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1、福建中医学院学报2 0 0 8 年8 月第1 8 卷第4 期 J o u m a lo f F u j i a nU n i v e r s i t yo f T C MA u g u s t2 0 ( ) 8 ，1 8 ( 4 ) 恒河猴促滤泡激素生物测定法的建立和应用 王训立 ( 福建中医学院实验动物中心，福建福州3 5 0 1 0 8 ) 摘要： 目的 建立恒河猴促滤泡激素( F s H ) 生物测定法。方法利用F s H 体外生物测定法， 测定了恒河猴血清中F S H 含量。 结果测定方法的灵敏度为O 0 2n g 管，批内和批间误差分别为 ( 2 5 3 1 2 5 ) 和( 4 0
2、 2 2 1 7 ) ，证明该方法准确性高；恒河猴血清中F s H 含量反应曲线和h F s H 标 准曲线平行良好，说明该方法可以用来检测恒河猴血清中的具有生物活性的F s H 变化，反映了动物 正常的生理状态；回收实验表明，在该测定方法中加入5n g 、1 0n g 、2 0n gh F s H 时的回收率分别为 ( 1 0 1 2 8 5 6 6 ) 、( 9 9 7 8 4 5 1 ) 、( 1 0 0 6 1 5 4 2 ) ，说明测定结果的可靠性。 结论本实验所建 立的F S H 体外生物测定法灵敏度高。稳定性强。 关键词：恒河猴：促滤泡激素；生物测定法 中图分类号：R 一3 3
3、2文献标识码：A文章编号：1 0 0 4 5 6 2 7 ( 2 0 0 8 ) 0 4 一0 0 2 8 0 3 现有的促滤泡激素( F S H ) 的测定方法都是针 对某种动物特异性的F S H 和其特异性抗体建立的 R I A 法每种方法只能测定一种动物的F S H 水平 特别在非人灵长类动物尚无商品化测定药盒，致 使该种类动物的生殖生物学研究受到了一定限制 【1 1 。高等动物的F s H 对低等动物有效性是生物学 中一个普遍存在的现象，说明F S H 受体具有较高 的同源保守性 2 1 。利用F S H 可以刺激睾丸S e r t o l i 细胞分泌雌二醇。建立一种适用于非人灵长类
4、动 物恒河猴聆H 的生物测定法。 1 材料与方法 1 1 实验动物S D 大鼠：2 0 只S D 大鼠由中国 科学院上海实验动物中心提供实验动物生产许 可证号：S C X K ( 沪) 2 0 0 3 0 0 0 3 ，实验用S D 大鼠需 要在实验室中饲养3 5d 后，进行实验。恒河 猴：6 0 只雌性恒河猴由福建省非人灵长类实验动 物重点实验室提供实验动物使用许可号：S Y X K ( 闽) 2 0 0 5 0 0 1 5 ，其中幼年组、成年组、老年组的恒 河猴各2 0 只。 1 2试剂 胶原酶、牛血清白蛋白( B S A ) 、雌二 醇、雄烯二酮、磷酸二酯酶抑制剂( M I X ) 购于
5、S i g m a 公司。M c C o v ，s 培养基购于G i b c o 公司。人促滤 泡激素( h F S H ) 标准品由中国科学院动物研究所张 崇理教授赠送( S i g m a 公司产品) ；雌二醇放射免疫 测定药盒为上海原子核研究所的产品。 1 3 动物血清的制备每天在8 ：0 0 9 ：0 0a m 之 间进行采集样品，每只动物均采血3m L ，血液于 4 静置lh 后。3 0 0 0r m i n 离心2m i n 。分离血清， 一2 0 冰箱。待所有样品收集后，集中测定。 1 4 大鼠睾丸支持细胞的制备根据F S H 可以 刺激大鼠睾丸S e n o l i 细胞分泌雌
6、二醇的作用，建 立F s H 体外生物测定法。将去除k y d i g 细胞后的 曲细精管经O 5 胶原酶3 5 消化2 0m i n 。待曲细 精管下沉后弃去上清液体，再经0 0 5 胶原酶、 3 5 恒温水浴摇床中振荡消化3 0m i n ，滤液经2 0 0 目尼龙网筛过滤、静置、离心。将得到的支持细胞 悬浮液。在2 4 孔培养板中，每孔加人支持细胞悬 浮液同时加入一定量新鲜的培养液，3 7 ，C O ：培 养箱中连续培养7 2h ；更换含有雄烯二酮( 1 0 。 I n o l L ) 和M I X ( 1 0 7I n o l L ) 的培养液，并加入含有 一定量的标准样品和待测定的样
7、品，3 7 、C O ：培 养箱中培养2 4h 。收集培养液待测。采用放射免疫 测定法测定培养液中的雌二醇含量，进而计算出 血清中F S H 的含量。 1 5 测定程序取2 0 只试管。l 2 号管为总记 数参考管，3 4 号管为非特异性结合管( 加入过 量的雌二醇) ，其余5 2 0 号管加入不同浓度的雌 二醇标准品。加样顺序及操作步骤如下：加缓 冲液，l 2 号管4 5 0 L L ，其余各管加3 5 0 恤L ； 除l 2 号管外。加不同浓度的标准品h C G1 0 0 L ；在冰浴( 4 ) 条件下，各管加雌二醇抗体5 0 斗L ；在冰浴( 4 ) 条件下，各管中加入3 H 一雌二 收
8、稿日期：2 0 0 8 0 3 1 5 基金项目：福建省科技计划重大专项( 9 6 L 1 0 ) 作者简介：王训立( 1 9 “一) ，男，副研究员，主要从事实验动物学、生殖生物学研究。 万方数据 第4 期王训立：恒河猴促滤泡激素生物测定法的建立和应用2 9 醇1 0 0 “L ( 约1 0 0 0 0c p m ) ，4 q c 冰箱保温2 4h ； 加入活性炭，4 离心1 5m i n ，收集上清液；( p 加 人5m L 闪烁液在计数仪中计数，测其每分钟衰 变率( d p m ) 数值。 1 6 数据分析根据特异性结合( S B ) 和非特异 性结合( N s B ) 以及未标记激素不
9、同浓度下的放射 计数制作出标准曲线，采用k g L o g i t 将标准曲线 直线化，并计算替换与抗体结合5 0 的标记激素 的未标记激素浓度( E C ) 和标准曲线的斜率及相 关系数。平均数及回归系数的差异显著性采用 S t u d e n tT 一检验。 2 结果 2 1 体外培养时间的确定 加入同样的I f L 清样 品进行培养，时间不同。对J 1 i L 清中F S H 测定的影 响。实验表明：每孑L 加入1m L 支持细胞制备液和 一定量的样品。选择浮育2 4h 最合适，此时所测 定的结果达到最大值，见图1 。 叫问( h ) 响 2 2 标准曲线的建立 2 2 1标准曲线为检验
10、所用方法是否适用于恒 河猴F s H 的测定。做了h F S H 标准品的剂量反应 曲线和恒河猴血清样品的剂量反应曲线的比较， 结果显示：h F S H 的剂量反应曲线与恒河猴的血清 样品的剂量反应曲线相平行。见图2 。 2 2 2 灵敏度根据每次测定的最高结合管为双 管，重复3 次，求平均值减去其2 倍标准差，差值 所对应的标准品含量为灵敏度。该法的灵敏度为 每管0 0 2n gF s H 。 2 2 3 精密度与重复性用同批次和不同批次试 验中h F S H 标准曲线各剂量点相对结合率的平均 变异系数。表示试验方法的精密度和重复性。批内 误差为( 2 5 3 1 2 5 ) ，批问误差为(
11、 4 0 2 2 1 7 ) 。 2 2 4准确性准确性是指样品的测定结果与样 标准样品( u I 。) 待测佯出( u l ，) 测定 样品剂量反应曲线的比较 品本身实际含量相符的程度。用h F s H 标准品加入 到S e r t o l i 细胞制备液( 1m L ) 连续培养7 2h ，测定 3 个剂量的h F S H 回收率，结果见表l 。 表1h F S H 回收率的测定( ，仁5 ) 2 3 成年雌性恒河猴月经周期F S H 的变化在 生殖季节，由于雌性恒河猴出现有规则的月经周 期F S H 的分泌出现规律性的变化。测定显示：在 月经周期的卵泡期F s H 分泌水平比较平稳。随着
12、 新的卵泡逐渐发育、成熟；在排卵期出现一个产生 排卵的F S H 峰值：在黄体期阶段始终保持在较低 的基线水平。结果见表2 。 表2 雌性恒河猴月经周期血清中F S H 的分泌水平 2 4 不同年龄组的雌性恒河猴血清中F S H 分泌 水平用F S H 生物测定法对不同年龄阶段的雌性 恒河猴外周血中F s H 分泌水平的测定：幼龄组 ( 1 0 4 2 1 8 5 ) n g m L ，成年组( 5 3 3 7 2 7 6 ) n g m L ，老龄组( 6 8 5 3 4 1 2 ) n g m L 。 3 讨论 F S H 是一种糖蛋白，其糖侧链末端的唾液酸 对保持其分子的生物活性起重要作
13、用 3 】。在生理 条件下垂体中F S H 的免疫活性与生物活性的比 值可能有所不同。在非人灵长类动物研究表明，青 万方数据 3 0 福建中医学院学报第1 8 卷 春发育期或去卵巢后，垂体F S H 分子结构和生物 活性都发生变化。但是，由于缺乏一种相对的灵 敏度高的测定具有生物活性的F S H 方法。对上述 F S H 分子水平上的变化以及这种变化的生理学意 义至今仍不十分清楚。 2 0 世纪6 0 年代以来。人们相继发展了多种 F S H 生物测定法。经典方法为S t e e l m a n 和P o h l e v 在1 9 6 3 年发展的在体测定法 5 】。为提高测定的灵 敏度，后来
14、又相继发展了多种在体生物测定法。这 些方法都是通过实验动物的卵巢、子宫或睾丸增 重来测定被测样品中的F S H 含量f 6 。由于上述测 定方法需要的样品量比较大，灵敏度较低，都不能 用来测定血液循环中的F S H 含量。 1 9 7 4 年。R e i c h e n 和B h a l l a 第一次发展了一 种体外生物测定法是用放射受体竞争结合法来 测定F s H 的生物活性。但是F S H 与其受体的结 合能力还不能完全代表激素的生物活性。实验证 明F s H 制品经某些处理后可保持其与受体的结 合力。但并不发挥生物学作用。随后，B e e r s 和 S t r i c k l a n
15、 d 根据F S H 可刺激培养的卵巢颗粒细胞 分泌纤蛋白溶酶原激活因子的作用。建立起了一 个体外F S H 的生物测定法 8J 。但是由于颗粒细胞 纤蛋白溶酶原激活因子的分泌不仅受飓H 的影 响。而且还受L H 和G n R H 的影响这项研究所得 的结果并不能反映F s H 的含量。 依据S e r t o l i 细胞对F S H 应答而产生雌二醇的 原理。近年来，我们用体外培养的S e n o l i 细胞作为 模型，建立了一种F s H 生物测定法 9 1 。并已把这一 方法成功地用于非灵长类动物恒河猴的J f I t 液中微 量F s H 的测定研究工作。本研究根据目前的条 件，以
16、h F S H 作参考标准。建立一种用S D 大鼠S e r - t o l i 细胞体外培养方法。测定恒河猴血清中F S H 的分泌水平。试验表明，本测定法的优点，不仅在 于能够作超微量分析而且能够揭示出恒河猴血 清F S H 分泌水平在生长不同时期的变化趋势。该 方法灵敏度高，稳定性强。 致谢：本研究得到中国科学院动物研究所庄 临之研究员福建省非人灵长类实验动物重点实 验室李志雄、周建华和范春梅同志的大力支持，特 此致谢。 参考文献： 1 S U N D A R A MK ，C H A N GCC ，L A U R E N C EKA ，e ta 1 1 1 l ee f - f e c
17、t i v e n e s si nr h e s u sm o n k e y so f8 na n I i f e n i l i t yv a c c i n eb 晒e d o nn e u t r a I i 明l i o no fc h 耐o n i cg o n a d o t m p i n J C o n t 塌c e p t i o n 1 9 7 6 ，1 4 ( 6 ) ：6 3 9 6 5 3 2 C A R L S S O NHE ，S C H A P I R OSJ ，F A R HI ，e ta 1 U s eo fP r i m a t e si nR e 冉
18、e a r ；c h ：AG l o b a lO v e r v i e w J A mJP r i 啪t o l ，2 0 0 4 ， 6 3 ( 4 ) ：2 2 5 - 2 2 9 3 S A K A ICN ，C H A N N I N GCP E v i d e n c ef o ra l t e r a t i o n 6i l l l u t e i n i z i n gh o 咖o n es e c r e t e d i nr h e s u sm o n k e y s “t hn o r m 8 l a I l di n a d e q u a t el u t e
19、a lp h a s e su s i n gr a d i o r e c e p t o ra n dm d i o i m - m u n o s a y J E n d o c r i n o l o g y ，1 9 7 9 。1 0 4 ( 5 ) ：1 2 1 7 一1 2 2 5 4 夏国良，付国栋，崔胜，等多种动物血清中生物活性L H C G 的放射受体测定法( R R A ) J 中国兽医学报，2 0 0 0 ，2 0 ( 1 ) ：5 l 一5 4 5 s T E E L M A NSL ，王) 0 H L E YFM A s s a yo ft h ef o l l i
20、 c l es t i m u h t i n gh o 珊o n eb a s e d 帅t h ea u g m e n t a t i o nw i t hh u m a nc h o r i o l l i c g o m d o l m p i n J E n d t ) c r i n o l o g y ，1 9 5 3 ，5 3 ( 6 ) ：6 0 4 6 1 0 6 S I E B E NS ，B E R G E M A N NC ，L U B B EA ，e ta 1 C o m p a r i s o n0 f d i f r e r e n tp a n i c l
21、e sa n dm e t h o d sf o rm 8 9 n e t i ci s o l a t i o n0 fc i r c u l a l i n gt u m o rc e U s J JM MM a t e r i a l s ，2 0 0 1 ，2 2 5 ( 1 ) ：1 7 5 1 7 9 7 J 1wU ，P E N E L O P EL ，N A Y U D U ，e ta 1 L u t e i n i z i n gh o 瑚o n e h 鹅as L a g e l i I I l i t e de f k c to np r e a n t r a lf 0
22、 U i c l ed e V e l o p m e n ti n V i t r o J B i o l o g yo fR e p r 喇u c t i o n ，2 0 0 0 ，6 3 ( 7 ) ：3 2 0 一3 2 7 8 B E E R swH ，s r l l R I C K L A N DS Ac e Uc I l l t u r ea s 铋yf o rf o u i c l e s t i m u l a “n gh o m o n e J JB i o lC h e m ，1 9 7 8 ，2 5 3 ( 1 1 ) ：3 8 7 7 3 8 8 3 9 王训立，周
23、建华，范春梅季节性变化对雌性恒河猴生殖功 能的影响【JJ 中国实验动物学报，2 0 0 2 ，1 0 ( 1 ) ：2 l 一2 6 B i o a s s a yo fF o l l i c l eS t i m u l a t i n gH o r m o n ei nS e r u mo fR h e s u sM o n k e y W A N GX u n l i ( L a b o r a t o r yA n i m a IC e n t e r ，F U T C M ，F u z h o u ，F u j i a n3 5 0 1 0 8 ，C h i n a ) A B S
24、T R A C T ： o b i e c t i v eT oe s t a b l i s hab i o a s s a yo ff o l l i c l es t i m u l a t i n gh o r m o n e ( F S l l ) i ns e r u mo f r h e s u sm o n k e y I V I e t l l o bT h eF S Hc o n t e n to ft h er h e s u sm o n k e yw a sm e a s u r e db yb i o a s s a yi nv i t r o R e s u l
25、t ST h es e n s i t i v i t vo ft h ea s s a yw a s0 0 2n g p e rt u b e ，t h ei n t r aa n di n t e ra s s a yv a r i a t i o n sw e r e ( 2 5 3 1 2 5 ) a n d ( 4 0 2 2 17 ) ；b o t ht h ed o s e r e s p o n s ec u r v eo fF S Hi ns e r u mo fr h e s u sm o n k e ya n dt h ec a l i b r a t i o n c u
26、 eo fh F S Ha r ei ng o o dl i n e a r i t yw h i c hr e n e c t e dt h ep h y s i o l o g i c a Is t a t u so ft h ea n i m a I s ；t h er e c o v e r a b l e r a t e so f5 ，1 0a n d2 0n gh F S Ha d d e dt ot h ed i l u t e dr a ms e r u mw e r e ( 1 0 1 2 8 5 6 6 ) ，( 9 9 7 8 4 5 1 ) a n d ( 1 0 0 6 1 5 4 2 ) r e s p e c t i V e l y C 伽c l I l s i o n卟eb i o a c t i V eF S Hl e V e li np i t u i t a r ye x t r a c ti s b yf a rh i g h e r t h a nt h a ti nc i r c u l a t i o n K E YW o R D S ：r h e s u sm o n k e v ：f o l l i c l es t j m u l a t i n gh o r m o n e ：b i o a s s a v 万方数据