新药长毒试验动物血液生化测定规范化研究系列之一--采血部位对血液生化值的影响.pdf

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1、 2 0 0 6 年 2 月 第 1 6 卷第 2 期 中国比较医学杂志 C H I N E S E J O U R N A L O F C O M P A R A T I V E ME D I C I N E F e b r u a ry, 2 0 0 6 V o l . 1 6 N o . 2 夔 勇 新药长毒试验动物血液生化测定 规范化研究系列之一 采血部位对血液生化值的影响 齐 云 目的 ， 蔡润兰 ， 宋杨 ， 刘彬 ， 王敏 ， 孙虹， ， 赵德明 ( I . 中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所， 北京1 0 0 0 9 4 ; 2 . 中国农业大学实验动物研究所) 【

2、 摘要】探讨从大鼠不同部位采血对其血液生化值的影响。方法采用全自动生化仪对不同部位采 血动物血液中丙氨酸转氨酶( A L T ) 、 天冬氨酸转氨酶( A S T ) 、 总蛋白( ”) 、 白蛋白( A L B ) 、 总胆红素( T B i l ) 、 碱性磷酸 酶( A L P ) 、 尿素( U r e a ) 、 肌kl l ( C r e ) , 葡萄糖( G l u ) 、 总胆固醇( C H O ) 等生化值进行测定。结果( 大鼠) 腹主动脉及颈外 静脉均与后腔静脉血液生化值在总蛋白( T P ) 、 白蛋白( A L B ) 上存在明显差异， 表现为前者血清中总蛋白、 白蛋白

3、明 显高于后者; 大鼠眶静脉与股静脉血液生化值在多项指标上亦存在明显区别。结论建议在长毒试验动物血液生 化测定中， 对采血部位应进行规范与统一。 【 关扭词】 采血部位; 生物化学， 血液; 大鼠 I 中图分类号I R - 3 3 2文献标识码 A文章编号 1 6 7 1 - 7 8 5 6 ( 2 0 0 6 ) 0 2 - 0 0 6 5 - 0 4 E f f e c t s o f D i f f e r e n t B l o o d S a mp li n g S i t e s o n S e r u m B i o c h e mi c a l Me a s u r e me

4、n t Q I Y u n ， C A I R u n - Ia n ， S O N G Y a n g ， L I U B in ， W A N G M i n ， S U N H o n g ，Z H A O D e - m i n g 2 ( 1 . I n s t i t u t e o f M e d ic in a l P la n t D e v e l o p m e n t , C h in e s e A c a d e m y o f M e d ic a l S c i e n c e s a n d P e k i n g U n i o n M e d i c a

5、l C o ll e g e , B e ij i n g 1 0 0 0 9 4 , C h i n a ; 2 . I n s t i t u t e o f L a bo r a t o ry A n i m a l s , C h i n a A g r i c u l t u r e U n i v e r s i t y , B e ij i n g ) ( A b s t r a c t O b j e c t i v e M e t h o d s b i o c h e mi c a l B l o o d s a m p l e s w e r e T o o b s e

6、r v e t h e e ff e c t s o f d i ff e r e n t b l o o d s a m p l i n g s i t e s o n b l o o d b io c h e m i c a l m e a s u r e m e n t i n r a t s . t a k e n f r o m d i ff e r e n t s i t e o f t h e r a t s . B y u s i n g a u to m a t i c b i o c h e m i s t r y a n a l y z e r , a n u m b e

7、 r o f b l o o d p a r a m e t e r s w e r e m e a s u r e d . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s w a s p e r f o r m e di f t h e r e i s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e a m o n g t h e v a l u e s o f b l o o d s a m p l e s t a k e n f r o m d i ff e r e n t s i t e s i n t h e r a t

8、 s . R e s u l t s T h e t o d e t e c t v a l u e s o f f ro m s a m p l e s t a k e n f r o m d i ff e r e n t s i t e s d if f e r e d s i g n i f i c a n t l y . T h e v a l u e s o f T P a n ds om eA L B s e r u m b i o c h e m i c a l p a r a m e t e r s o b t a i n e d o f b l o o d t a k e n

9、 f r o m a b d o mi a l a o rt a o r e x t e r n a l j u g u l a r v e i n w e r es i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e o f b l o o d t a k e n f r o m p o s t c a v a l v e i ni n t h e r a t s . T h e v a l u e s o f s e v e r a l p a r a m e t e r s o f t h e b l o o d t a k e n

10、 f ro m o r b i t a l v e i n i m p o rt a n t t o u n i f y t h eb l o o d s a m p l i n g B l o o d s a m p l i n g s i t e s i n d i ff e r e d s ig n i f i c a n t l y f r o m t h o s e f r o m f e m o r a l v e i n b l o o d s a m p l e s . C o n c l u s i o n I t i s a n i m a l s d u r i n g

11、c h r o n i c t o x i c i t y t e s t i n g s t u d i e s . K e y w o r d s s i t e s ; B io c h e m i s t ry, b l o o d ; R a t s 墓金项目I 国家科技部科技基础性工作和社会公益研究专项“ 长毒试验动物血液生化测定规范化研究” ; N O : 2 0 0 3 D I B 7 J 0 7 5 a 【 作者简介 齐云( 1 9 6 4 -) ， 男， 研究员， 博士。主要研究方向: 中药复方药理及中药新药药效毒理研究。电话: 0 1 0 - 6 2 8 2 9 2 0

12、7 ( 0 ) , E - m a i l y u n g i c h a i s o h u . c o m o 中国比较医学杂志2 0 0 6 年2 月第1 6 卷第2 期C h i n J C o m p M e d , F e b r u a ry 2 0 0 6 , V o l . 1 6 . N o . 2 新药研究过程中， 药品安全性评价是新药研究 开发的重要前提。而长期毒性试验( 以下简称长毒) 又是安全性评价中的重中之重。长毒血液生化的检 测结果常常是评判肝肾等重要脏器功能是否正常的 客观而又灵敏的指标。但是， 血液生化检测结果却 受到诸多因素的影响， 从取材、 离心、 标本

13、的保存直 至最后测定阶段， 其影响因素繁多。由于长期以来 长毒动物血液生化检测缺乏一个大家认可的规范化 ( 标准化) 操作规程， 各实验室在血液生化检测的取 材、 标本保存直至最后的测定上均有各自一套方法 和习惯， 加之实验动物在种属、 饲养条件( 动物房级 别不同) 上的差异， 致使各实验室长毒血液生化指标 差异甚大。我国实验动物血液生化值迄今尚无参考 价值很强的正常值与正常范围。这严重影响了药物 安全性评价的客观性与准确性。2 0 0 2年我国已颁 布了新的 药品注册管理办法 ， 要求药物非临床安 全性评价研究必须执行 药物非临床研究质量管理 规范( G L P ) ) “ 。建立长毒试验

14、动物血液生化测定 标准化操作规程( S O P ) 是 G L P的必然要求， 而要建 立全面合理的标准化操作规程， 就必须对影响生化 测定的因素进行全面准确的考查。对此， 本课题组 依据国家药品监督管理局颁布的 中药新药毒理学 研究指南及 中药、 天然药物长期毒性研究技术指 导原则 讨论稿( 第2 稿) 中确定的血液生化指标， 对 其进行了全面系统的条件考查。本文比较了大鼠动 一 静脉血、 大鼠眶静脉与股静脉血及颈外静脉与股静 脉血清生化值， 为制订合理的采血部位提供科学的 依据。 仪器厂生产。K , N a , C I 测定试剂盒由北京医疗器械 研究所生产， 其余试剂盒均为北京中生北控生物

15、科 技股份有限公司产品。 1 . 3 方法 1 . 3 . 1 样品的采集: 采血前 1 2 h 动物禁食不禁水， 动一 静脉血比较研究试验( S D大鼠) ， 以 1 0 %乌拉坦 ( 1 g / k g , i . p . ) 麻醉， 开腹从腹主动脉( 左右骼总静脉 汇合处) 采动脉血， 从后腔静脉( 左右骼总静脉汇合 处向上0 . 5 一 1 c m ) 采静脉血; 股静脉与眶静脉、 颈外 静脉血液生化值比较试验均使用 W i s t a r 大鼠， 采血 前先用乙醚麻醉， 分别从大鼠眶静脉丛、 颈外静脉、 股静脉采血制备血清待测定。 1 . 3 . 2 测定方法: 丙氨酸转氨酶( A

16、L T ) 、 天冬氨酸转 氨酶( A S T ) 、 碱性磷酸酶( A L P ) , ， 肌酸激酶( C K ) 均为 I F C C推荐法， 总蛋白( T P ) 为双缩脉法， 白蛋白( A L B ) 为嗅甲酚绿法， 尿素 ( U r e a ) 为酶法， 肌配( C r e ) 为苦 味酸法， 葡萄糖( G l u ) , y 一 谷氨酞基转移酶( y - G T ) 、 甘 油三醋( T G ) 为 G O D - P A P法， 总胆固醇 ( C H O ) 为 C H O D - P A P 法， 总胆红素( T B i l ) 为重氮法。钾( K ) 、 钠 ( N a )

17、, 氯( C l ) 采用电极法测定。 1 . 4 数据处理 采用 E x c e l 统计软件， 对血液生化数据进行均 数与标准差计算并进行组间 t 检验。 2 结果 1 材料和方法 1 . 1 动物来源与饲养环境 实验用雄性 S P F 级 S D或 Wi s t a r 大鼠由维通利 华实验动物中心提供 合格证号: S C X K ( 京) 2 0 0 2 - 0 0 0 3 1 ， 动物饲养于本所屏障环境( S P F级) 动物房 合格证号: S Y X K ( 京) 2 0 0 3 - 0 0 0 9 内， 日 常喂以s o C o 照射消毒饲料。 1 . 2 仪器与试剂 7 0 6

18、 0 型全自动生化测定仪， 由日本日立公司生 产; D - II型超纯水机， 由沈阳惠思纯水设备有限公司 生产; S L D电解质分析仪， 由北京医疗器械研究所生 产; T G L - 1 6 G - A 型高速冷冻离心机， 由上海安亭科学 2 . 1 动 静脉血血清生化测定 大鼠腹主动脉与后腔静脉血液血清长毒 1 0 项 常规生化测定项 目中， 动静脉血在总蛋白( T P ) 、 白 蛋白( A L B ) 上差异显著， 表现为动脉血中总蛋白、 白 蛋白明显高于静脉血。其余 8 项指标组间比较， 差 异无显著性( 表 1 ) 0 2 . 2 眶静脉与股静脉血清生化测定值 大鼠眶静脉与股静脉血

19、液生化值在多项指标上 存在明显区别， 眶静脉血除 G l u明显低于股静脉血 外， 其余 A L T , A S T , T P , A L B , T B i l , A L P , C K等均高于 股静脉血( 表2 ) 0 2 . 3 颈外静脉与后腔静脉血清生化测定值 大鼠颈外静脉与后腔静脉血液在T P , A L B 上存 在明显差别， 主要表现在颈外静脉血 T P , A L B 值高 于后腔静脉血( 表 3 ) 0 中国比较医学杂志2 0 0 6 年2 月第 1 6 卷第2 期C h i n J C o m p M e d , F e b r u a ry 2 0 0 6 , V o

20、 l . 1 6 . N o . 2 表1 S D大鼠动静脉血血清生化值的比较 ( n 二 T a b . I C o m p a r i s o n o f s e r u m b i o c h e m i c a l v a l u e s o b t a i n e d f r o m a r t e r i a l a n d 4 3 , x土 venous 、) b l o o d s a m p l e s i n S D r a t s 丙氨酸转氨酶 A L T ( U / L ) 天冬氨酸转氨酶A S T ( U / L ) 总胆红素 T B i l 组别G ro u p 腹

21、主动物 A b d o m i n a l a o rt a 后腔静脉 P o s t c a v a l v e i n 4 0. 5士 1 0. 41 6 9. 2: t4 8. 8 总蛋白T P ( g / L ) 5 8 . 8 t 6. 2 白蛋白A L B ( g / L ) 2 8. 0土 1 . 5 ( p m o l / L ) 1 . 1 2士0. 31 3 8. 7士9. 6巧7 . 6士3 9 . 25 5. 4士5. 42 6 . 8士1 . 6 1 “ . 2 4士0. 4 0 组别 G r o u p 碱性磷酸酶A L P ( U / L ) 腹主动物 A b d

22、 o m i n a l a o rt a 后腔静脉 P o s t c a v a l v e i n 1 2 5. 1士7 5. 8 尿素 U r e a ( m m o l / L ) 4. 3 3土 1 . 0 8 肌配 C r e ( p m o l / L ) 葡萄糖 G l u总胆固醇 C H O m m o l / L )m m o l / L ) 4 6 . 8 1 1 4 . 57. 3 4士2. 3 51 . 6 4土0. 3 9 1 2 2. 0士6 9. 24. 5 3士 1 . 0 3 4 8 . 0士1 8 . 48. 0 2 t 2 . 3 41 . 叹 t 0

23、. 4 2 注: 与动脉血清比较， P 0 . 0 5 ， 二P 0 . 0 1 0 N o t e : c o m p a r e d w i t h s e r u m f r o m a rt e r i a l b l o o d , “ P 0 . 0 5 , “ P 0 . 0 1 表2 W i s t a : 大鼠眶静脉与股静脉血血清生化值的比较( n = 4 0 , x 士。 T a b . 2 C o m p a r i s o n o f s e r u m b i o c h e m i c a l v a l u e s o b t a i n e d f r o m

24、o r b i t a l a n d f e m o r a l v e n o u s b l o o d s a m p l e s i n Wi s t a r r a t s 组别 G r o u p 丙氨酸转氨酶 A L T ( U / L ) 天冬氨酸转氨酶 A S T ( U / L ) 眶静脉3 2. 7士4. 3 1 2 6. 5土 1 8. 6 总蛋白T P ( g / L ) 6 2. 1土2. 6 白蛋白A L B ( g / L ) 2 8. 9 t 1. 1 总胆红素 T b i l ( p m o l / L ) 1 . 6 430. 2 6 Or b i t

25、a l v e i n 股静脉2 9 . 8士4 . 0 * .1 0 4 . 5士1 4 . 8 “5 7 . 2 士2 . 6 “ “ 2 7 . 1 土1 . 2 “1 . 3 8 t 0 . 2 2 “ “ F e mo r a l v e i n 一一一. 一一一二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 二 : 二二 二 二 二 二 二 艺 ; 二 二 二 二 二 二 二 二 组别 G ro u p 眶静脉 O r b i t a l v e i n 股静脉 F e m o r a l v e i n 组别 G r o u p 眶静脉 O r b i t a l v e

26、 i n 股静脉 F e m o r a l v e i n 碱性磷酸酶 A L P ( U / L ) 6 8. 3士9. 6 尿素 U r e a ( m m o l / L ) 5. 9 2士1 . 1 8 肌醉 C r e ( p m o l / L ) 4 9. 8士3. 2 葡萄糖 G l u ( m m o l / L ) 肌酸激酶 C K ( U / L ) 6 2 . 4士8 . 3 -6. 1 9土1 . 2 4 4 9. 8士3 . 9 5 . 4 7 1 1 . 0 7 6 . 4 4士0 . 7 7 . * 9 5 5士3 0 2 8 2 2士2 5 7 书 “ 总胆

27、固醇 C H O ( m m o l / L ) 甘油三醋 T G ( m m o l / L ) 0. 6 2士0. 2 1 钾 K ( m m o l / L ) 钠 N a m m o l / L ) 氯 C 1 ( m m o l / L ) 1. 8 4士0. 2 1 4. 8 8士0. 4 41 4 2. 2士 1 . 21 0 4. 4士 1 . 0 1. 7 2士0. 2 70. 6 8士0 . 2 04. 7 8士0 . 2 91 4 2. 7土 1 . 4 1 0 3. 8土 1 . 3 注: 与眶静脉血清比较， “ P 0 . 0 5 , “ P 0 . 0 1 . N

28、o t e : c o m p a r e d w i t h t h e s e r u m f ro m o r b i t a l v e i n b l o o d , “ P 0 . 0 5 , “ P 0 . 0 1 3 讨论 大鼠长毒试验中， 采血部位多种多样， 如股动脉 采血、 股静脉采血、 颈外静脉采血、 眶后静脉丛采血、 摘眼球采血、 断头及剪尾采血( 后3 种属动静脉混合 血) 等方法2 1 。这些部位采血， 其血液生化值是否存 在差异， 迄今无人进行过系统研究。本文对动一 静脉 血、 前腔静脉( 颈外静脉属前腔静脉) 与后腔静脉血 及眶后静脉与股静脉血液生化值进行比较，

29、 结果表 明不同部位采血， 其部分血液生化值存在明显差异， 尤其是眶后静脉丛采血与股静脉采血的血液生化值 差异更大， 这可能与采血时眼内液的混入有关。 由于不同部位采血血清生化值存在差异， 因此， 在长毒试验动物血液生化测定中， 对采血部位应进 行统一规范。首先， 动一 静脉混合血及眶后静脉丛血 液由于难以控制动静脉血或眼内液与血液的比例， 显然不宜纳人规范。根据我们在试验中的体会， 建 议将采血部位统一规范为颈外静脉。原因有二: ( 1 ) 比较而言， 颈外静脉因其部位表浅， 采血简便易行， 熟练操作者甚至可不经麻醉直接采血3 。而腹主动 脉及后腔静脉采血一般均需开腹， 从股静脉采血虽 也简

30、便易行， 但由于大鼠股静脉较细， 一般只能剪断 放血， 但股静脉与股动脉伴行， 试验过程中极易将伴 行的股动脉误剪而采到动脉血或动一 静脉混合血。 ( 2 ) 颈外静脉采血后， 动物仍可存活。这适宜于多种 目的的采血要求。因此， 我们建议统一规范大鼠采 6 8 中国比较医学杂志2 0 0 6 年2 月第1 6 卷第2 期C h i n J C o m p M e d , F e b r u a ry 2 0 0 6 , V o l . 1 6 . N o . 2 血部位为: 颈外静脉。B e a g l e 犬采血部位本身比较统一， 一般均从犬前肢 以 上主 要 讨 论了 大鼠 不同 采 血

31、部 位 生 化 值的 异大 隐 静 脉 采 血， 因 此， 本 文 未 对B e a g l e 犬 采 血 部 位 进 同及采血部位的规范化问题。相比较而言， 由于行比较考查。 表3 W i s t a : 大鼠颈外静脉与后腔静脉血血清生化值的比较( n 二 4 9 , 云 士，) T a b . 3 C o m p a r i s o n o f s e r u m b i o c h e m i c a l v a l u e s o b t a i n e d f ro m e x t e r n a l j u g u l a r a n d p o s t e a v a l v

32、e n o u s b l o o d s a m p l e s i n Wi s t a r r a t s 组别 G ro u p 颈外静脉 丙氨酸转氨酶A L T ( U / L ) 天冬氨酸转氨酶 A S T ( U / L ) 总胆红素 T B i l ( p m o l / L ) 2 9. 9土5. 82 0 2. 3士3 6. 9 总蛋白T P ( g / L ) 5 5. 3士3. 6 白蛋白 A L B ( g / L ) 3 2. 1土1 . 61 . 51士0. 4 5 E x . J u g u l a r v e i n 后腔静脉 P o s t c a v a

33、l v e i n 2 8 . 5士5. 72 0 6. 6士2 8. 25 2 . 1 士3 . 4 “3 0 . 6土1 . 5 “ 1 . 4 2土0. 4 7 组别 G ro u p 颈外静脉 碱性磷酸酶A L P ( U / L ) 尿素 U r e a ( m m o l / L ) 4. 1 9 t 1 . 0 4 肌醉 C r e ( u m o l / L ) 肌酸激酶 C K ( U / L ) 4 6. 2 t 4. 0 8 E x . J u g u l a r v e i n 后腔静脉 1 6 4. 1士3 3. 9 1 5 5. 6土3 0. 3 葡萄糖 G l u

34、 ( m m o l / L ) 6. 9 3士1 . 5 2 1 1 1 4士4 8 3 4. 4 6士1 . 0 64 7. 1 t5. 17. 2 9士1. 8 41 1 9 8土5 5 8 P o s t c a v a l v e i n 总胆固醇 C H O ( m m o l / L ) 甘油三醋T G钾 K 组别 G r o u p 颈外静脉 ( m m o l / L ) m m司/ 4 8士0 钠 N a ( n u n o l / L ) 氛 C l ( m m o l / L ) 2. 0 2士0. 2 91 . 2 7土0. 5 0. 2 41 4 0. 3土1 .

35、5 9 1 0 2. 2士3. 1 8 E x . J u g u l a r v e i n 后腔静脉1 . 9 3 士 0 . 2 8 1 . 2 0 土 0 . 4 9 P o s t c a v a l v e i n 注: 与颈外静脉血清比较， P 0 . 0 5 , “ P 0 . 0 1 . N o t e : c o m p a re d w i t h t h e s e r u m o f b l o o d t a k e n f ro m e x t e rn a l j u g u l a r v e i n , 4. 5 8士0. 2 81 4 0. 4 f 1 .

36、 4 51 0 2. 3士 1 . 7 3 “ 尸0 . 0 5 , “尸0 . 0 1 参考文献 : 国家药品监督管理局， 主编. 药品注册管理法规文件汇编 M . 北京: 中国医药科技出版社， 2 0 0 2 . 3 9 . 孙敬方， 主编. 动物实验方法学 M . 北京: 人民卫生出版社， 2 0 0 1 .2 2 8一2 3 0 . 3 安丽， 鲍清. 大鼠颈外静脉采血的新方法 J l . 中国比较医学 杂志， 2 0 0 3 , 1 3 ( 4 ) : 2 2 3 . 收稿日期 2 0 0 5 - 1 1 - 1 0 门一一一J飞J .2 r.esLI ， 竺万、 召 写勺 、 七万、 ， 七月、 F iT A ( 中国实验动物学报 ( 中国比较医学杂志) 2 0 0 6 年广告征订 中国实验动物学报 、 中国比较医学杂志 是由中国实验动物学会主办并发行的国家级学术刊物。该 两本期刊是全国实验动物行业影响最大、 学术地位最高的学术刊物， 也是我国实验动物科学领域的重要广 告媒体。两本期刊可为企事业单位发布产品信息、 提供技术服务、 宣传企事业形象等广告， 并提供多方位信 息服务。现开始征订2 0 0 6 年广告， 请有意刊登广告单位或个人与我刊联系。电话: 0 1 0 一 6 7 7 6 1 3 3 7 0