小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验检测染料木素的诱变性.pdf

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1、8 8 0现代预防医学2 0 0 5 年第3 2 卷第8 期M o d e m P re v e n t i v e M e d i c i n e , 2 0 0 5 , V o l . 3 2 , N o . 8 论著】 小鼠淋巴瘤细胞T K基因突变试验 检测染料木素的诱变性 乌 R 鸣，张立实 摘要l目的: 用小鼠淋巴瘤细胞T K 基因突变试验检测染料木素的诱变性。方法: 不加S 9 活化的条件下， 用染料 木 素5 , 1 0 , 1 5 , 2 0 1* / m l 处 理1 5 1 7 8 Y 细 胞3 h ， 采 用 微 孔 板 法 进 行 细 胞 毒 性、 平 板 接 种 效

2、率和 突 变 频 率 测 定。 结 果: 随 染 毒剂量的增加， 染料木素对1 5 1 7 8 Y 的细胞毒性增大。染料木素能诱发I 5 1 7 8 Y 细胞t k 位点突变频率显著增高，当剂量达到 1 5 p g / m l 以 上 时 其 锈发突 变 频 率 为自 发突 变的3 倍以 上。 结论: 染料木素 对I 5 1 7 8 Y 细胞有明 显的 细 胞毒性， 并可诱发t k 基因突变。 关键词 L 5 1 7 8 Y 细胞; t k 基因突变; 染料木素 【 中图分类号R 1 1 4 文献标识码A【 文章编号1 0 0 3 - 8 5 0 7 ( 2 0 0 5 ) 0 8 - 0 8

3、 8 0 - 0 3 D E T E C T I O N O F MU T A G E N I C I T Y O F G E N I S I h 1 N B Y MO U S E L Y MP H O MA A S S A Y . W U M i n g , Z H A N G l i - s h i . W e s t C h in a S c h o o l of P u b l i c H e a l t h ，S ic h u a n U n i v e r s i t y , C h e n g d u , 6 1 0 0 4 1 . A b s t r a c t : O l 幼

4、 e c ti v e : T o d e t e c t a n d e v a l u a t e t h e T K g e n e m u t a t i o n i n d u c e d场 g e n i s t e i n . Me t h o d s : 1 5 1 7 8 Y m o u s e l y m p h o m a c e ll s w e re e x p o s e d t o g e n is t e i n a t c o n c e n t r a t i o n s 5 , 1 0 , 巧a n d 2 0 W m l f o r 3 h o ur s

5、 w it h o u t S 9 m e t a b o li c a c ti v a t io n . D e te r m i n a ti o n o f c y to to x ic i - ty , p l a t i n g e f fi c i e n c y a n d m u t a n t f r e q u e n c y w e re p e r f o r m e d b y u s i n g t h e m ic r o w e ll m e th o d . R e s u lts : C y t o to x i c i ty o f g e n is t

6、 e in f o r 1. 5 1 7 8 Y c e l ls in c r e a s e d d o s e - d e p e n d e n t ly . I n d u c e d m u ta n t f re q u e n c y w a s in c r e a s e d s i g ni fi c a n t l y t h a n s p o n ta n e o u s m u t a n t f re q u e n c y a t T K l o c u s i n 巧1 7 8 Y c e ll s a t c o n c e n t r a t i o n

7、 s o f 巧1 R S , 3 0 . 4 %R S G 剂量下的R S 可能在 1 0 %一 2 .0 %的理 想范围内， 故 正式 试验的 剂量 定为5 , 1 0 , 1 5 , 2 0 p g / n d . 2 . 2 细胞毒性测定见表 1 、图1 。随染毒剂量的增加， 各剂量组 R S G , R S , R T G均有下降趋势， 最高剂量组 R S G 为4 5 . 9 0 %, R S 为1 0 . 1 8 %, R T G为1 3 . 8 0 %， 表现出较大 的细胞毒性。 表 1 细胞毒性和突变频率测定结果 组 别浓 度 、臀 。凰 臀。 黑6) % SC D o s

8、e ( t g / d 图2 染料木素诱发1 5 1 7 8 Y 细胞t k 位点总突变频率 D M S O ( x 1 0 一 z ) 1 0 0 . 0 00 0 1 0 0 . 0 0 5 0 . 8 7 77 . 7 8 染料木素 ( ( 1m 1 ) 5 . 0 0 8 5 . 4 99 3 . 4 7 7 1 . 3 6 8 0 . 2 98 3 . 3 3 8oo 596765 ，1傀 1 0 . 0 0 巧 . 0 0 7 8 . 3 57 0 . 3 4 6 5 . 1 0 2 0 . 0 0 2 0 . 1 5 1 0 . 1 84 5 . 9 0 3 9 . 3 5 1

9、3. 8 0 . 8 5 8 1 . 2 5 . 9 4 8 4 . 6 2 6 9 8 5 . 7 1 MM S 1 0 . 0 0 4 1 . 9 3 5 9 . 8 8 2 6 . 3 2 4 1 3 . 2 3 7 9 . 5 5 注:， 与溶剂对照 ( D M S O )比较 P 0 . 0 5 2 . 3 t k 位点总突变频率及小集落百分比见表 1 、图2 0 随染料木素浓度增大，L 5 1 7 8 Y 细胞t k 位点的总突变频率有 3 讨论 本次试验中， 溶剂对照 ( D M S O )的P E O , P E 2 和，T M F 分别为6 0 . 4 4 %, 7 1 .

10、6 6 %, 5 0 . 8 7 x 1 0 - 6 ; 最高剂量组的R S 为1 0 . 1 8 %; 阳性对照 ( M A E )的突变频率与溶剂对照比 较 差异有统计学意义 ( P 0 . 0 5 )且达到溶剂对照的 8 倍以 上， 表明本试验系统可靠。 本试验结果表明，随染料木素浓度增大，L 5 1 7 9 Y细胞 tk 位点的总突变频率有升高的趋势。当染毒剂量为1 5 . 0 0 N 岁 m l 时， 染料木素即对L 5 1 7 8 Y 细胞表现出明 显的诱变性， 其诱发突变频率为自 发突变频率的3 倍以上。这与国外染 料木素在体外遗传毒性试验中呈阳性结果的报道相一致。 但现有报道多

11、数显示染料木素不具有体内遗传毒性。 R e c o r d ? 等以 染 料 木 素2 0 m g / 吨. b w 剂量喂 饲小鼠5 d 后， 小鼠 血浆中 染 料木素 浓度已 达9 . 2 娜， 远远高于长期大量 食用大豆的 人群中 血浆染料木素水平 ( 0 . 2 7 6 娜) ， 仍未见 小鼠 脾细胞中 微核形成率显著增加; 但在体外微核试验中， 当 剂 量达2 5 礴 时， 染料木素能 诱导小鼠 脾细胞微核形成 率明显增加。体外体内试验结果不一致， 其原因可能是体 外试验中染料木素表现出遗传毒性需要较高的剂量， 但在 正常情况下， 如此高的剂量在体内靶组织不能达到， 从而 ( 下转第

12、 8 8 6 页) 8 8 6现代预防医学2 0 0 5 年第 3 2 卷第8 期M o d e m P r e v e n ti v e M e d ic i n e , 2 0 0 5 , V o l . 3 2 , N o . 8 表2 精液其它参数与吸烟因素的关系 姗382咖溯001019姗溯姗255 0.0.0.0.0.0.0.0.0.认 精液参数 体积 r n l p H 值 。 级活动精子百分率 ( %) a 十 b 级活动精子百分率 ( %) 精子密度 ( x 1 0 6 / m l ) 总精子计数 ( x 1 护 ) 精子存活率 ( %) 正常精子形态百分率 ( %) 白细胞

13、数计数 ( x 1 护 / m l ) 生精细胞计数 ( x 1 0 6 / m l ) 吸烟 ( n 二 5 6 8 )不吸烟 ( n 二 4 3 2 )t 值 尸值 2 . 2 1 7 1 士0 . 7 .土0 . 1 7 1 士0 . 8 5 4 8 70 . 8 1 5土0 . 2 2 4 2 6 2 2 7 8 t 6 . 0 8 8 3 5 、门口 OnJ“月峙气 种j.凡月凡 7n石U闷2 、，.吸二IJCllCU . 1 3 1 7 . 4 8 6 4 t 1 2 . 士4 3. 3 1 1 0 7 巧3951 1 2 6. 9 3 8 9 t 1 4 8 5 8 . 1 4

14、2 3士 5 9 . 2 5土1 3 0 . 8 0 6 7 t 1 . 2 . 4 3 8 9士1 . 0 0 1 6 8 7 . 4 9 4 0 t 0 . 2 2 1 7 0 1 9 . 2 5 6 9.t 6 . 7 1 1 0 8 4 4 . 7 8 1 3 11 1 . 5 9 0 2 3 印 . 3 7 7 3 13 7 . 7 4 7 3 4 1 4 6 . 9 7 3 2 3士1 2 1 . 2 5 0 8 2 6 3 . 6 7 1 3 士1 2 . 3 9 4 3 6 6 3 . 6 2 3 9 t 1 0 . 6 4 6 1 3 0 . 4 5 9 0士0 . 7 6

15、1 2 0 0 . 4 4 5 1 10 . 7 6 1 2 0 0 . 4 0 6 9 10 . 6 7 9 3 9 一3 . 6 9 2 一0 . 8 7 5 一9 . 7 8 6 一7 . 4 3 2 一3 . 4 4 3 一2. 3 5 1 一6 . 6 8 6 一5 . 又 5 5 6. 2 1 7 1 . 1 3 9 发现，吸烟者对婚年男子精液液化时间、粘稠度、凝集反 应、 p H 值、 生精细胞计数无明 显影响， 但对体积、 a 级、a + b 级活动精子百分率、 精子密度、总精子计数、精子存 活率、 正常精子形态率、白细胞计数却有明显影响。造成 精液质量下降的因素可能与下列原因

16、有关: 有害物质香 烟烟气凝结液可影响生殖细胞的成熟和增殖， 是精子发生 的 致突 变 物 质2 - 4 1 . 香烟烟气凝结液抑制 保持精子活力 的胆碱乙酞化酶: 精子含有乙酞胆碱 ( A c h ) 、胆碱乙酞化 酶 ( c h A )和乙酞胆固醇酶 ( A c h E ) ; 精子活力在某些方面 类似平滑肌的自 主性， 三者保持一个A c h 合成、 刺激受体、 水 解 循 环 圈， 对 精 子 的 收 缩 和 舒 张 起 作 用; B r ig g s ) 发 现 重度吸烟者血浆皋酮浓度下降显著低于为吸烟者， 导致临 床精液质量下降。因此， 我们在做男性生殖预防保健时， 尽可能劝戒那些

17、2 4 一 3 6 岁男子戒除吸烟的习惯。避免吸烟 对精液的不良 影响。尤其是那些因精子密度降低， 精子活 动力低下，畸形率较高的不育者。 由于影响精液质量变化的因素很多， 如饮酒、放射线、 化学毒物等， 甚至还有其他一些鲜为人知的影响因素。在 本文均未作详细的相关分析， 为避免这些偏倚， 我们采用 尽可能大的样本来探讨吸烟对精液质量的影响。 参考文献 1 1 世界卫生组织. W H O 人类精液及精子一宫颈粘液相互作用实验 室检验手册 M . 第4 版. 北京: 人民 卫生出 版社， 2 0 0 1 : 2 5 一5 1 . 2 1 K u l ik a u s k a s V , A b

18、l i n K l , B l a u s t e i n D . 匀 De r m a t o z o a l a b e r r a t i o n s in C ig a re tt e s m o k e s J A R C S M e d S c i . C l i n p h a r m a c o l a n d 1 1 i e r . 1 9 8 4 , 1 2 : 1 0 7 6 . 3 K u l i k a u s k a s V , B l a u s te in D , A b l in R J , C i g a r e tt e s m o k i n g a n

19、 d i ts p o s s ib l e e ff e c t s o n s p e r m J . F e r ti l a n d s t e r il . 1 9 8 5 , 4 4 : 5 2 6 . 4 1 K e i r L D Y a m a d a k i E , A m e s B N . D e t e c ta t i o n o f m u ta g e n i e a c t i v i t y i n c i g a r e tt e s m o k e c o n d e n s a t e s J . P r o c N a t A c a d S c i

20、 U S A . 1 9 7 4 , 7 1 : 4 1 5 9 . 5 B r ig g s M H . C i g a re tt e S m o k in g a n d in f e rt il ity in m e n J . M e d Mu s t . 1 9 7 3 , 1 :6 1 6 . 收稿日 期 2 0 0 4 -1 1 -0 1 ( 上接第8 8 1 页) 不能表现出遗传毒性。故通常认为染料木素作为大豆食品 中的一种天然成分是安全的 8 ) 。 另外， 有研究提示染料木 素具有一定诱变性的同时，可能具有一定的抗诱变性。 G i 子 9 等报道染料木素可明显抑制7 ,

21、1 2 一 二甲 基苯葱 ( D M - B A )诱导的小鼠骨髓细胞姐妹染色单体交换 ( S C E )发生 以及大鼠肝细胞和乳腺细胞中 D N A加合物 ( D N A a d d u c t ) 的形成， 但其抗诱变的机制尚 不清楚。 M L A 中可观察到大、 小两种表型的突变集落， 关于大 小集落产生的分子机制，目 前尚未完全清楚。通常认为大、 小集落源于不同程度的基因损伤， 大集落与小范围遗传物 质改变有关， 如点突变、 小缺失、小插人， 而小集落涉及 等位基因 缺失及染色体水平的大范围改变 。本试验结果 表明， 染料木素对”1 7 8 Y 细胞诱发突变以 小集落为主， 这 可能与

22、染料木素作为拓扑异构酶 II ( T o P o II )抑制剂诱发 D N A 链断 裂的作用 8 1 有关。 T o P o I I 是一种重要的 核酶， 能 修饰D N A的拓扑结构， 参与D N A复制、 转录和重组，以及 同源染色体的分离。正常情况下， T O P O II 在切开 D N A双链 后， 酶蛋白与末端D N A以非共价键结合形成一种暂时性的 易解离复合物以完成D N A 链切口的接合。染料木素的抑制 作用在于使这种易解离复合物趋于稳定，即使 T O P O II与 D N A 共价结合， 从而导致断开的D N A双链不能接合。但对 于大小集落突变体细胞分子生物学和细胞

23、遗传学有哪些具 体改变以及能否通过评价致突变物诱发小集落的能力来判 断其诱发突变的性质和机理有待进一步深人研究。 o f s p o n t a n e o u s a n d m e t h y l m e t h a n e s u l f o n a te - i n d u c e d t r ifl u o r o t h y m id i n e - r e s i s t a n t 1 5 1 7 8 Y c e l l c o l o n i e s J . M u t a t R e s , 1 9 9 6 , 3 7 0 ( 3 - 4 ) : 1 8 1 一1 9 0

24、. 幻C o m b e s R D , S t o p p e r H , C a s p a ry W J . T h e u s e o f 1 5 1 7 8 Y m o u s e 咖- 户。 c e ll s t o a s s e s s t h e m u ta g e n i c , c l a s t o g e n i c a n d a n e u g e n i c p r o p e r - t i e s o f h e m i c a l s J . M u t a g e n e s i s , 1 9 9 5 , 1 0 ( 5 ) : 4 0 3 一 4

25、0 8 . 3 K u ll in g S E , M e tz l e r M . I n d u c t io n m i c ro n u c l e i , D N A s tr a n d b r e a k s a n d H P R T m u ta t i o n s i n c u l t u r e d C h i n e s e h a m s t e r V 7 9 c e ll s 师t h e p h y - to e s t r o g e n c o u m o e s t r o l J . F o o d C h e m T o x i c o l , 1

26、9 9 7 , 3 5 ( 6 ) : 6 0 5一6 1 3 . 4 M i s r a R R , H u r s t i n g S D , P e r k in s S N , e t a l . C e n o t o x i c i t y a n d c a r c i n o - g e n i c it y s t u d i e s o f s o y i s o fl a v o n e s J . I n t J T o xi c o l , 2 0 0 2 , 2 1 ( 4 ) : 2 7 7 一 2 8 5 . 5 H u m u s . M , S o f u

27、n i T . M e m o u s e l y m p h o m a a s s a y ( M L A ) u s i n g t h e m i - c ro w e ll m e th o d M . G e n e t i c t o xi c o l o g y a n d c a n c e r r is k a s s e s s m e n t . N e w Y o r k : M a r cel D e k k e r I n c . ， 2 0 0 1 :1 4 1 一1 6 1 . 6 C le m e n ts J . T h e m o u s e ly m

28、p h o m a a s s a y J . M u tes t R e s , 2 0 0 0 2 0 ; 4 5 5 ( 1 - 2 ) : 9 7 一 1 1 0 . 7 R e c o r d I R , J a n n e s M , D r e o s t i I E , e t a l . I n d u c t i o n o f m i c ro n u c l e u s f o r - m a t i o n in m o u s e s p l e n o c y te s 勿t h e s o y i s o fl a v o n e g e n is t e i

29、n i n v i t r o b u t n o t i n v iv o J . F o o d C h e m T o x i c o l , 1 9 9 5 , 3 3 ( 1 1 ) : 9 1 9 一 9 2 2 . 8 B o o s G , S t o p p e r H . G e n o t o x ic it y o f s e v e r a l c l i n i c a ll y u s e d t o p o i s o m e r a s e I I i n h i b i t o r s J . T o x i c o l L e tt , 2 0 0 0 ,

30、 1 1 6 ( 1 - 2 ) : 7 一 1 6 . 9 G iri A K , L u I J . G e n e t i c d a m a g e a n d t h e i n h ib i t i o n o f 7 , 1 2 - d im e t h y l - b e n z a a n th r a c e n e - i n d u c e d g e n e t i c d a m a g e 坊t h e p h y to e s t r o g e n s , g e n i s - t e i n a n d d a id z e i n , i n f e m a l e I C R m i c e J . C a n c e r L e tt , 1 9 9 5 , 9 5 ( 1 - 2 ) :1 2 5 一 1 3 3 . 收稿日 期 2 ,0 0 5 -0 4 -2 9 参考文献 1 Z h a n g I S , H o n m a M , M a ts u o k a A , e t a l画n i in g a n a l y s i s