应用IU标准对HBSAG检测试剂的分析.pdf

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1、中国生物制品学杂志2 0 0 8 年7 月第2 1 卷第7 期C h i nJB i o l o g i e a l aJ u l y2 0 0 8 ，V 0 1 2 1N o 76 1 5 中国图书分类号R 4 4 6 6 2 文献标识码A 文章编号1 0 0 4 - s s 0 3 ( z o o s ) f f - 0 6 1 $ - 0 3 应用I I J 标准对H B s A g 检测试剂的分析 周诚吴星黄维金蓝海云辜文洁祁自柏李河民 【诊断制品】 【摘要】目的应用I u 标准对H B s A g 检测试剂进行比较分析。方法筛选1 份H B s A g 阳性血浆，血清学检测证实为 H

2、 B s A ga d r 亚型，参照W H OH B s A g 标准品稀释方法进行稀释，以I u 为单位的H B s A g 国际标准品为标准，应用双平行线终点稀 释方法对该样品进行定量标定。以标定的l u 为单位样品，对国内外1 3 家H B s A g 检测试剂进行检测。结果待标定的样品经平 行稀释后，测定的浓度值与理论浓度值误差均在1 l 以内，应用l u 标准对国内外H B s A g 检测试剂进行检测，国外试剂的最低 检出限可达0 0 2 0 0 6I U m l ，国产试剂除l 家可达0 1 4I U m l 外，其余试剂均在0 2 9 加9 lI U n d 之间。结论应用I

3、 u 标 准检测H B s A g 检测试剂，国外试剂的灵敏度明显高于国内试剂。 【关键词】乙型肝炎病毒；乙型肝炎表面抗原；质量标准；国际单位 E v a l u a t i o no fD i a g n o s t i cK i tf o rH B s A gw i t hAQ u a n t i t yS t a n d a r dP a n e lf o r H B s A g o fI n t e r n a t i o n a lU n i t Z H O UC h e n g ，w UX i n g ，H U A N GW e i j i n ，e ta l ( N a t i

4、o n a lI n s t i t u t ef o rt h eC o n t r o lo fP h a r m o c e u t i c a la n dB i o l o g i c a lm d u c t s ，B e i j i n g1 0 0 0 5 0 。C h i n a ) 【A b s t r a c t O b j e c t i v eT oc a l i b r a t eaq u a n t i t ys t a n d a r dp a n e lf o rH B s A go fi n t e r n a t i o n a lu n i t ( I

5、U ) f o re v a l u a t i o no fd i a g n o s t i c k i tf o rH B s A g M e t h o d sO n es e r u ms a m p l ep o s i t i v ef o rH B s A g w h i c hw a sp r o v e da 8s e r o t y p ea d r , w a ss c r e e n e da n dd i l u t e da c c o r d i n gt ot h eW H Or e q u i r e m e n tf o rd i l u t i o no

6、 fH B s A gs t a n d a r d ，t h e nc a l i b r a t e dq u a n t i t a t i v e l yb yp a r a l l e ll i n ee n d p o i n td i l u t i o nu s i n g t h eq u a n t i t ys t a n d a r dp a n e lf o rH B s A go fI U 鹊s t a n d a r d F o u ri m p o f l e da n d9d o m e s t i cd i a g n o s t i ck i t sf o

7、 rH B s A gw e r ee v a l u a t e d w i t ht h ec a l i b r a t e ds a m p l e R e s u l t sA l lt h ee r r o r sb e t w e e nm e a s u r e da n dt h e o r e t i c a lc o n c e n t r a t i o n so ft h es a m p l et ob ec a l i b r a t e d ， a tv a r i o u sd i l u t i o n s ，w e r en o tm o r et h a

8、 n1l B yu s i n gt h ec a l i b r a t e ds a m p l e ，t h em i n i m u md e t e c t i o nl i m i t so f4i m p o s e dk i t sw e r e 0 0 2 - - 0 0 6I U m l ，a n dt h a to fo n ed o m e s t i ck i tW a s0 1 4I U m 1 H o w e v e r ，t h em i n i m u md e t e c t i o nl i m i t so ft h eo t h e r8d o m e

9、 s t i c k i t sr a n g e df r o m0 2 9t o0 9 1I U m 1 C o n c l u s i o nT h es e n s i t i v i t yo fi m p o s e dd i a g n o s t i ck i tf o rH B s A ge v a l u a t e dw i t ht h ec a l i b r a t e ds t a n d a r dp a n e lf o rH B s A go fI UW a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a

10、to fd o m e s t i cd i a g n o s t i ck i t 【K e yw o r d s 】H e p a t i t i sBv i r u s ；H B s A g ；Q u a n t i t ys t a n d a r d ；I n t e r n a t i o n a lu n i t 乙型肝炎病毒表面抗原( H e p a t i t i sBs u r f a c e a n t i g e n ，H B s A g ) 是乙型肝炎病毒( H e p a t i t i sBv i r u s ， H B V ) 感染的重要血清学指标，其检测广泛

11、应用于临 床，已有多种商品化检测试剂在临床应用。随着科学 技术的发展，H B s A g 检测试剂的灵敏度不断提高。为 了对H B s A g 检测试剂进行有效评价，建立在全球范 围内广泛认可的H B s A g 标准品具有重要意义。世界 卫生组织邀请多个国家和地区的实验室参与H B s A g 标准品研制工作，完成了以国际单位( I n t e r n a t i o n a l u n i t ，I U ) 为浓度单位的新H B s A g 标准品制备 1 2 】，并 已获得W H O 生物标准专家委员会认可。H B s A g 检 测应用双抗体夹心法原理，试剂种类较多，酶联免疫 试剂和近

12、期发展的化学发光试剂是临床使用的主要 试剂，献血员筛查主要应用酶联免疫试剂。本文应用 I u 为单位的H B s A g 标准品，对国内外主要H B s A g 检测试剂进行了比较分析，现将结果报道如下。 作者单位：中国药品生物制品检定所( 北京t 0 0 0 5 0 ) 通讯作者：周诚，E m a i l ：z h o u c h n i c p b p y a h o o c o r n c n 1 材料与方法 1 1 试剂及仪器 A R C H I T E C Ti 2 0 0 0 检测系统和A R C H I T E C T H B s A g 化学发光定量检测试剂为A B B O r

13、 l T 公司产 品；H B s A g 检测试剂盒( 酶联免疫法) 为M U R E 、D i a S o r i nS P A 、b i o M e r i e u xb y 公司及多家国内公司产 品。 1 2H B s A g 标准品 由W H O 提供，编号为0 0 5 8 8 。该标准品原材 料由荷兰红十字中心( C e n t r a lL a b o r a t o r yo ft h eN e t h e d a n d sR e dC r o s s ) 提供，H B s A g 阳性血浆经P E G 沉 淀，超速离心去除D a n e 颗粒，并经1 0 1 1 0 3 9

14、0S 及6 5 1 0h 巴氏消毒处理，纯化的H B s A g 使用重 钙化的阴性血浆稀释；所用阴性血浆经检测，其抗 H C V 、抗H I V 、H B s A g 及抗一H B s 均为阴性，同时H C V R N A 、H I VR N A 及H B VD N A 均为阴性，以M e r t h i o l a t e 作为防腐剂，经S 基因区扩增和序列分析，证 实为A 基因型，血清型为H B s A ga d w 2 亚型，H B s A g 万方数据 - 6 1 6 中国生物制品学杂志2 0 0 8 年7 月第2 1 卷第7 期C h i nJB i o l o # e a l a

15、J u l y2 0 0 8 ，V 0 1 2 1N o 7 浓度为3 3I U 瓶；0 0 5 8 8 标准品重量为0 0 8 86g ， C V 值为0 4 8 6 ，水分为0 3 2 66 。该标准品经4 5 、3 7 、 2 0 和4 稳定性试验，按A r r h e n i u s 计算方法评价了标 准品的稳定性，- 2 0 保存，预期下降小于0 0 0 1 3 。 I 3 检测样品的标定及检测 筛选1 份H B s A g 阳性血浆，血清学检测证实为 H B s A ga d r 亚型，经6 5 。C1 0h 巴氏消毒处理，参照 W H OH B s A g 标准品制备方法，使用乙

16、型肝炎5 项 指标( H B s A g 、抗一H B s 、H B e A g 、抗一H B e 、抗H B c ) 检测 为阴性，H B VD N A 、H C VR N A 及H 1 VR N A 均为阴 性的人血浆作为稀释液，稀释至一定浓度，以0 0 5 8 8 标准品作标准，用A B B O T 化学发光定量检测试剂 及酶联免疫试剂经双平行线方法进行标定。 对标定的系列稀释样品进行双盲编号，系列稀 释样品包括8 个稀释度，严格按待检试剂盒说明书 进行操作和结果判断。 1 4 国内外试剂最低检出限的确定 根据各试剂的有效线性范围，在设定的连续系 列浓度样品中，选择样品浓度值与吸光度相关

17、性较 好的4 个样品，以浓度值与吸光度的对数作回归分 析，根据回归方程，以试剂的C U T O F F 值计算其最低 检出量。 2 结果 2 1 检测样品的标定 检测结果显示，系列稀释样品测定浓度值与理 论浓度值的误差均在1 1 以内，符合检测试剂的变 异范围，见表1 。 表1I t B s A g 化学发光定量检测试剂检测系列稀释样品结果 T a b1 D e t e r m i n a t i o no fs e r i a ld i l u t i o n so ft e s ts a m p l eb y c h e m i l u m i n e c e n tq u a n t i

18、 t a t i v ek i tf o rH B s A g 2 2 国内外试剂的检测 检测结果显示，国外试剂检测最低稀释浓度 0 0 9I U m l 的样品均为阳性，国产试剂除个别检测 0 1 8I u r I l l 样品为阳性外，大部分仅能够检测到 0 7 0I U m l ，见表2 。 2 3 试剂的最低检出量限 国外试剂最低检出限可达0 0 2 0 0 6I U m l ， 国产试剂除1 家可达O 1 4I u m l 外，其余均在 O 2 9 0 9 l I u I I d 之间，9 家国产试剂平均最低检 出限仅为0 4 2I U m l ，见表3 。 衰2 以标定的I U 为

19、单位H B s A g 样品检测国内外试剂 T a b2 D e t e r m i n a t i o no fd o m e s t i ca n di m p o r t e dk i t sb yc a l i b r a t e ds a m p l eo fH B s A go f1 U 表3 国内外试剂相关系数及最低检出限 T a b3 C o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t s ( r ) a n dm i n i n l u m d e t e c t i o nl i m i to fd o m e s t i ca n di

20、m p o r t e dk i t s r1 0 01 0 01 0 00 9 91 0 01 0 01 0 01 0 00 9 60 9 90 9 90 9 90 9 9 M i n i m u m0 0 50 0 60 0 6 0 0 2 0 3 80 4 00 9 10 5 70 3 70 3 60 3 50 2 9 0 1 4 O e t e c t i o n 万方数据 中国生物制品学杂志2 0 0 8 年7 月第2 l 卷第7 期C h i nJB i o i o g i c a l sJ u l y2 0 0 8 ，V 0 1 2 lN 0 76 1 7 3 讨论 乙型肝炎表面

21、抗原检测试剂种类较多，建立全 球统一的评价标准具有重要意义。W H O 多次组织多 个国家相关实验室参与H B s A g 标准品的协作研究， 最早建立的以n g m l 为单位的标准品，编号为 N I B S CC o d e8 0 5 4 9 。由于该标准品是以纯化的 H B s A g 进行标定的，不同实验室纯化的抗原纯度存 在偏差，造成每个实验室测定的H B s A g 浓度不一 致。为此，W H O 协作实验室英国国家生物标准研究 所( N a t i o n a lI n s t i t u t ef o rB i o l o g i c a lS t a n d a r d sa

22、 n dC o n t r o l ，N I B S C ) 制备了以I u I I l l 为浓度单位的H B s A g 标准品，编号为N I B S CC o d e0 0 5 8 8 。新标准品在纯 化过程中进行了去D a n c e 颗粒处理，不含P r e S 抗 原，与其他标准具有一定相关性。目前，国际上已有 多个生产单位和实验室应用I u 标准。本研究初步建 立了以I u r n l 为浓度单位的标准品标定方法，应用 I U 标准对国内外试剂进行比较分析，在试剂有效线 性检测范围内，除一家国产试剂相关系数为0 9 6 外，其他试剂检测相关系数均大于或等于0 9 9 ，测 定样本

23、的浓度值与试剂的吸光度值具有较好的相关 性。各试剂最低检出限结果显示，国产试剂的灵敏度 明显低于国外同类试剂水平，参与本次调查的9 家 国产试剂平均最低检出限仅为0 4 2I U I I l l ，消除试 剂系统误差，国外试剂最低检出限可达O 0 5I U m l 。 在我国，血液筛查试剂主要应用乙型肝炎病毒 表面抗原诊断试剂盒( 酶联免疫法) 。有多篇文献报 道，乙型肝炎病毒感染者血清H B s A g 含量低的占较 大比例。叶贤林等 4 对深圳市无偿献血人群1 00 0 3 份血样进行分析，共有2 3 份样本H B s A g 含量在 0 5n g m l 以下，比例为o 2 3 。另有研

24、究报道，H B s A g 浓度达到0 1n g m l 即具有传染性 川。因此，有必 要提高国产试剂的灵敏度，在血液筛查中应用高灵 敏度的H B s A g 检测试剂，进一步降低H B V 经血源 途径传播的风险，保障血液制品的安全性。 我们收集了不同地区来源的H B s A g 阳性标本 及正常健康人标本共20 0 0 多份，其中H B s A g 阳性 样品5 5 1 份，用6 家国内外乙型肝炎病毒表面抗原 酶标试剂盒进行了检测，结果国外试剂的灵敏度为 9 9 8 ，国产试剂的灵敏度为9 5 5 9 9 6 ，国 外试剂的特异性为9 9 0 9 9 3 ，国产试剂的特 异性为9 9 4

25、9 9 7 ( 文章待发表) ，国外试剂的 灵敏度高于国产试剂，二者特异性相当，考核结果与 本次调查结果相符。酶标试剂影响因素很多，对国内 外试剂操作步骤进行比较可知，国外试剂的抗原抗 体反应时间设定在9 0 或9 0r a i n 以上，国产试剂为 3 0 6 0m i n ，明显短于国外试剂；国产试剂的C u t o f f 设定值高于国外试剂近1 倍。我们认为，抗原抗体反 应时间短及C u t o f f 值偏高对国产试剂的灵敏度有一 定影响。在试剂原材料优化方面，国外试剂采用多种 针对不同抗原决定簇的单克隆抗体，而国产试剂多 采用单一的单克隆抗体。多个单克隆抗体的使用既 有利于提高试剂

26、的最低检出限，又能提高对不同亚 型H B s A g 的检出率。 参考文献 1 W o r l dH e a l t hO r g a n i z a t i o n H e p a t i t i sBs u r f a c ea n t i g e n ( s u b t y p ea d ) T e c h n i c a lR e p o r tS e r i e s ，1 9 8 7 ，7 4 5 ：1 8 2 B a r b m aJ A Q u e s t i o n so fq u a l i t y ：h o wm u c hH B s A gi st h e r ei nt

27、 h i s s a m p l ea n dO u ra s s a ys e n s i t i v ee n o u g ht od e t e c tI t V o xS a n g ， 1 9 9 3 6 5 ( 4 ) ：2 4 9 2 5 0 3 W o r l dH e a l t hO r g a n i z a t i o n E x p e r tC o m m i t t e eo nB i o l o g i c a lS t a n d a r d S t a n d a r d i z a t i o n G e n e v a , 1 7 - 2 1N o v

28、e m b e r , 2 0 0 3 4 叶贤林，王良华，周一炎，等全自动血液核酸筛查及阳性献血员 追踪的研究，韩光宇，程梅，中华微检验医学杂志，2 0 0 5 ，2 8 ( 1 0 ) ： 1 0 7 2 1 0 7 4 5 许斌，韩光宇，程梅血液H B s A g 、抗H C V 复检中应用不同试剂 和设置低限灰区临床检验杂志1 9 9 8 ，1 6 ( 6 ) ：3 4 0 3 4 1 6 陈瑜，钟步云，徐根云，等低水平血清乙肝病毒表面抗原测定及其 临床意义中华检验医学杂志，2 0 0 1 ，2 4 ( 1 ) ：3 9 - 4 1 7 汪卫国，王福生，陈菊梅病毒载量动态检测在乙型肝炎治疗和研 究中的意义中华肝脏病学杂志，2 0 0 3 ，1 1 ( 1 ) ：5 4 - 5 6 ( S t 稿日期2 0 0 7 1t 0 7 ) 欢迎登录中国生物制品学杂志网站 【消息】 尊敬的专家、读者、作者及各位同仁：您们好! 自2 0 0 7 年8 月起，中国生物制品学杂志网站( w w w z g s w j c o r n c n ，中文域名：中国生物制品学杂志c o m ) 1 正式运行。本站网 页有杂志简介、在线投稿、稿件查询、过期目录、广告合作等您所需要的信息，欢迎登录。 万方数据