新药长毒试验动物血液生化测定规范化研究系列之二--样品制备方法对血液生化值的影响.pdf

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1、2 0 0 6年 2月 第 1 6 卷第 2 期 中国比较医学杂志 C H I N E S E J O U R N A L O F C O M P A R A T I V E ME D I C I N E F e b r u a ry, 2 0 0 6 Vo l . 1 6 No . 2 -一 一-一一 . - 一= =一竺 竺 竺 ， 里 ， 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 一二 二 二 二 二二 二 二 二 二二 二 二 二

2、 二二 二 二 二 二二 二 二 二 二二 二 二 二 二二 二 二 二 二二 二 二 二一一二 二二 一二 一 一一 纂都 C 吧 、 _- JJ 新药长毒试验动物血液生化测定 规范化研究系列之二 样品制备方法对血液生化值的影响 齐， 蔡润兰 ， 宋杨 ， 刘彬 ， 孙虹， ， 高南南 ， 赵德明 ( 1 . 中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所， 北京1 0 0 0 9 4 2 . 中国农业大学实验动物研究所) 【 摘要】 云1 目的 探讨血液不同制备方法对其血液生化值的影响。方法采用全自动生化仪对不同制备方法 血液中丙氨酸转氨酶( A L T ) 、 天冬氨酸转氨酶( A S

3、T ) 、 总蛋白( T P ) 、 白蛋白( A L B ) 、 总胆红素( T B i l ) 、 碱性磷酸酶 ( A L P ) 、 尿素 ( U r e a ) 、 肌O f ( C r e ) 、 葡萄糖( G l u ) 、 总胆固醇( C H O ) 等生化值进行测定。结果相同动物血清血浆、 不 同离心温度及禁食后不同时间点采血均影响血液生化值。结论建议在长毒试验动物血液生化测定中， 对测定样 品的制备方法应进行规范与统一。 【 关键词】 血液样品制备; 生物化学， 血液学; B e a g l e ， 犬科; 大鼠 中图分类号 R - 3 3 2 文献标识码 A 文章编号 1

4、6 7 1 - 7 8 5 6 ( 2 0 0 6 ) 0 2 - 0 0 6 9 - 0 4 E f f e c t s o f P r e p a r a t i o n Me t h o d s o f B l o o d S a m p l e s o n Bi o c h e mi c a l Me a s u r e me n t Q I Y u n ， C A I R u n - I a n S O N G Y a n g ， L I U B in S U N H o n g ， G A O N a n - n a n Z H A O D e - m i n g 2 ( 1 .

5、I n s t i t u t e o f M e d i c i n a l P l a n t D e v e l o p m e n t , C h i n e s e A c a d e m y o f M e d i c a l S c i e n c e s a n d P e k i n g U n i o n M e d i c a l C o l l e g e , B e ij i n g 1 0 0 0 9 4 , C h i n a ; 2 . I n s t it u t e o f L a b o r a t o ry A n im a l s , C h in a

6、 A g r ic u l tu r e U n iv e r s ity , B e ij i n g ) A b s t r a c t O b j e c t i v e T o o b s e r v e t h e e f f e c t s o f b l o o d s a m p l e p r e p a r a t i o n m e t h o d s o n b i o c h e m i c a l v a l u e s . M e t h o d s B y u s i n g a u t o m a t i c b i o c h e m ic a l a n

7、a l y z e r , t h e b io c h e m i c a l v a l u e s o f b l o o d s a m p l e s p r e p a r e d b y d i f f e r e n t m e t h o d s w e r e c o m p a r e d . R e s u l t s S o m e b io c h e m i c a l v a l u e s o f b l o o d s a m p l e s p r e p a r e d 场 d i f f e r e n t m e t h o d s w e r e

8、s i g n if i c a n t l y d iff e r e n t . C o n c l u s i o n I t i s i m p o rt a n t t o u n if y t h e p r e p a r a t i o n m e t h o d s f o r b l o o d s a m p l e s i n a n i m a l s d u r i n g c h r o n i c t o x i c i t y t e s t i n g s t u d i e s . ( K e y w o r d s B lo o d s a m p l

9、e s ; P r e p a r a t i o n m e t h o d s ; B lo o d , b io c h e m is t ry ; B e a g le d o g s ; R a ts 在血液样品进行生化测定之前， 必须对其进行 制备处理。其中， 血液是否抗凝， 分离上清液时的离 心条件( 温度、 速度) 以及采血前动物禁食时间长短， 这些因素是否对血液生化值存在影响?曾有人对采 血时间及采血血管等因素进行了考查 ， 但针对法 规要求的长毒血液生化指标进行的系统考查研究迄 今未见2 1 。本文比 较了血液样品不同 制备方法对其 血液生化值的影响， 为制订合理的血液制备

10、方法提 供科学的依据。 1 材料和方法 1 . 1 动物来源与饲养环境 S P F 级S D 或W i s t a : 大鼠雌雄各半， 由北京维通 利华实验动物中心提供 合格证号: S C X K ( 京) 2 0 0 2 一 0 0 0 3 ， 动物饲养于本所屏障环境( S P F级) 动物房 合格证号: S Y X K ( 京) 2 0 0 3 - 0 0 0 9 内， 日 常喂以w C a 7 0 中国比 较医学杂志2 0 0 6 年2 月第1 6 卷第2 期 C h i n J C o m p M e d , F e b r u a ry 2 0 0 6 , V o l . 1 6 .

11、 N o . 2 照射消毒饲料; 健康b e a g l e 犬( 一级) 雌雄各半， 由北 京通利试验动物养殖场提供 合格证号0 2 4 号总0 6 9 号 ， 动物饲养在通利试验动物养殖场一级动物室内 ( 动物房许可证号为S C X K ( 京) 2 0 0 0 一 0 0 1 8 号) ， 动物 单笼( 钢制笼) 饲养。饲料为北京市科澳协力饲料有 限公司提供的全价犬膨化饲料。 1 . 2 、仪器与试剂 7 0 6 0 型全自动生化测定仪， 由日本口立公司生 产; D - n型超纯水机， 由沈阳惠思纯水设备有限公司 生产; S L D电解质分析仪， 由北京医疗器械研究所生 产; T G L

12、 - 1 6 G - A型高速冷冻离心机， 由上海安亭科学 仪器厂生产。K , N a , C I 测定试剂盒由北京医疗器械 研究所生产， 其余试剂盒均为北京中生北控生物科 技股份有限公司产品。 1 . 3 方法 1 . 3 . 1 样品的制备: 采血前 1 2 h 动物禁食不禁水， S D 或W i s t a r 大鼠， 以1 0 %乌拉坦( 1 g / k g , 1 . p . ) 麻 醉， 股静脉采血; b e a g l。 犬从其前肢皮下浅层静脉 ( 头副静脉) 采血。血清血浆( 肝素抗凝) 按文献 1 方法制备。离心条件( 温度、 速度) 考查则根据实验 需要， 在采血分样后于不

13、同温度或速度离心制得。 禁食不同时间血液生化值考查采用 Wi s t a r 大鼠采血 前晚8 点禁食， 分别于第2 天上午( 9 一 1 1 点) 与下午 ( 2 一 4 点) 采血常规制备血清测定比较。 1 . 3 . 2 测定方法: 丙氨酸转氨酶( A L T ) 、 天冬氨酸转 氨酶( A S T ) 、 碱性磷酸酶( A L P ) 、 肌酸激酶( C K ) 均为 I F C C推荐法， 总蛋白( T P ) 为双缩脉法， 白蛋白( A L B ) 为澳甲酚绿法， 尿素( U r e a ) 为酶法， 肌醉( C r e ) 为苦 味酸法， 葡萄糖( G l u ) 、 y 一 谷

14、氨酞基转移酶( y - G T ) 、 甘 油三醋 ( T G ) 为 G O D - P A P法， 总胆固醇 ( C H O ) 为 C H O D - P A P 法， 总胆红素( T B i l ) 为重氮法。钾( K ) 、 钠 ( N a ) 、 1 . 3. 3 氯( C l ) 采用电极法测定。 数据处理: 采用 E x c e l 统计软件， 对血液生化 数据进行均数与标准差计算并进行组间 t 检验。 2 结果 2 . 1 血清血浆生化测定值 从表1 一 2 可见， 相同大鼠或b e a g l e 犬， 其血清 或血浆在部分生化指标上存在明显区别， 以长毒 1 0 项为例，

15、 无论是 b e a g l e 犬， 还是 S D大鼠， 其 A S T , T b i l , G l u 等指标差异均具显著性。表现为 A S T 血清 值明显高于血浆值， T b i l , G l u血清值明显低于血浆 值， 尤其是T a i l ， 其血清与血浆值差异达几十倍( 或 可作为血清与血浆标志性区别) 。同时， 血清与血浆 在 C K , y - G T , K , N a , C l 等方面也存在明显差异。 2 . 2 不同温度离心对血液生化值的影响 B e a g l e 犬血液分样2 份， 分别于室温( 2 0 0 0 x g 1 5 m i n ) 或4 条件离心

16、( 2 0 0 0 x g , 1 5 m i n ) 制备血 清， 测定结果表明， 部分生化指标差异显著， 具体表 现在A S T , T P 室温条件离心后测定值明显低于4 c C 条件离心测定值。表明 A S T , T P等在 4 条件离心 更为稳定( 表3 ) 0 2 . 3 不同离心速度对血液生化值的影响 B e a g l e 犬血液分样4 份， 在常规离心速度范围 ( 相对离心力范围: 1 0 0 0 x g 一 4 0 0 0 x g ) 内离心1 5 m i n ， 结果表明常规离心速度对血清生化值无明显影 响( 表4 ) 0 2 . 4 禁食后不同时间点采血血清生化测定值

17、 禁食时间长短对动物血液中部分生化指标存在 明显影响， 以长毒 1 0 项为例， 上午采血动物血清中 ( 禁食时间相对较短) A L T , A S T , U re a , G l u 均高于下 午采血动物( 禁食时间相对更长) ( 表5 ) 0 表1 S D大鼠血清血浆生化值的比较( n = 2 5 , 二 士:) T a b . 1 C o m p a ri s o n o f s e rum a n d p l a s m a b i o c h e m i c a l m e a s u r e m e n t i n S D r a t s 组别 G r o u p 天冬氨酸转氨酶

18、A S T ( U / L ) 总胆红素T B i l ( u m o l / L ) 血清 S e r u m 血浆 P l a s m a 丙氨酸转氨酶 ( U / L ) 4 7 . 1土9 . 1 4 7 . 8 1 9 . 0 1 2 0. 8士31 . 9 1 . 2 4士0. 2 3 组别 G ro u p 碱性磷酸酶A L P ( U / L ) 血清 S e r u m 血浆 P l a s m a . 114 6 . 1 . 1 士7 8 . 1 9 3 . 6士1 8 . 0 “ 尿素 U r e a ( m m o l / L ) 5 . 0 2 1 0 . 5 7 2

19、 6 . 6士1 6 . 6 “ “ 总胆固醇 C H O ( m m o l / L ) 1 . 8 410. 2 4 5. 2 8士 1. 0 5 总蛋白T P ( g / L ) 5 9 . 6土2 . 4 5 9 . 4士2 . 2 肌配 C r e ( p m o l / L ) 3 9. 4士2. 5 4 1 . 9土6. 6 白蛋白A L B ( g / L ) 3 0 . 7士0 . 8 8 2 9. 4土0. 8 9 葡萄糖 G l u ( m m o l / L ) 6. 6 3 t 0. 仅) 7 . 1 2士0 . 4 3 “1 . 7 6士0. 2 4954 22 注

20、: 与血清比较， P 0 . 0 5 , N o te . c o m p a r e d w i t h s e r u m . “ “ P 0 . 0 1 0 P 0 . 0 5 , * . P0 . 0 1 中国比较医学杂志2 0 0 6 年2 月第 1 6 卷第2 期C h i n J C o m p M e d , F e b r u a ry 2 0 0 6 , V o l . 1 6 . N o . 2 71 表2 B e a g l e 犬血清、 血浆生化值的比 较( n = 3 2 , x 士 ) T a b . 2 C o m p a ri s o n o f s e r

21、u m a n d p l a s m a b i o c h e m i c a l m e a s u re m e n t i n b e a g l e d o g s 组别 G ro u p 血清 S e r u m 血浆 P l a s m a 组别 G ro u p 血清 S e r u m 血浆 P l a s m a 丙氨酸转氨酶 A L T ( U / L ) 天冬氨酸转氨酶 A S T ( U / L ) 总蛋白T P 白蛋白A L B总胆红素T B i l ( g / L ) ( p m o l / L ) 2626 3 3 . 1 t 9 . 0 3 2. 8士8 .

22、 5 碱性磷酸酶 A L P ( U / L ) . 8 t 2 1 . 9 . 7 t 2 1 . 3 2 6 . 8士4. 4 2 0 . 6 t 3 . 7 “ 尿素 U re a ( m m o l / L ) 2. 3 8 t 0. 8 1 2. 3 4土0. 7 6 1 . 6 5士0 . 4 5 6 3 . 3 f 2 9 . 3 “ “ 总胆固醇 C H O ( m m o l / L ) 7 1 . 0士4 . 1 6 9 . 4士3 . 4 肌酥 C re ( p m o l / L ) 6 6 . 4士9 . 9 6 6 . 4 t 9 . 3 ( g / L ) . 9

23、士2 . 2 . 1士2. 1 6 葡萄糖 G l u ( m m o l / L ) 3 . 7 6士0 . 5 4 4 . 2 4 t 0 . 5 7 “ 4. 0 0士0. 6 8 3 . 8 3士0. 6 4 7069 甘油三酷 T G肌酸激酶 C K ( U / L ) Y 一 谷氨酞基 转移酶 Y - G T 钾 K , ( m m o l/ L ) 钠 N a抓 C 1 组别 G ro u p ( m m o l / L ) ( m m o l / L )( m m o l / L ) ( U / L ) 4:ao 血清 S e r u m 血浆 P l a s m a 0 0.

24、 6 8: t 0. 1 4 65 士0. 1 3 1 4 6 1 0 8 . 714 7 5士4 8 1 . 6 2士1 . 1 8 2 . 5 7 土0 . 9 3 “ 5. 1 8土0 . 2 4 4 . 6 8 士0 . 2 3 “ 1 4 7 . 2 t 1 . 6 6 1 5 2 . 3 t 3 . 2 9 “ “ 1 0 7 . 0士1 . 1 3 1 1 0 . 3 t 2 . 7 1 “ 注: 与血清比较， “ P 0 . 0 5 , “ P 0 . 0 1 o N o t e : c o m p a r e d w i t h s e r u m . P 0 . 0 5 ，

25、 二P 0 . 0 1 表3 不同离心温度对b e a g l e 犬血液生化值的影响( n = 3 2 , x 士 s ) T a b . 3 E ff e c t o f c e n t r if u g a t io n t e m p e r a t u re o n b l o o d b i o c h e m i c a l m e a s u re m e n t i n b e a g l e d o g s 丙氨酸转氨酶 A L T天冬氨酸转氨酶 ( U / L ) 3 9 . 0 t 5 . 9 4 3 . 8 17 . 2 AS T总蛋白 T P白蛋白A L B 组别

26、G ro u p 2 5 C 4 C ( U / L ) 3 1 . 61 1 0 3 2. 1 t 1 0. 8 .6 。 3- . 8 . 7 2424 组别 G ro u p 总胆红素T B i l L ) 碱性磷酸酶 A L P ( U / L ) 尿素U re a ( m m o l / L ) 肌醉 C r e ( K m o l / L ) 2 5 C 49 C 5 7 . 2 t 1 6 . 8 5 3. 2 t 2 1 . 4 2 . 9 6士0 . 3. 0 5士1 . 8 4. 8土1 4. 4 8 3 . 9士1 4 . 0 9202 5341 总胆固醉 C H O 组

27、别 , c o u p 葡萄糖 以u ( m m o l / L ) 3 . 6 1 t 0. 7 1 3. 4 5土0. 7 1 ( m m o l / L ) 甘油三醋 T G ( m m o l / L ) 肌酸激酶C K ( U / L ) 2 5 C 4 3 . 8 3 3 0 . 8 5 3 . 8 4士0 . 8 4 0 . 5 0士0 . 0 8 0. 4 9士0. 0 8 2 7 5 . 9士6 2 . 2 3 2 5. 6 t 8 2. 6 y 一 谷氨酞基车 移酶 y - G T ( U / L ) 2 . 5 0土2 . 5 6 2. 0 6士2. 1 4 注: 与室温

28、条件比较. “ P 0 . 0 5 , “ “ P 0 . 0 1 . N o t e : c o m p a r e d w i t h r o o m t e m p e r a t u re 表 4 二 P 0 . 0 5 , “ P 0 . 0 1 不同离心速度对b e a g l e 犬血液生化值的影响( n 二 1 6 , x 士 ) T a b . 4 E ff e c t o f c e n t r if u g a t io n s p e e d o n b l o o d b i o c h e m i c a l m e a s u r e m e n t i n b

29、e a g l e d o g s 离心力 ( x g ) C e n t r u f u g . s p e e d 丙氨酸转氨酶A L T天冬氨酸转氨酶 A S T ( U / L ) 总蛋白T P白蛋 白 A L B 总胆红素 T a i l ( U / L )( g / L )( g / L ) ( K m o l / L ) 1 0 0 0 3 5. 5 1 1 1 . 63 4. 618 . 1 6 1 . 6士4. 32 4. 1土 1 . 8 1 . 2 210. 3 3 2( 】 】 3 4. 6士1 2. 4 6 2 . 1士4. 1 2 4. 3士1 . 91 . 2 6

30、士0. 31 30 0 0 3 4. 6士1 1 . 8 3 3 . 4 1 7 . 1 3 2. 8 1 7. 8 6 1 . 9士4. 02 4. 31 1 . 8 1 . 2 4士0. 3 2 40 0 03 1. 9士 1 1 . 8 2 4. 0士1 . 81 . 2 9土0. 31 离心力 ( x g ) C e n t ri f u g . s p e e d 碱性磷酸酶 A L P ( U / L ) 2 8 . 7士6 . 7 尿素 U r e a ( m m o l / L ) 1 . 8 2土0. 4 5 6 1 . 2士4 . 3 肌醉 C re ( ft m o l

31、/ L ) 6 7 . 3土6 . 1 葡萄糖 ( m m o l / 总胆固醇 C H O ( m m o l / L ) 9 2. 6 t 3 9. 0 9 3 . 7士3 9 . 3 9 3 . 1士3 8 . 7 9 3. 1 t 3 8. 9 3. 81士0 5 54. 3 7士0 . 9 8 1 . 8 4 t 0. 4 36 8. 3士7. 0 3 . 5 1土0 6 64 . 3 7 t 0 . 9 8 1 . 8 2士0. 4 3 6 8. 0士6. 53 . 6 4士0. 6 4 4. 3 6士1 . 0 0 1 . 7 9士0. 4 36 7. 9士6. 9 3 . 9

32、( ) 土0. 6 24. 3 6士0. 9 8 姗姗硼姗 中国比 较医学杂志2 0 0 6 年2 月第1 6 卷第2 期 C h i n J C o m p M e d , F e b r u a ry 2 0 0 6 , V o l . 1 6 . N o . 2 表5 禁食后不同时间点采血对 Wi s t a r 大鼠血液生化值的影响( n 二 4 0 , x 土:) T a b . 5 E ff e c t s o f d i ff e re n t s a m p l i n g t i m e a f t e r f a s t i n g o n b l o o d b i o

33、c h e m i c a l m e a s u re m e n t i n Wi s t a r r a t s 采血时间天冬氨酸转氨酶 A S T ( U / L ) 总蛋白T P总胆红素 T B i l S a m p l i n g t i m e 丙氨酸转氨酶A L T ( U / L ) 上午采血 a . m. 下午采血 p . m 2 6 . 8 t 7 . 2 2 2 . 5 士3 . 5 “ 采血时间碱性磷酸酶A L P S a m p l i n g t i m e ( U / L ) 上午采血 a . m. 6 8 . 3 士 2 2 . 3 下午采血p . m .

34、6 5 . 1 1 2 2 . 8 注: 与上午比较 ， . P 0 . 0 5 , “ P 0 . 0 1 . 1 4 8 . 6士3 0 . 9 1 2 4 . 6 士3 1 . 3 . 份 尿素 U r e a ( m m o l / L ) 5 . 6 010 . 8 7 6 . 0 210 . 8 4 “ 5 9 6 0 白蛋白A L B ( g / L ) 2 7 . 9土2 . 3 2 8. 3士1 . 2 葡萄糖 G l u ( p m o l / L ) 1 . 1 9土0 . 3 3 1 . 3 1 10. 3 5 肌醉 C r e ( p m o l/ L ) 5 8 .

35、 8 土5 . 8 5 9 . 0* 7. 5 总胆固醇 C H O ( m m o l / L )( m m o l / L ) 6 . 4 2士1 . 8 4 5 . 4 7 t 1 . 0 9 “ “ 1 . 3 9士0 . 3 0 1 . 3 4士0. 2 3 N o t e : c o m p a r e d w i t h a . m . P 0 . 0 5 , “ P 0 . 0 1 3 讨论 血液样品制备过程中， 抗凝与否， 离心条件( 温 度、 速度) 以及动物禁食时间长短等因素中， 除常规 离心速度( 相对离心力1 0 0 0 x g 一 4 0 0 0 x g ) 对血液

36、 生化值未见明显影响外， 其余各项条件均不同程度 影响测定值。因此， 在长毒实验动物血液生化测定 中， 对测定样品的制备应进行统一规范， 建议动物禁 食1 2 h , 2 一 3 h 完成动物采血， 在4 条件， 常规离 心速度下进行血清分离。 血清与血浆的制备区别在于是否抗凝。长毒试 验中所涉及的生化指标， 临床生化测定主要采用血 清3 1 。我们也认为选择血清更为适合。众所周知， 血浆制备须加抗凝剂， 部分抗凝剂对生化值本身存 在影响， 如肝素钠对 N a 十 、 E D T A对 C 扩 十 等可能存在 干扰。更重要的是， 我们在实验中发现， 已分离血浆 在冰箱中冷藏或冷冻数小时， 会析

37、出冻状物( 冻融的 血浆更明显， 冻状物疑为纤维蛋白原等凝集物) ， 在 全自动生化测定中， 极易阻塞吸样针而影响测定结 果( 由于冻状物的阻塞， 仪器不能吸到足量血浆而使 测定值远远低于实际值) 。因此， 我们认为不宜将血 浆作为长毒血液生化测定的样本。 参考文献: 1 孙敬方， 主编 . 动物实验方法学 M . 北京: 人民卫生出版社， 2 0 0 1 , 2 3 6一2 3 8 2 中华人民共和国卫生部药政管理局. 中药新药研究指南( 药 学、 药理学、 毒理学) M . 1 9 9 4 , 2 0 6 一 2 0 8 . 仁 3 李影林， 主编. 中华医学检验全书【 M . 北京: 人

38、民卫生出版 社， 1 9 9 6 . 6 4 1 一 7 3 4 收稿日 期 2 0 0 5 - 1 1 - 1 0 ( 中国比较医学杂志 ( 中国实验动物学报 合订本征订启事 为方便读者检阅、 收藏两刊， 编辑部将少量库存期刊装订成合订本， 如有需要， 可直接汇款至编辑部( 北京市朝阳区潘家 园南里5 号1 0 0 0 2 1 电话: 0 1 0 一 6 7 7 6 1 3 3 7 传真; 0 1 0E - m a i l : B 6 7 7 6 1 3 3 7 1 2 6 . c o m ) 。如需挂号请另加3 元。 中国实验动物学杂志 : 创刊一2 0 0 0 年( 1 -1 0 卷)

39、， 6 7 7 8 0 6 9 0 共计 1 7 5 元 1 9 9 1 年( 创刊) -1 9 9 3 年( 1 -3 卷) 3 0 元; 1 9 9 6 年一1 9 9 7 年( 6 -7 卷) 2 5 元; 1 9 9 4 年一1 9 9 5 年( 4 -5 卷) 2 0 元; 1 9 9 8 年一2 0 0 () 年( 8 -1 0 卷) 1 0 0 元; 2 0 0 1 -2 0 0 2 年( 1 1 一1 2 卷) ， 1 1 0 元。 中国比较医学杂志 : 2 0 0 3 年( 1 3 卷) , 7 5 元; 2 0 0 4 年( 1 4 卷) , 7 5 元。 中国实验动物学报 : 创刊一2 0 0 () 年( 1 -8 卷) ， 共计1 2 5 元。 1 9 9 3 年( 创刊) -1 9 9 7 年( 1 -5 卷) 5 0 元; 1 9 9 8 年一2 0 0 0 年( 6 -8 卷) 7 5 元。 2 0 0 1 -2 0 0 2 年( 9 -1 0 卷) , 9 0 元; 2 0 0 3 年( 1 1 卷) , 5 5 元; 2 0 0 4 年( 1 2 卷) , 5 5 元。