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1、!论! ! 著! 埃他卡林对重要器官心脑肝基因表达的影响 王! 玉， 潘志远， 汪! 海 （军事医学科学院毒物药物研究所， 北京! “#$%#） 收稿日期： 97:;8:7? -6； 汪! 海 （“0* ( ） ， 男， 博士， 研究员， 博士生导师， 研究方 向： 心血管药理学和新药研究， 123： #“#40*L; (“灌胃 L; (“） L; (“组以及 0 6;L;(“撤药组。采用直接插管法， 观 察麻醉大鼠的血压、 心率、 收缩参数以及舒张参数的变化； 采 用 P5 染色和电镜技术观察不同组对心肌的形态学和超微 结构的变化。结果! !埃他卡林对心、 脑和肝脏基因表达的 调节作用具有选
2、择性。采用) #0个具有重要功能的基因序 列的芯片， 埃他卡林 * 6;L; (“灌胃 L; (“灌胃 ， 由军事医学科学院动物中心提供， 动物合格证号： HNVS （军） L; (“?，:;%?： )A7ADA :BA) 公司； 8EF3D 试剂： 购自 EGH2573*AG 公 司； 反转录酶 I） !%、 -M? 和 NM64A !： 购自 ?73)A*6 公司；?:8 热循环仪， =ML“， 12 型投射电子显微镜， 荷 兰。 !. $# 基因芯片检测埃他卡林对大鼠重要器官心、 脑、 肝基因的差异表达#总 8M 提取： 按照一步 法步骤 P提取总 8M， 再用 LD3*35AU )8M
3、 I2-2 V25 （OW6*AG 公司） 纯化 )8M。$探针标记： 反转录标 记 CNM 探针并纯化， 用 :;? 标记生理盐水对 照组， 用 :;%? 标记埃他卡林处理组。乙醇沉 淀后溶解在 “, %D % X RR: Y “ *J +! RNR 杂交液 中。 9 , （ QAGA76D RC6GG2G* 公司） 扫描芯片， 用 QAGA?2U ?73 / , 软件分 析 :; 和 :;% 两种荧光信号的强度和比值。用 9, 个管家基因进行 :; 和 :;% 的均衡。经数据均一化 处理后， 最后筛选出 86523 值 “ 或 ,/ % 的数据项 列于工作见 6 “， ， 9。 !% 24
4、 0 ()*+ 76G4C72S5RAG4AG524AG4A I;342G 7A*WD6537; D2*B5 CB62G%bQQ:QQ:Q:Q:Q:QQ:QQQ:QQ:QQ:QQ:QQ:Q:QQQQQQQQQ:Q:QQQ:Q:Q:QQQ:Q:QQQ:QQ:Q :Q:Q:Q:Q:QQQQQQ:QQQ:QQQQQQ:Q:Q:QQQ:Q:Q:QQQQ:Q:Q:Q:QQ:QQQQQQ:QQ:+比值分别为 *, ?4 和 *, ?( 条带 （A/B *） ， +C水浴保温 * D 后的电泳图谱与水 浴保温前的图谱无明显差异， 表明 367 的纯度达到 芯片杂交要求。 !- #- #- !5 芯片杂交体系
5、5本实验结果阴性和空白 对照的杂交信号阴性， 阳性对照的管家基因杂交信 号阳性， 说明实验无污染且检测体系正常。 !- #- #- $“ 芯片杂交散点图5 E 轴、 F 轴分别以 GHI 荧光强度值和 GHJ 荧光强度值为坐标， 每一个数据 点代表芯片上一个基因点的杂交信号； 数据点若为 红色， 代表 F= E 的比值在 +, J K;, + 之间， 属非差异 表达； 数据点若为黄色， 则代表 F= E 的比值在+, J K ;, + 范围之外， 该点很可能属于表达差异 （A/B ;） 。 !- #- #- %5 双色荧光叠加图5A/B I 为 GHIL$MN) 标 记生理盐水组， GHJL$
6、MN) 标记埃他卡林用药组； 图 中某一点的两种叠加信号， 如果 GHI 信号较强， 该点 多显绿色 （下调趋势） ； 如果 GHJ 信号较强， 该点多 显红色 （上调趋势） ； 如果强度相似， 即显黄色。 !- #- !“ 埃他卡林作用后心脏组织的特异性差异表 达基因“ 正反标两次实验发现埃他卡林作用后， 心 脏组织表达差异一致的基因共 ;I） (0182 !?， #? 56: 4 0A141 6-., “71(?(8“,1-*(1*+ #-.27 （A/B）()+ 5“13 6-., .)1-.8 #-.27 （A/$）“) ;“1(8 .-#()0 !“#$%3 （;3B CCAB=DF
7、B CCB =G HEIG9A HEIDC)(“2) #*6(.,B F=B =C HEI9DG4,%M., 9B GFFB =DD;)($%*.1(.,B 9CB G=C=131()-%#)-/1.)*%+ “$/*%., 2/5/(/3=#()6%(%+ “$/6%- 0%$% 3F E)$； D$ （=） ! “! ! #$ 代谢相关基因“ 埃他卡林作用后， 发生改 变的代谢基因包括： 琥珀酸辅酶 # 还原酶黄素蛋白 亚单位、 线粒体长链 $%777=71。 ! “! %$ 埃他卡林作用后脑组织的特异性差异表达 基因“ 正反标两次实验发现埃他卡林作用后， 在该 实验体系下， 对正常脑组织
8、基因表达无影响。 ! GF GF633.+EQ RS)BRS*(*B7! 6167! 7=C$6! =8= OKP76=CC1D*(, *+EQ 2EQEF RM)(E 67! 7BR)M(M%67! =7;3! 78C OKP7C$;RM)(E RS)BRS*(*B =7! 7$C$7! (,M)BE RS)BRS*(*B， M+R()M (,R，7! 63$;! 6$ OKP7C$87B)-L( +*MMEM V*GE-, $37! 6733! 337 W81C16*-RS*%VE2ME)F7! 7168! *-RS* =7! 7C=$SE2E()M7! 7=16=! 77; OKP7=;
9、=3+)*FL-*(E) V*+()M “7! 77! 73767! 81C OKP76=C3C)R* Q+*M2)Y,-*B7! $C63! G(S,-(M*BVM*B7! 6=;6=! 61C OKP76=C13AM)LR%BR+EVE+ +)GR)(7! 6=363! 7;7 W1;8$3G?O. V)M BME RM)(*B ESE2E()M =!37! 7;63! =; K6$C71T0%F-L+LM)B,-(M*BVM*B7! 3 RM)(*B ESE2E()M（:RE=2）7! 78C=6! 76= OKP76;$1;E(M%*-RS*%ESE2E()M I3 S*X, +S*E
10、7! 66667! 6C; K6C$=*B7! 633=! C77 OKP76= .%#7! 6C;$! =87 .J7C=8314C G?O. V)M B(M)- 4C%QB*(LM*B7! 3C 4%$7! 7=C1! $8C OKP7=C6;*-RS*%6%RM)(*B ESE2E()M7! 7$1$=! 3BEX RM)(E 6=7! $61$! 33 RM)(*B ESE2E()M（:RE=+）7! 7;1$1! CC= OKP7=$67$*-RS* （6） %ESE2E()M $7! 7;867! =1$ OKP7C$68IG)RYE7! 6=3BVMME7! 617C! =36
11、.D=786=CF)*Q)(M)RE%MFL-*(Q -)F +S*E *+,-%4). B,(S(*B7! 7=C3M*(Q ZE(S (S ()(*- ?O. EB)-*(Q VM)G +)(M)- FM)LR，ZSE- 4,C% -*2-Q RM)2B ZM FM*(Q ZE(S (S ()(*- ?O. E% B)-*(Q VM)G ER(*IKL0AM06A .-/($ : J5 :6#:;,# QO6 00A: 3 R R -： 125FB-*#B#E ?+ ） 1-B+#/%“(B%:MJ T:6: 06: T:55:5: 3） “2“B-$#F-$ ;） ,(-%# (“B#)
12、*115 ?!(A? “11“ 50 )“. -58*)1 50 =-0:（5）S#+# ?+#$#/#E % +-/ B%D#+$ O7! )-+G#+ +-N#E C+: *? S-$ ($#E % #B#“/+） 。 K D% 反复给予埃他卡林对心肌组织超微结构的影 响R电镜结果发现， 正常对照组、 埃他卡林 0、 5、 A )NGN 0组以及高剂量 A )NGN0撤药组心肌组 织超微结构均正常， 表现为心肌纤维肌膜完整， 排列 整齐， 线粒体丰富， 成排整齐地分布于肌原纤维之 间， 线粒体质膜结构完整， 嵴排列清晰可见。说明反 复给予埃他卡林 0、 5、 A )NGN 0对大鼠心肌组织
13、 的超微结构无影响 （%N M） 。 M:5中国药理学通报R ? ? %-4* 1-)5,5“.4 , 5“* )“56-“) *-+7( “*(5 *5(“*A 1(3* B-*4 -.*“/“0-1（ 1 BFF） O O ?： (96(A；;：J*6 0 ,- .- /0； ： J*6 G ,-.-/0； =： J*6 I ,-.- /0； ： J*6 I ,- .-/0K L86MN5L5A =- $%： J*6 0 ,- .- /0； ： J*6 G ,-.-/0； =： J*6 I ,-.- /0； ： J*6 I ,-.-/0K L86MN5L5A 道 H $I； 同时本实验室前
14、期研究发现埃他卡林作用 可升高人主动脉平滑肌细胞和 := 大鼠尾动脉平滑 肌细胞蛋白激酶 ? （5； C; （G） 酸酪氨酸残基去磷酸化， 其作用是控制磷酸酪氨酸 残基的寿命， 使静止细胞具有较低的磷酸酪氨酸残 基的水平。在变化的这些信号转导分子中， 还有 !“# 相互作用蛋白 $、 信号转导子和转录激活子 %浓度的 功能， 其中 -结合蛋白 （7， 近年来认为 7 1:84=$32%6 9%2:46:%)41:84=404=9 %C2=(12$4) D . )* +, -“. ()2(*4)$L$)* AB3%)3$2$?% T 1:() )%83 $) 6()1=%(2$1，1(=6=42
15、%$) %00%123 4) AB3%)3$2$?% T 1:()%83 $) =(2 ?%)2=$1,8(= 9;41;2%3 D . -“.5/6( 7， QRRF， “!： ERF(. QFB%=L$1 A，,=(1:$ V. K;2437%8%24) %00%123 4) $4) 1:()%83 D . 4$, 8/6(“.,.96 %.23=,= =?5=0012, =0 1, A=-6，B-1, -,: .1C= B/ ;,()， ()GF3） . M1() (=(; U FFF X(3 ,3% -/N/ U F 04= 3$)* OBKO. “O(23 X%=% =() 9(8 14)2=48 *=4,6 () =(88; ( )(9$13 6(=(9%2%=3 $) ()%32:%2$L% 2%= EG: (2 2:% %) 484*$1(8 1:()*%3 4) 9;41(= 2=(32=,12,=%. H2, 2(8 14) *()3. 562(7(8$9 3:4X3 )4 3$%00%123 4) 1(= 2$4) ()“ EFFJ W(=； % （U）