小鼠生殖细胞体外分化与发育机制.pdf

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1、6 2 6 盏1 T 热I 燕I o 盏H 需L o 毋v 。1 1 9N 0 4J u l ，2 0 0 8 I E T T E R SI NB 1 0 T E C H N O L O G Y V o l 1 9I N o 4J uJ ，Z 0 0 8 文章编号：1 0 0 9 0 0 0 2 ( 2 0 0 8 ) 0 4 0 6 2 6 - 0 3 小鼠生殖细胞体外分化与发育机制 综述 谷朝勇1 ，李兰2 ，沈伟2 1 菏泽学院，山东菏泽2 7 4 0 0 0 ；2 青岛农业大学动物科技学院分子发育生物学实验室，山东青岛2 6 6 1 0 9 摘要】 小鼠作为发育机制的模式动物，其生殖细

2、胞分化与发育的研究一直是发育生物学研究的重点之一。主要综述了小 鼠原始生殖细胞的起源、迁移与增殖的机制，以及原始生殖细胞向生殖细胞的分化，卵母细胞与精子的发生与发育机理，讨 论了胚胎干细胞向生殖细胞体外诱导分化以及生殖细胞体外培养的应用前景。 关键词】小鼠；生殖细胞；分化；发育 中图分类号】Q 2 5 ；Q 4 9 2 文献标识码 A 砌W 加D i 舭r e n t i a t i o na n dD e v e l o p m e n t a lM e c h a n i s mo fM o l l s eG e 珊C e l l s G UC a 0 Y o n 窖，L lL c 口子，

3、s H E NW e 孑 1 H e z eC o l l e g e ，H e z e2 7 4 0 0 0 ； 2 C o u e g eo fA n i m a ls c i e n c e 粕dT e c h n o l o 趴Q i n g d a oA c u l t u m lu n i V e 碍i t ) r ，Q i n g d 2 6 6 1 0 9 ；C h i n a A b s 虹a c t 】T h er e s e a 尬ho fm o u s ef e t a lg e 硼c e U 8i s 粕i m p o r t a n tp a no ft h ed

4、e v e l o p m e n t a lb i o l o g y I nt h i sp a p e r t h e p r o 伊e s s i o no fm o u s ep r i 脚r d i a lg e 珊c e l l s ， t I l ed 赶b r e n t i a t i o nf 南mp r i m o r d i a lg e 珈c e l l st 0o o c ”ea n ds p e m l a t o z o a ， 山e 眦c h a n i s mo fo o g e n e 8 i s 粕ds p e m a t o g e n e s i

5、s ，锄dt h ea d v 阴c eo ft h em o u s ee m b r y o n i cs t e mc e l J sd i f f e r e n t i a t ei n t og e 肿 c e l l s 讥口豇r 0w e r e 托v i e w e d M o l e c u l a rr e g I l l a t i o np m c e s 8 e so fo o g e n e s i sa n d 印e m m t o g e n e s i sp r o v i d eac l u et om e c h 帅i s m o fg e 皿c e U

6、 sd i 雎r e n t i a t e df 南mp r i m o r d i a lg e 唧c e U 8o re l n b r y o n i cs t e mc e l l 8 1 【e yw o r d s 】m 锄m a l i 明；g e mc e l l s ；d i H e r e n t i a t i o n ；d e v e l 叩m e n t 当前生殖细胞体外发生的研究主要集中在3 个方面：一是 原始生殖细胞( P G C ) 的分离纯化与建系，以及卵母细胞体外分化 的分子调控机理；二是精原干细胞的分离纯化与建系，以及精子 发生相关基因的功能研究；三是胚胎

7、干细胞( E S 细胞) 向生殖细 胞的体外诱导分化。从国内外的研究进展看，卵母细胞的体外成 熟研究已经相对深入，技术也相对成熟，但发育早期的研究还有 待进一步深入，这主要在于P G C 或E S 细胞体外分化的卵母细 胞不能进行有效的减数分裂，即使得到了M 期卵母细胞，也仅 能进行孤雌发育而不能进行体外受精等。这说明这蝗卵母细胞 的某些特殊基因还没有得到正常的表达或一些蛋白因子没有被 激活，致使这些卵母细胞不具有体内发育的正常卵母细胞的功 能。另有研究表明，与E S 细胞相比，P G C 具有与生殖细胞更接近 的基因组D N A 的甲基化模式，因此就更易分化形成生殖细胞， 但P ( 咒体外分

8、化的卵母细胞也很难完成整个减数分裂过程。由 此可见，现今卵母细胞分化研究的重点在体外分化形成的卵母 细胞的核质成熟上，即卵母细胞能正常减数分裂并支持胚胎发 育的能力。另外，哺乳动物精原干细胞建系的成功率仍然很低， 并且在一种品系动物七建立的精原干细胞( S S C ) 建系技术不能 在其他品系动物上使用。而且精子完全的体外发生还很难达到， 这些都需要进一步研究探讨。 l 生殖细胞的前体细胞与生殖细胞决定的机制 嵌合体实验证明，P G C 来源于早期胚胎中的上胚层细胞，4 5 d p c ( 交配后天数) 的单个上胚层细胞可同时形成体细胞和生殖 细胞【l J 。科学家曾通过单细胞克隆分析的方法，

9、证明胚胎中P G C 的前体细胞位于上胚层中靠近胚外外胚层的位置( 称近端位 置) ，而且随着上胚层细胞的增殖向原条后端移动，并于原肠胚 形成早期通过原条进入胚外中胚层。单细胞克隆分析的结果还 表明，P G C 前体细胞不仅参与P G C 的形成，还大量形成胚外中胚 层细胞，证明原肠胚形成前生殖细胞系还没有被决定，因而没有 与体细胞系分离开来。L a w n 利用上胚层细胞与P ( 圮倍增时间 不同的原理进行了计算，得出如下结论：确定P G C 的时间是7 2 d p c ，即中原条期，与利用碱性磷酸酶活性最早检测到P G C 的时 间一致；P G C 决定时的起始群体大小约为4 5 个细胞。

10、 1 9 9 6 年，T a m 等巧妙地利用胚胎移植实验研究了小鼠上胚 层细胞的发育潜能。他们发现，前原条期和早原条期的上胚层细 胞不论来自胚胎的哪个位置，都将与移植后所处位置周围的细 胞同样发育，即不论上胚层近端或远端的细胞，移植到近端位置 则都可能形成P G C 。由此证明，原肠胚形成早期的所有上胚层细 胞都具有相似的发育潜能，是由细胞所处的位置决定其发育方 向；而且在早期小鼠胚胎中并不存在预先决定的生殖细胞系，生 殖细胞的特化町能受到局部组织间相互作用和原肠胚形成时上 【收稿日期 2 0 0 7 一0 8 2 1 基金项目】国家重点基础研究发展计划( 2 0 0 7 C B 9 4 7

11、 4 0 1 ) ；国家自然科 学基金( 3 0 7 0 0 4 2 2 ) ；青岛市科技汁划( 0 6 2 2 一l l - j c h ) ；青 岛农业大学高层次人才启动基金( 6 3 0 6 1 5 ) 作者简介 谷朝勇( 1 9 7 4 一) ，男，硕士，助理研究员 通讯作者 沈伟，( E m a i l ) 8 h e n w e i 4 2 7 1 6 3 c o m 万方数据 谷朝勇等：小鼠生殖细胞体外分化与发育机制6 2 7 胚层组织的形态建成运动的影响。 2 原始生殖细胞的迁移与增殖 很多动物的原始生殖细胞都不是直接在生殖腺原基中形成 的，而是在生殖腺以外的区域起源，通常都是

12、起源于胚胎的边缘 区域，随后沿着一定的路线迁移到生殖腺中。小鼠的生殖细胞也 是如此，当P G c 前体通过原条进入胚外中胚层并被决定后，就开 始了向生殖嵴迁移的旅程。P G C 于体外起源可能是为了使P G C 不致受到体细胞分化的影响，以便保持其伞能性。另外，生殖细 胞在进化上的出现早于生殖腺，在无牛殖腺的动物体内，生殖细 胞在配子形成过程中一直在不断地迁移，以便更好地吸收营养， 促进其生长。高等动物中P G C 的迁移町能也是一种进化过程中 的原始特性的反映。P G C 的迁移可能还有助于从种系中剔除不 正常的细胞嘲。 小鼠P G C 的迁移过程可分为2 个阶段：第1 个阶段，P G C

13、从原条的后端。也是正在形成的后肠所处区域，随着后肠的内卷 被带进胚胎内部，并到达后肠内胚层。这时它们是被动地卷入后 肠的形态建成运动。第2 个阶段，P G C 离开后肠内胚层，沿着背 肠系膜运动，最终进入生殖嵴。这一时期的P G C 具有伪足等特征 结构，它们是以变形虫样运动的方式主动地向牛殖嵴迁移。若将 这一阶段的P G C 分离出来在体外培养，仍然可以观察到它们的 自主运动。生殖嵴释放的某些趋化性物质，具有吸引P G C 的能 力。在体外培养的情况下，胚胎的生殖嵴和生殖嵴条件培养基都 具有吸引P G C 朝之运动及促进其增殖的能力。P G C 迁移路径上 的体细胞及周围的胞外基质对P G

14、C 也有莺要影响。小鼠P G C 在 迁移过程前后对胞外摹质糖蛋白黏着力的变化，促使其离开后 肠向生殖嵴迁移并停留在生殖嵴中。P G c 之间的相互联系也对 迁移有重要的影响，P G C 离开后肠时，立即开始伸出伪足互相联 系，最终连成一个大的网络，P G C 网络的形成可能参与P G C 迁移 的引导和促使它们在生殖嵴中聚集。 P G C 的迁移过程伴随着P G C 数最的大量增加，这一阶段 P ( 群体加倍时间为2 8h 。对P G C 数量的控制依赖于对P ( 圯 增殖和存活的精确调控。由于这时P G C 在胚胎中的数量仍然很 少，所以对于影响P G C 增殖和存活的分子机制的研究主要是

15、通 过体外培养实验来进行的。在体外能够刺激P G C 数量增加的分 子很多，而它们在体内是否具有相同的作用还需要更多的实验 证明。 3 生殖细胞的性别分化 雌雄生殖细胞在性别决定初期，不论形态还是行为都没有 差别。生殖细胞进入生殖嵴以后才开始出现性别分化，早期可以 从生殖嵴形态上区分出性别，雄性生殖腺( 精巢) 含有条纹状的 结构，f i i 雌性生殖腺( 卵巢) 呈现一种均一的、未分化的形态。 小鼠性别由生殖腺中体细胞的微环境决定。不论本身的基 因型如何，进入精巢的都成为精原细胞，而进入卵巢的都发育成 卵原细胞，进入卵子发生过程。X Y 型的生殖细胞前体细胞甚至 也能够最终发育成有功能的卵子

16、。精巢中X X 型的生殖细胞前体 细胞虽然能够进入精子发生过程，却在减数分裂开始前就退化 了，表明Y 染色体上存在精子发生所必需的基因。卵巢中的生殖 细胞( 卵原细胞) 则立即进入第一次减数分裂前期，成为卵母细 胞，经细线期、偶线期和粗线期，出生后停滞于双线期，减数分裂 停滞期是卵母细胞生长的主要时期，直至排卵前才恢复减数分 裂。如果将生殖细胞从牛殖嵴中分离出来进行培养，即使来自雄 性牛殖嵴的生殖细胞也将进入减数分裂前期。据此推测，生殖细 胞进入减数分裂r 能是一种细胞自主行为，而不是由生殖腺中 体细胞的诱导引起的。 4 生殖细胞的体外发生 4 1雌性生殖细胞的体外发生 近1 5 年来，小鼠卵

17、母细胞体外发生的研究获得了很大的进 展。1 9 8 9 年，E p p i g 等分离1 2d 龄小鼠的卵巢卵泡进行体外培 养，卵泡可以体外生长并能发育成熟，排出成熟的M 期卵母细 胞，该卵母细胞体外受精后获得了成活的后代。该研究开创了卵 母细胞体外发生研究的新领域，并成为卵泡生物学研究的里程 碑。但体外受精后代的出生率非常低，这说明体外发育的卵母细 胞的质量还有待改进。因此，他们开展r 卵泡体外培养的条件优 化，研究发现促卵泡素( F S H ) 和胰岛素对卵母细胞受精后的囊胚 比例影响很大，但F S H 对卵母细胞的直径、进入减数分裂的能力 没有很大作用。又有研究发现，表皮生长因子( E

18、G F ) 单独或与 F s H 共同作用，可以提高卵母细胞体外发育、受精后的胚胎质 量，这主要表现在囊胚细胞数和囊胚比例上。因此，硒H 和E G F 也就成为以后卵泡体外培养重要的添加成分。后来又有研究发 现，促黄体索( L H ) 对卵泡的早期发育有一定的促进作用，但卵泡 一日发育到一定程度后就不再必须添加L H 了。2 0 0 3 年，0 ，B r i e n 等建立了一个优于E p p i g 等建立的原始卵泡体外发育的培养体 系，该体系在E p p i g 两步法的基础上对培养成分进行了很大的调 整，将卵泡的体外成熟比例从4 7 提高到6 2 ，将胚胎的2 一细 胞发育率从3 3 提

19、高到5 3 ，囊胚率从1 5 提高到2 3 ，整个试 验的囊胚率从2 提高到8 ，并且获得了6 6 个( 5 7 ) 体外受精 的后代。该研究成为原始卵泡体外发育的重大技术突破f 7 】。随后， 其他学者已将腔前卵泡的体外培养发育作为其他领域研究的一 个技术平台圈。F a r i n i 等建立了一种生殖细胞与体细胞的共培养 方法，并结合K I T L 、F G F 2 和L I F 等因子的作用。可以使从雌性胎 鼠生殖嵴中分离出来的P G C 体外发育到卵母细胞第一次减数分 裂的双线期，但这种卵母细胞不能成熟和受精肛“。在我们的研究 中，利用胎鼠生殖嵴体外培养或移植到受体鼠的肾包囊下进行 发

20、育，有大量的原始卵泡形成，并且获得了体外受精后代【1 1 。1 司。 上述研究主要集中在原始卵泡及腔前卵泡的体外或体内发 育等方面，I i i 原始卵泡时期，卵母细胞已经达到初级卵母细胞阶 段，停滞在第一次减数分裂的双线期，此时的细胞核已经形成了 生发泡，因而也就具备了进一步发育的物质和信息准备。O b a t a 等分离小鼠的1 2 5d p c 胎儿生殖细胞进行体外组织培养后，再 分离卵母细胞一卵丘细胞复合体( C O C ) 进一步培养，得到了具有 透明带的卵母细胞，其细胞核可以移植到体内发育的去核卵母 细胞中支持克隆胚的进一步发育，并产下成活的后代【l 川。该研究 首次将原始生殖细胞体

21、外分化成具有卵母细胞形态的细胞，但 其主要不足在于没有使体外发育的卵母细胞进行有效的减数分 裂，因析其卵母细胞不能直接进行体外受精或核移植。研究发 现，卵巢卵泡液中有一种能促进卵母细胞从MI 期过渡到M 万方数据 6 2 8盏，I ，r 热I 燕I o 盏H 孺L o 毋v 0 1 1 9N 0 4J u l ，2 0 0 8 L E T _ r E R SI NB I O T E C H N O L O G YV 0 1 1 9 N o 4J u l ，2 0 0 8 期的因子F F M A S ，在C O C 体外培养的过程中添加F F M A S ，卵 母细胞的核成熟率、体外受精后胚胎的

22、2 一细胞发育率和囊胚发 育率都显著提高。这说明F F M A S 在体外促进了卵母细胞核质 的成熟，从而提高了卵母细胞的质量。 4 2 雄性生殖细胞的体外发生 雄性生殖细胞的体外培养主要以S S C 的体外分离、纯化和 建系研究为主。S S C 是动物体内惟一能将遗传信息传递到下一代 的成体干细胞，因此S S C 既是干细胞生物学的重要研究对象，又 是制作转基因动物和研究基因功能的重要资源。S h i n o h 眦和 B 而n s t e r 研究小组分别于2 0 0 3 、2 0 0 4 年成功实现了小鼠S S C 的 体外长期培养与增殖。这些研究成果对精子发生机理的研究和 基于S S

23、C 转基因新手段的建立都将产生积极影响。 生精细胞体外培养是否成功是以培养的生精细胞能否分化 并进入减数分裂来判定的。一般认为，S e r t 0 1 i 细胞促进体外培养 的生精细胞存活和分化，而且生精细胞体外存活时间在几天到 几周之内。但初期的研究无法从形态学、生化特征和功能上识别 S S C ，因此也就限制了该领域研究的深入开展。1 9 9 8 年，N a g a n o 等首次进行了小鼠S S C 的体外培养，并用S S C 移植分析技术对 培养的细胞进行了功能鉴定。该研究中的S S C 以S T 0 细胞为饲 养层，使用了含有1 0 F B S 的D M E M 培养液，结果S S

24、C 在体外 存活了1 3 2d ，将这些S S C 移植到受体鼠时，能够恢复供体细胞 来源的生精作用；而没有利用S T 0 细胞作饲养层培养的S S C 在 体外存活的时间短，且移植到受体鼠后不能克隆到受体睾丸中 进一步发育旧。 5 干细胞向生殖细胞诱导分化 进入2 l 世纪以后，胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究成为 全球关注的热点之一【嗍。2 0 0 3 年，H n b n e r 等进行了E S 细胞体 外分化成卵母细胞的研究，E S 细胞在不添加滋养层细胞或生长 因子的情况下会分化成卵母细胞，卵母细胞标志基因、减数分裂 基因和透明带组成蛋白Z P 2 和Z P 3 基因的表达表明卵母细胞已

25、 经进入了减数分裂，并且这些卵母细胞可以孤雌发育形成类胚 体脚l 。然而，该研究没有利用该卵母细胞进行体外受精试验，并且 该卵母细胞的透明带非常脆，Z P l 的表达检测不到。2 0 0 6 年。 L a c h a m K a p l a n 等利用睾丸条件培养基可以诱导E S 细胞向卵母 细胞定向分化，但这些卵母细胞没有透明带，直径也不能达到正 常卵母细胞的大小阎。随后，N o v a k 等也利用E S 细胞分化获得了 卵母细胞，和k h 哪一K a p l a n 等的研究结果一样，这些卵母细胞 只能发育到第一次减数分裂的前期，而不能进一步减数分裂成 熟瞄】。，I o y o o k

26、a 等将E S 细胞体外成原始生殖细胞后移植到C D l 缺陷型小鼠的睾丸中进行体内发育，结果获得了具有受精能力 的精子渊。G e i j s e n 等将E S 细胞培养形成胚胎生殖细胞( E B 细 胞) ，然后用视黄酸诱导分化成P G C ，并能减数分裂形成精细胞， 显微授精得到了发育的囊胚圆。N a y e m i a 等利用E S 细胞分化的 精细胞获得后代闭。本研究组利用E S 细胞体外形成E B 细胞后， 分化形成了卵泡样结构，并可以观测到卵母细胞的发育，说明了 E B 细胞在E S 细胞向卵母细胞分化过程中的重要性。 参考文献 【l 】B y s k o vAG D i 艉r

27、e n t i a t i o n 0 fm a m m a l i 趾e I n b r y o n i c9 0 n a d s 【J 】 P h y s “R e V 。1 9 8 6 ，6 6 ：7 l 1 1 7 【2 】 M c l a r e nA G e 珊a n ds o 眦t i cc e U a g e si nt h ed e v e l o p i n g9 0 一 n a d 【J 】M o lC e l l E n d o c r i n o l ，2 0 0 0 ，1 6 3 ：3 9 【3 】 M c L a r e nA 蹦咖r d j a lg e mc

28、e U 8i nt h e 啪u 眈叨D e vB i o l ，2 0 0 3 ， 2 6 2 ：1 一1 5 【4 】E p i f a n o0 ，D e a nJ G e n e t i c c o n t m lo f e a r l yf o U i c u l o g e n e s i 8i n m i c e 【J 】T m n d sE n d o c nM e t a b ，2 0 0 2 ，1 3 ：1 6 9 一1 7 3 【5 】E p p i gJJ ，0 ，B r i e nMJ ，W i g g l e 8 w o n hK M 舢a l i a I lo o

29、 c ”e s 铲m n h a n dd e v e l o p m e n ti nv i t m 【J 1 M o lR e p r o dD e v ，1 9 9 6 ，4 4 ：2 6 0 一2 7 3 【6 】E p p i gJJ 0 0 c ”ec o n t m lo fo v 耐a nf o l l i c u l a rd e v e I 叩m e n t a I l d f b n c t i o ni nm 锄m a l 8 U 】R e p r o d u c t i o n 。2 0 0 l ，1 2 2 ：8 2 9 8 3 8 【7 】 0 B r i e n

30、M ，P e n d o l aF ，E p p i gJJ A 陀V i s e dp r o t o c o lf o ri nv i t r o d e v e l o p m e n to fm o u s eo o c ”e sf 南mp r i m o r d i a lf o l l i c l e sd 础a 矗c a l l y i m p m v e st h e i rd e v e l 叩m e n t a lc o m p e t e n c e J 】B i o IR e p m d ，2 0 0 3 ，6 8 ： 1 6 8 2 1 6 8 6 【8 】 S I

31、I I i t zJEJ ，C o r 讯n d tRG n ee a d i e s ts t a g o ff o l l i c u l o g e n e 8 i 8 i nv i t r o 们R e p “ 0 d u c t i o n ，2 0 0 2 ，1 2 3 ：l8 5 2 0 2 【9 】 F a r i n iD ，S c a l d a f e r ML ，I o n aS ，e ta 工G r o w t hf 如o 璐s u 8 t a i n p r i m o r d i a lg e mc e l ls u r v i v a l ，p m l i f

32、e r a t i o n 明de n t e r i “gi n t o m e i 0 8 i 8 i nt h ea b s e n c eo fs o m a t i cc e l l s 【J 1 D e vB i o l ，2 0 0 5 。2 8 5 ：4 9 5 6 【l O 】i “g e rFG ，d eF e l i c iM I n “t md e v e l o p m e n to fg m w i “go o c ”e 8 f r o mf e t a lm o u s e0 0 c y t e s ： s t a 鼯一8 p e c i f i cr e g u

33、 l a t i o nb ys t e mc e U t o r 肌d 固m u l o s ac e l l s 【J 1 D e vB i o l ，2 0 0 2 ，2 4 4 ：8 5 9 5 n 1 1S h e nW ，UL ，B a iZD ，e ta 1 I n “t r od e v e l o p m e n t a lo ff e t a l m eg e mc e l l si n t o 眦t u r e0 0 c y t e 8 【J 】R e p r o d u c t i o I l ，2 0 0 7 ，1 3 4 ： 2 2 3 2 3 l I 【1 2 】

34、S h e nW 。UL Z h a n gDH ，e ta 1 M o u 鸵0 0 c ”e sd e r i v e df 而mf e t a lg e 瑚c e l l sa r ec o m p e t e n tt o8 u p p o r tt h ed e v e l o p m e n t0 fe m b r y o sb y i n “咖f e r t i I i 鼯t i o n M o iR e p r o dD e v ，2 0 0 6 ，7 3 ：t 3 1 2 1 3 1 7 【1 3 】S h e nw ，z h a I l gDH ，Q i n gTT ，e

35、ta 1 “v i n g 胡s 州n gp m d u c e d b ym o u 8 e0 0 c ”e sd e v e df m mp r e m e i o t i cf e t a lg e r I I lc e l l s 【J B i o l R e p r o d ，2 0 0 6 ，7 5 ：6 1 5 6 2 3 【1 4 】0 b a 住Y ，K o n oT H a t a d aI M a t u r a t i o no fm o u 鸵f e t a lg e 咖c e l l s i nv i t m 阴N a t I l r e ，2 0 0 2 ，4 1

36、8 ：4 9 7 4 9 8 【1 5 】s h iY ，w n gQ ，L i a 0S ，e ta 1 I nv i t mp m p a g a t i o no fs p e m a t o 驴 n i a l8 t e mc e l l sf r o mK Mm i c e r J l F r o n tB i c i 。2 0 0 6 1 l ：2 6 1 4 2 6 2 2 f 1 6 1A n a t o o n i a nB ，M o o r eH G e mc e l l 8 舶mm o u 鸵a n dh u “姗e m - b r y o n i c8 t e mc e

37、 l l s 【J 】R e p r o d u c t i o n ，2 0 0 6 ，1 3 2 ：6 9 9 7 0 7 【1 7 】K e h l e rJ ，H n b n e rK ， G a r r e t tS ，S c h 0 1 e rH R G e n e r a t i n go o c y t e s 锄ds p e 咖饷me m b r y o n i cs t e mc e l l s 叽S e I l l i nR e p r o dM e d 2 0 0 6 ， 2 3 ：2 2 2 2 3 3 【l8 1N a g 粕oMC I n “t r o g a m

38、 e t ed e r i v a t i o nf 而mp l u p o t e n ts t e m c e l l s ：P r ；o 目r e s sa n dp e r s p e c t i v e 【J 】B i o IR e p r o d ，2 0 0 7 ，7 6 ：5 4 6 5 51 【1 9 Jz w a k aT T h o m njA Ag e 哪 c e I I o r i g i no fe I l l b r y o n i cs t e m c e l l 8 f J l 7D e v e l o p m e n t 2 0 0 5 ，1 3 2 ：2

39、2 7 2 3 3 ( 2 0 】w e s tJA ，D a l e ycQ I nv i t mg a m e t o g e n 鹊i 8 矗伽e I I I b r y o n i cs t e m c e l l s f J l C u r r0 p i nC e l lB i o l ，2 0 0 4 ，1 6 ：6 8 8 6 9 2 2 1 1H n b n e rK ，n l h m 啪nG ， C h r i s t e n 8 0 nLK 。e ta 1 D e v a t i o n0 f o o c y t e sf m m 啪u s ee I I l b r y o

40、 n i cs t e mc e l l s 叽S c i e n c e ，2 0 0 3 ，3 0 0 ： 1 2 5 1 一1 2 5 6 【2 2 】k h 绷一K 印l 明0 。C h yH ，个m u n 8 0 nA T e 8 t i c u l a rc e l l c o n d i t i o n e d m e d i u ms u p p o r t sd i f k r e n t i a t i o no fe m b r y o n i es t e mc e l l si n t oo v a r i 一 卸s t m c t u r e sc o n t a

41、 i n i n go o c ”酷S t e mC e l l s ，2 0 0 6 ，2 4 ( 2 ) ：2 6 6 2 7 3 【2 3 】N o V a k I ，L i 出d 曲t DA ，w a l l gH ，e ta 1 M e m b r y o n i cs t e m c e l l sf o mf o U i c l e l i k eo v a r i a ns t n l c m 陀sb u td on o t p r o g r e 蟠 t h r o u g I 眦i i 8 【J 】s t e mC e l l s ，2 0 0 6 ，2 4 ：1 9 3

42、l 1 9 3 6 f 2 4 】T o y 0 0 k aY T s u n e k a w aN ，A k 鹳uR ，N 0 c eT E m b r ) ，o n i es t e mc e l l s c 柚f o n ng e mc e l l si nv i t m 叨P r o cN a A c a ds c iU S A ，2 0 0 3 ， 1 0 0 ：1 1 4 5 7 1 1 4 6 2 【2 5 】G e 巧s e nN ，H o r 0 8 c h a kM ，K i mK ，e ta 1 D e r i v a t i o n o fe m b r y o n i

43、 c g e m lc e l l sa n dm a l eg a m e t e sf 而me m b r y o n i cs t e mc e l l s 【J 】N a t u m ， 2 0 0 4 4 2 7 ：1 4 8 一1 5 4 【2 6 】N a y e m i aK ，N o l t eJ M i c h e l m a n nHW ，e ta 1 I n “t r od i 圩每r e n t i a t e de m b r y o n i c8 t e mc e l l s 面v er i s et om a l eg a I n e t 部t I l a tc a n 胛n e r - a t eo 凰p r i n gl l l i c e 【J 】D e vC e l l ，2 0 0 6 ，l l ：1 2 5 一1 3 2 万方数据