺坏死灶为大肠杆菌与链球菌混合感 染，对照组1 头猪为金葡菌感染，这与无菌操作不严 密及穿刺针经过肠管有关，因此，穿刺时应严格无菌 操作及避开肠管，以免带人细菌。( 5 ) 麻醉与监护。 本实验模型动物是大动物幼猪，麻醉方法不同于大 鼠，麻醉药物的剂量与配伍极其关键。在开腹手术 中，我们采用气管插管、心电监护等的措施，有效地 降低了动物的死亡率。 总之，本法建

33、立的A N P 继发感染大动物模型的 成功率高，稳定性好，可为临床研究该病发病机制及 其诊治提供良好的平台。同时，由于大动物猪的胰 腺体积大，无论解剖位置、形态结构还是影像表现均 与人类胰腺十分相似，因此该模型尤其适合影像学 研究。 参考文献 1 A s h l e yS W ，P e r e zA ，P i e f c eE A ，e ta 1 N e e m t i z i n gp a n c r e a t i t i s ： c o n t e m p o r a r ya n a l y s i so f9 9c o n s e c u t i v ec a s e s A n n

34、S u r g 。2 0 0 1 ， 2 3 4 ：5 7 2 - 5 7 9 2 周蒙滔张启瑜，邱燕军，等牛磺胆酸钠混合大肠杆菌逆行 胰管注射法建立感染性坏死性胰腺炎大鼠模型中华肝胆外 科杂志，2 0 0 6 1 2 ：4 5 9 - 4 6 2 3 B a l t h a z a rE J ，F t t e n yP C ，v 蚰S o n n e n b e r gE 1 m a g i n ga n d i n t e r v e n t i o ni na c u t ep a n e r e a t i t i s R a d i o l o g y 1 9 9 4 1 9 3 ：

35、2 9 7 - 3 0 6 4 R a t s c h k oM 。F e n n e rT ，L 丑n k i s c hP G T h er o l eo fa n t i b i o t i c p r o p h y l a x i si nt h e t r e a t m e n to fa c u t ep a n e r e a t i t i s G a s t r o e n t e r o l C l i nN o a hA m ，1 9 9 9 2 8 ：6 4 1 - 6 5 9 5 刘岩，路筝。李兆申，等重症急性胰腺炎继发感染及其防治： 3 1 0 例分析胃肠病学2

36、 0 0 6 1I ：5 8 4 - 5 9 7 6 B e g e rH G ，l s e n m a n nR S u r g j c 且lm a n a g e m e n to fn e c m t i z i n g p a n e r e a t i t i s S u r gC l i nN o r t hA m ，1 9 9 9 ，7 9 ：7 8 3 - 8 0 0 7 黄晓曦，王兴鹏重症急性胰腺炎坏死胰腺组织感染的机制 及其防治胃肠病学，2 0 0 6 ，1 1 ：5 3 - 5 5 8 R u b i n s t e i nE ，M a r k zR E H a s p

37、e lJ A n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo ft h e p a n c r e a t i cf l u i d G a s t r o e n t e r o l o g y ，1 9 8 5 ，8 8 ：9 2 9 - 9 3 2 9 R i n d e r k n e c h tH F a t a 】p a n c r e a t i t i s ac o n s e q u e n c eo fe x c e s s i r e l e u k o c y t es t i m u l a t i o n ? I n tJP a n e r e a t o l 。1 9 8 8 。3 ：1 0 5 1 1 2 1 0 邵成伟，左长京，田建明，等正常猪胰腺c T 表现胰腺病学， 2 0 0 5 ，5 ：2 3 0 - 2 3 2 ( 收稿日期：2 0 0 8 - 0 6 1 9 ) ( 本文编辑：吕芳萍) 万方数据