成人骨髓间充质干细胞定向诱导为血管内皮样细胞.pdf

《成人骨髓间充质干细胞定向诱导为血管内皮样细胞.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《成人骨髓间充质干细胞定向诱导为血管内皮样细胞.pdf（5页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、收稿日期： 2004 - 10 - 18修回日期： 2005 - 03 - 08 文章编号：1001-6325 （2005） 10-0901-05 研究论文 成人骨髓间充质干细胞定向诱导为血管内皮样细胞 张超纪，任华，杜振宗，马国涛，刘洪生 （中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院 心外科，北京 100730） 摘要：目的 通过体外分离和纯化成人骨髓间充质干细胞， 体外定向诱导分化为血管内皮样细胞， 探讨为组织工程 血管的构建提供种子细胞的可能性。方法 收集骨髓血， 提取单个核细胞进行体外培养扩增， 用含10g/L VEGF 培 养液诱导细胞， 利用免疫组织化学、 流式细胞仪技术、 电

2、镜技术、 放射免疫技术鉴定和观察细胞特性。结果分析 了 5 个标本， 每个标本体外扩增 10 代可获细胞数为 8 1010个左右； 诱导14 d后细胞 VWF 强阳性表达， 接近汇合的 细胞外观呈现特征性的鹅卵石样形态， 透射电镜显示胞质内可见大量吞饮小泡， 细胞接种在细胞外基质凝胶 （ECMgel） 中可形成毛细血管样结构， 细胞上清液中 6-酮-前列素 F1含量为 （29.939 19.935） g/ （10 9L） 。结论 实 验结果提示利用本实验方法， 可以获得足够量较为单一、 具有较强增殖能力的间充质干细胞，间充质干细胞可以在 体外定向分化为具有内皮血管细胞特性的细胞。 关键词：间充

3、质干细胞；内皮样细胞；骨髓 中图分类号： Q254文献标识码： A Bone marrow mesenchymal stem cells orientiatedly induced and differentiated into endothelium-like cells ZHANG Chao-ji， REN Hua，DU Zhen-zong， MA Guo-tao，LIU Hong-sheng （Department of Cardiovascular Surgery Peking Union Medical University Hospital，CAMS & PUMC，Beijing

4、100730，China） Abstract：Objective To harvest and isolate bone marrow mesenchymal stem cells （BMMSCs） ， and to induce to differentiate them into endothelium-like cells.MethodsBMMSCs were treated with 10g/L VEGF； the characteristics of cells was analysed by eletron microscopy，immunohistochemistry，radio

5、immunity and flow cytometry. A total of 5 mL bone marrow was obtained from the rib of each adult （n=5 donors） .ResultsAfter 5 passages in vitro，approximately 4108BMMSCs were obtained from each sample，and after 10 passages，the count reached to about 81010cells. Expression of VWF was highest after 14

6、days and maintained afterwards. A layer of sub-confluent cells exhibited a Cobblestone-like morphology. The level of 6-Keto-PGF1was 29.93919.935g/ （106cell mL）in medium supernatant on day 14 after induction. Swal- low-viscles were observed in differentiated cells in transmission electron microscope.

7、 Culture of endothelium-like cells in extracellular matrix gel（ECMgel）resulted in vascular microtube formation.ConclusionExperimental results showed that enough and purified BMMSCs with ability of large multiplication were harvested and BMMSCs can differentiate into cells with characteristics of vas

8、cular smooth muscle and endothelial cells. Key words：mesenchymal stem cells；vascular endothelium-like cells；bone marrow 2005 年10 月 第 25 卷第 10 期 基础医学与临床 Basic & Clinical Medicine October 2005 Vol.25No.10 随着组织工程血管研究的进展， 什么细胞作为 种子细胞 （seeded cells） 是近年来组织工程血管研究 的重要内容。成熟生物体干细胞 （间充质干细胞 mesenchymal stem ce

9、lls， MSCs） 具有跨系统、 跨胚层分 化的潜能 1， 2 。利用它进行组织工程研究有以下优 势： 取材方便， 扩增迅速， 且对机体无害， 因此骨髓间 充质干细胞 （bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs） 有可能成为组织工程血管种子细胞的重要 来源。本实验拟通过体外细胞培养的方法将 MSCs 从骨髓血中分离出来加以纯化， 并进一步观察体外 定向诱导分化情况， 从而探讨为组织工程血管构建 提供种子细胞的可能性。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1标本来源：骨髓血来源于成人肋骨骨髓， 标 本为北京协和医院心胸外科手术摘取的肋骨， 排除 血液系

10、统疾病、 骨转移性肿瘤， 在手术切除后 1 2 h 内提取单个核细胞。 1.1.2主要试剂： DMEM-LG 培养基、 MCDB201 培养 基、 上皮细胞生长因子 （EGF） 、 血小板源性生长因子 （PDGF-BB） 、 血管内皮细胞生长因子 （VEGF） 、 细胞 外基质凝胶 （ECMgel）（Sigma） ， 胎牛血清 （FBS）（Hy- Clone） ， 鼠抗人单克隆抗体 CD105-FITC、 HLA-DR-PE、 CD34-PE、CD45-PE、CD11a-FITC、CD14-FITC（ Santa cruz） 、 兔抗人四因子相关抗原 （VWF） 多克隆抗体、 即 用型二氨基联

11、苯胺 （DAB）（北京中山生物技术有限 公司） ， PicTure6000 免疫组化试剂盒 （zymed） ， 前列环 素放射免疫试剂盒 （中国同位素公司北方免疫试剂 研究所） ， Ficoll 淋巴细胞分离液 （Uppsala） 。 1.1.3主要仪器和设备： CO2培养箱 （Forma scientif- ic， Inc） ， 倒置显微镜 （Nikon） ， 超净工作台 （北京半导 体设备一厂） ， 透射电镜 JEM1010 （日本电子株式会 社） ， 培 养 板 （Nunclone） ， 流 式 细 胞 仪 （BD FAC- SClibur） 。 1.2方法 1.2.1免疫组织化学： 每

12、次染色流程均设对照， 阳 性对照采用已知的组织切片， 空白对照采用 PBS 代 替一抗， 所有对照均与实验标本在同条件下严格按 照试剂盒推荐方法进行染色。 1.2.2流式细胞仪分析：鉴定细胞用 0.25%胰酶 -1 mmol EDTA 消化； PBS 洗涤 3 次， 滴加相关抗体 （ CD34、CD45、CD11a，CD14、KDR、 CD105和 HLADR） ， 4 孵育避光作用30 min， 洗涤后的细胞悬 于 PBS 中， 置于冰上待检测；应用流式细胞仪检 测细胞表面抗原表达。 1.2.3透 射 电 镜：取 对 数 生 长 期 单 层 细 胞， 2 000 r/min离心20 min，

13、 4 预冷的 2%戊二醛固定 2 h， 1%锇酸固定2 h后脱水， EPON812 纯浸包埋， 超 薄切片， 铅铀染色， 电镜观察。 1.2.4放射免疫： 取待测细胞的培养液1 mL注入 EP 管内， 4 3 500 r/min离心15 min， - 20 保存， 用平衡法测定 6-Keto-PGF1含量， 并计算每 mL/ 106cells 分泌 6-Keto-PGF1量。 1.3实验步骤 1.3.1成人骨髓间充质干细胞（BMMSCs）的分 离、培养、扩增和鉴定：无菌条件下，挤出骨髓 5 mL，用 无 血 清 DMEM-LG 洗 涤 2 次， 分 别 1 500 r/min离心10 min，

14、收集单个核细胞；收集到 的单个核细胞加入扩增培养液 3 ，记数细胞，调整 细胞 密 度，按 105/cm2种 于 25 cm2培 养 瓶 内， 37 、5 % CO2孵箱培养；3 d后更换培养液，弃 去未贴壁细胞，3 4 d换液 1 次，细胞 50%融合后 用 0.05%胰酶1 mmol EDTA 37 消化 3 5 min，1: 4 比例传代于25 cm2培养瓶内。收集第 2 3 代（P2 P3）细胞 - 80 冻存，24 h后复苏，观察活细胞 数，按 2 103/cm2种植扩增，扩增时保持细胞密 度为（2 8） 103/cm2。取部分细胞行免疫组织 化学和流式细胞仪检测细胞抗原 VWF、C

15、D34、 CD45、CD11a、CD14、CD105 和 HLADR 表达。 1.3.2BMMSCs 向血管内皮细胞样 （VELCs） 分化： 取 P4 P6 生长状态良好的细胞， 按 （1 2） 104/ cm2种植密度传代接种于 12 孔培养板内， 实验分诱 导组和对照组， 诱导组细胞加入诱导培养液， 诱导后 每 4 5 天换液一次， 第 9 天可按 1:4 传代。诱导培 养液含10g/L VEGF； 对照组用扩增培养液培养； 连 续观察21 d。 1.3.3血管内皮细胞样 （VELCs） 细胞的鉴定： 行 PicTure6000 法免疫组织化学染色， 观察 VWF 的表 达。体外毛细血管

16、样结构的形成： 4 用 ECMgel 胶 包被 96 孔培养板内， 每孔加50L， 37 聚合至少 60 min； 未诱导和诱导 2 周后细胞制成 109cells/L 细 209 基础医学与临床Basic & Clinical Medicine2005.25 （10） 胞悬液， 取100L分别种植在包被的 96 孔培养板 上， 观察细胞生长情况； 制取未诱导、 诱导 2 周培养 细胞上清液 - 20冻存待检 （各 5 份） ， 应用放射免 疫测定 6-酮-前列腺 F1（6-keto-PGF1） 的含量； 以 105/cm2密度传代诱导 2 周后细胞和未诱导细胞于 96 孔培养板内， 第2 d

17、直接瑞氏染色， 光镜下观察细 胞形态； 把诱导前、 诱导后 1 和 2 周细胞制成透射电 镜标本， 电镜观察。 1.4统计学分析 两组计量资料之间采用 t 检验。 2结果 2.1BMMSCs 的提取和原代培养 分离提取的单个核细胞以 105/cm2接种于扩增 培养基中， 刚接种的单个核细胞悬液中细胞呈圆形， 大小不一， 原代培养接种 3 4 h后细胞开始贴壁， 24 h后贴壁细胞数量明显增多， 3 d后完全换液除去 未贴壁细胞， 此时贴壁细胞为单个或几个细胞克隆， 散在分布， 大部分细胞呈纺锤形。7 10 d后集落迅 速增多细胞汇合达 50%左右， 此时可获得细胞约 2 105/25 cm2瓶

18、。然后按 1:4 传代。 2.2BMMSCs 的传代培养 传代 BMMSCs 呈圆形， 2 3 h开始贴壁， 12 h内贴 壁率 90% 95%， 弃培养液， 加入扩增培养液继续培 养； 传代培养后的细胞不再以成集落的方式生长， 而 是均匀分布生长， 24 h后细胞完全伸展并变为梭形、 多角形， 圆形细胞明显减少。以后增殖生长迅速， 取 第 2、 3 代细胞在 -80 条件下冻存， 24 h后复苏， 复 苏成活率 80% 85%， 细胞形态较为单一呈纺锤形， 折光好， 继续培养扩增。每个标本体外培养 5 代细胞 数为 4108个左右， 体外扩增 10 代细胞数为 8 10 10 个左右。12

19、代以后细胞开始出现衰老现象。 2.3BMMSCs 的表面抗原鉴定 本实验分析了 5 个标本， 流式细胞仪显示： 冻存 前细胞免疫表型 CD105 高表达，表达率 85%左右， 不表达 HLA-DR、 CD34、 CD45、 CD11a、 CD14 和 VWF； 冻存后细胞 CD105 表达率升高至 95%以上， 其余细 胞表型无改变。 2.4细胞的诱导和免疫鉴定 诱导第 8 天细胞 VWF 弱表达， 14 d后细胞 VWF 强阳性， 之后稳定表达 VWF； 分化后细胞用含 15% FCS DMEM-LG 培养基培养， 细胞形态和表型不改 变， 可以继续在体外培养 4 5 代而不出现衰老。诱 导

20、 2 周后的细胞以 105/cm2密度种植 96 孔培养板 后， 细胞近融合时， 外观呈现为特征性的鹅卵石样形 态， 排列紧密， 胞质丰富。 2.5电镜观察 诱导 2 周后透射电镜示诱导细胞表面有丰富指 状、 球状或绒毛状突起， 细胞器丰富， 胞质内可见大 量的吞饮小泡， 直径约70 nm， 主要分布于胞膜内面， 有的小泡有长颈与胞膜相连， 有的小泡彼此汇合成 管状， 一端或两端与细胞膜相连 （图 1） 。 图 1 透射电镜观察 VEGF 诱导后 BMMSCs 细胞 Fig 1Differentiated BMMSCs by VEGF 2.6功能鉴定 将诱导 2 周后细胞接种在 ECMgel

21、胶上， 24 h后 细胞迁移并聚集成立体球形样结构， 3 d后以此球为 中心向四周发出由单个细胞排列的毛细血管样结 构， 并逐渐延长， 与周边毛细血管样结构汇合， 在5 d 左右逐步增殖分化为多个细胞排列而成的微血管样 结构 （图 2） 。未诱导细胞无该结构形成。 图 2 诱导后 BMMSCs 形成微血管样结构 Fig 2Vascular microtube formation from differentiated BMMSCs （ x 100） 放射免疫测定诱导后 2 周的细胞上清液内 6-Ke- to-PGF1含量为 （29.93919.935） g/ （10 9 L） ， 对照组 为

22、（7.3841.570） g/ （10 9 L） （P 0.05）（表 1） 。 309 2005.25 （10）基础医学与临床 Basic & Clinical Medicine 表 1 细胞培养液中 6-Keto-PGF12 的含量测定 Table 1The level of 6-Keto-PGF1measured by radioimmunity x s，g/ （106 L） sample123456averageSTDEV test18.55633.48027.08140.35741.21518.94629.93910.068 control7.7087.3787.730*6.0228

23、.0827.3840.801 *P 0.05 compared with test 3讨论 骨髓中 MSCs 的含量很低， 因此体外纯化和扩 增极其重要。2002 年 Lodie 等 4进行了一系列实 验， 比较不同的成体人骨髓间充质干细胞 （BMMSCs） 纯化、 培养和提取方法， 结果提示尽管提取方法和培 养体系不同， MSCs 的纯度和结构功能无明显差异。 本研究基于 Lodie 等实验方法并进行了一些改 进， 用密度为 1.077 的 Ficoll 淋巴细胞分离液提取成 体人骨髓单个核细胞， 在含 2% FBS、 10g/L EGF、 10g/L PDGF-BB 的扩增培养基中低密度种

24、植培养 扩增， 然后进行冻存复苏再培养后， 细胞形态较为单 一呈纺锤形， 之后细胞形态无改变可继续培养 6 7 代。应用冻存方法处理细胞可以去除 98%的成纤 维细胞和已分化细胞， 有助于纯化干细胞 5 ， 本实验 结果与此结果相一致。 本研究冻存后进行扩增 BMMSCs 细胞， 流式细 胞仪研究细胞表面抗原表达发现， BMMSCs 不表达 造血细胞抗原， 如 CD34、 CD45、 CD11a 和 CD14， 同时 不表达分化抗原 HLA-DR， 而 CD105 表达较冻存前 升高。以上结果显示利用该实验方法， 可以获得足 够量的未分化的较为单一的 MSCs 细胞。本实验加 用了冻存方法，

25、该方法操作简便， 费用少， 也可达到 纯化细胞的目的， 这在以后的研究中尚需进一步证 实。细胞扩增 10 代， 细胞数约 8 1010， 基本满足组 织工程的需要。 胚胎学和肿瘤学研究表明内皮细胞祖细胞或干 细胞表达 CD105， 在其分化为成熟内皮细胞过程中 发挥着极其重要的作用 6， 7 。本实验免疫表型分析 显示BMMSCs高表达CD105， 提示BMMSCs具有新生血 管的潜能； 在 VEGF 诱导下 8 ， BMMSCs 细胞表达成 熟内皮细胞因子 VWF， 但不表达 CD34， 提示 CD34- 的骨髓间充质干细胞可以分化具有内皮细胞特性的 细胞。 将诱导分化的 BMMSCs 细胞

26、种植在细胞外基质 凝胶 （ECMgel） 上进行培养发现， BMMSCs 细胞在 ECMgel 中形成立体毛细血管网样结构， 诱导分化的 细胞汇合成片后外观呈现特征性的鹅卵石样形态， 这与利用胚胎干细胞诱导分化为内皮细胞的结果相 一致 9 。另外， 在培养 的 上 清 液 中 测 定 6-Keto- PGF1的含量， 与未诱导组有显著性差异。透射电 镜显示胞质内可见大量的吞饮小泡， 吞饮小泡与成 熟内皮细胞的代谢活跃有关， 小泡越多， 提示其代谢 越活跃， 表明经过体外定向诱导， BMMSCs 可分化为 具有内皮结构和功能特性的细胞。 总之， 骨髓中不但存在 CD34+的内皮细胞前体 细胞 1

27、0 ， 也存在 CD34-内皮细胞干细胞或前体细 胞， CD34-干细胞可能是通过 “干细胞循环” 11 参与 内皮细胞的分化， 可能是比 KDR+/CD34+干细胞更 加原始的干细胞， 进而也说明骨髓中 3 种主要的细 胞系统： 造血、 内皮和基质细胞系统， 存在着共同的 干/祖细胞， 在分化过程中也密切相关。本实验为骨 髓间充质干细胞作为组织工程内皮细胞的种子细胞 提供了理论和实验依据。 参考文献： 1Pittenger MF， Mackay AM，Beck SC，et al，Multilinenge po- tential of adult human mesenchymal stem

28、cells J . Science， 1999， 284 （5411） ： 143 - 147. 2Kopen GC，Prockop DJ，Phinney DG. Marrow stromal cells mi- grate throughout forebrain and cerebellum，and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains J . Proc Natl Acad Sci USA，1999， 96 （19） ： 10711 - 1016. 3Reyes M，Lun

29、d T，Lenvik T，et al. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells J . Blood， 2001， 98 （9） ： 2615 - 2625. 4Lodie TA，Blickarz CE，Devarakonda TJ，et al. Systematic analysis of reportedly distint populations of multipotent bone marrow-derived stem cells reveals

30、a lack of distinction J . Tis- sue Eng， 2002， 8 （5） ： 739 - 751. 409 基础医学与临床Basic & Clinical Medicine2005.25 （10） 5Young HE， Steele TA， Bray RA， et al.Human reserve pluripo- tent mesenchymal stem cells are present in the connective tissues of skeletal muscle and dermis derived from fetal，adult，and g

31、eriatric donors J . Anatomical Record， 2001， 264 （1） ： 51 - 62. 6Ziegler BL，Valtieri M，Porada GA， et al. KDR receptor：a key marker defining hematopoietic stem cells J . Science， 1999， 285 （5433） ： 1553 - 1558. 7Li C，Hampson IN，Hampson L， et al. CD105 antagonize the inhibitory signaling of transformi

32、ng growth factor betal on human vascular endothelial cells J . FASEB J， 2000， 14 （1） ： 55 - 64. 8陈文明.血管内皮生长因子的生物学及其在临床的初步 应用 J . 基础医学与临床 ， 2003， 23 （5） ： 471 - 477 9Hatzopoulos AK，Folkman J，Vasile E，et al. Isolation and haracterization of endothelial progenitor cells from mouse em- bryos J .Developm

33、ent， 1998， 125 （8） ： 1457 - 1468. 10Asahara T，Takahashi T， Masuda H， et al. VEGF contribution to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-de- rived endothelial progenitor cells J . EMBO J， 1999， 18 （14） ： 3964 - 3972. 11 Huss R. Isolation of primary and immortalized CD34- hematopoietic

34、 and mesenchymal stem cells from various sources J . Stem cells，2000， 18 （1） ： 1 - 9. 早期行血管成形术对非早期行血管成形术对非 STST 段抬高段抬高 ACSACS 患者有益患者有益 英国心脏基金会研究人员报告， 非 ST 段抬高的高风险急性冠脉综合征患者在出现指征症状后行血管成形术可使死亡率 和心肌梗死风险降低 56%。 不稳定性心绞痛随机介入研究 （RITA3） 的 5 年数据， 与保守药物治疗策略比较， 早期强力治疗方案可挽救生命。这些数据 在欧洲心脏病学会 2005 年会议上进行了报告， 并发表于 柳

35、叶刀（Lancet， 2005； 366： 914 - 920） 网络版上。 循环内皮祖细胞测定可预测心血管疾病的结果循环内皮祖细胞测定可预测心血管疾病的结果 德国 Saarland 大学的 Georg Nickenig 博士及其同事在 9 月 8 日的 新英格兰医学杂志（N Engl J Med， 2005； 353： 999 - 1007， 1055 - 1057） 上报告， 测定 CD34 和激酶插入结构阈受体 （KDR） 阳性的循环内皮祖细胞可提供心血管风险分层的方法。 作者总结， 与测定单一血清标志物预测风险相比， 使用风险的细胞标志物， 例如内皮祖细胞水平， 可使多种负面因素的复

36、杂相互作用得到统一， 更好的了解体内机制。 在相关的评论中， 哈佛医学院的 Anthony Rosenzweig 博士指出， 与内皮祖细胞水平降低相关的风险增加支持提高这些细胞 水平的治疗可能。但是， 提高内皮祖细胞的数目和功能可能会加重以不良血管形成为特征的糖尿病性视网膜病变和肿瘤血 管生成等疾病。他总结， 需要进行长期的大型研究， 结合基础科学研究和严格的干预研究来表明内皮祖细胞水平是否可用于 指导治疗， 以及细胞转移是否可提高这些细胞的水平。 冠心病患者的糖尿病诊断和治疗往往被忽略冠心病患者的糖尿病诊断和治疗往往被忽略 根据 8 月 1 日的 美国心脏病学杂志（Am J Cardiol，

37、 2005； 96： 363 - 365） 上报告的一项研究， 急性冠脉综合征 （ACS） 患者往 往有未被发现的、 因而未被控制的糖尿病。 抗血小板药物无法抑制抗血小板药物无法抑制 2 2 型糖尿病患者的血小板反应性增强型糖尿病患者的血小板反应性增强 在 8 月的 糖尿病（Diabetes， 2005； 54： 2430 - 2435） 上佛罗里达大学的 Dominick J.Angiolillo 博士及其同事报告的一项研究 结果表明， 糖尿病患者的血小板比非糖尿病患者的血小板对标准剂量的氯吡格雷反应低， 血小板反应性强。与以前的研究相 符， 糖尿病患者对阿司匹林的反应也较低， 引起血小板反

38、应性增加。虽然使用双重抗血小板治疗的糖尿病患者的血小板反应 性降低， 但血小板反应性仍然显著高于使用同样治疗方案的非糖尿病患者。提示， 即使在阿司匹林和氯吡格雷的双重抗血小 板治疗下， 2 型糖尿病患者的血小板聚集和活化增加。 2 2 型糖尿病的问题在于粒线体型糖尿病的问题在于粒线体 据美国 BIOCOMPARE 科技新闻网 （2005/8/19） 报道， 霍华德休斯医学院的研究人员发现， 细胞的发电厂粒线体的减少， 似 乎是导致 2 型糖尿病患者出现胰岛素抵抗的主因。新研究结果发表于 9 月号的 PLoS Medicine 中。 509 2005.25 （10）基础医学与临床 Basic & Clinical Medicine