基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌O157H7和霍乱弧菌O139.pdf

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1、收稿日期 2005 -06 -05 基金项目 国家科技攻关计划项目（2003BA712A03 -09） 作者简介 徐晓静 （1972 - ） ， 女， 内蒙古自治区呼和浩特市 人， 博士。E-mail： xuxiaojing72 sina. com。 *通讯联系人， Tel：010-66932211， E-mail：sqwang nic. bmi. ac. cn 基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌 O157:H7 和霍乱弧菌 O139 徐晓静1， 2， 文思远1，陈苏红1，马学恩2，王 华1，王升启1 * （1. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所， 北京 100850； 2. 内蒙古农业大学动物

2、科学与医学学 院， 呼和浩特 010018） 摘要 目的： 建立一种同时快速检测肠出血性大肠杆菌 （EHEC） O157: H7 和霍乱弧菌 O139 的基因芯片， 并验证 该芯片的特异性和敏感性。方法： 选择 EHEC O157: H7 的产志贺样毒素基因 stx1、 stx2 和 -葡糖醛酸糖苷酶基因 （uidA） ； 霍乱弧菌 O139 的肠毒素 A 亚单位 （ctxA） 、 毒力协调菌毛 A 亚单位 （tcpA） 、 糖基转移酶 （glycosotransferase LPSgt） 基因序列分别设计引物和探针， 反向引物用荧光素 Cy3 标记， 探针在 3 端氨基修饰。在优化的 PCR

3、 和杂交 反应条件下， 分别进行三重 PCR 扩增， 产物混合后与芯片进行杂交， 产生特异性荧光信号， 进一步筛选探针。随后 将筛选出的探针制备芯片用于检测临床样本。结果： PCR 产物在相应探针处均产生特异性杂交信号， 临床样本检 测结果表明， 此芯片比常规细菌学检测方法灵敏。结论： 所研制的同时定性检测 EHEC O157: H7 和霍乱弧菌 O139 的基因芯片是特异、 灵敏而且快速的， 为这两种肠道致病菌感染的快速诊断提供了新的方法。 关键词 基因芯片； 多重 PCR； 大肠杆菌 O157: H7； 霍乱弧菌 O139 中图分类号 Q503文献标识码 A 文章编号 1000-5501

4、（2006） 02-0122-06 Detection and identification of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 and Vibrio cholerae O139 using genechip technology XU Xiao-Jing1， 2， WEN Si-Yuan1， CHEN Su-Hong1，MA Xue-En2，Wang Hua1， WANG Sheng-Qi 1* （1. Institude of Radiation Medicine， Academy of Military Medical Scienc

5、es， Beijing 100850， China； 2. School of Animal Sci- ence and Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018， China） Abstract Objective： To develop a rapid， specific and sensitive method of genechip assay for simultaneous identification of enterohemorrhagic Escherichia coli （EHEC）O157:

6、 H7 and Vibrio cholerae O139. Methods：Three pairs of primers were designed for EHEC O157: H7 multiplex PCR， corresponding to stx1， stx2（Shiga-like toxins gene）and uidA （-glucuroni- dase gene）respectively， and three pairs of primers for O139 corresponding to toxin sub-unit A（ctxA） ，toxin co-regulated

7、 pili subunit A（tcpA）and glycosotransferase（LPSgt） . Sixty spare oligonucleotide probes were designed to capture the re- verse strand of the PCR product. Consequently，only the reverse primers required fluorescein（Cy3）modification at 5-ter- minal，and all probes were synthesized with 3 amino-group mod

8、ification. Then the multiplex PCR system was optimized， two sets of multiplexed PCR amplified product were mixed and then hybridized on the surface of the microarray containing sixty oligonucleotide probes，and specific signal were detected. The best probes were chosen according to the six reference

9、gene segments and were used to prepare the microarray which contained positive control and negative control. The microarray was used to detect clinical samples. Results： The results showed that the sensitivity of oligonucleotide microarray was better than that of the routine bacteriology method. Con

10、clusion：It is proved that the microarray is a reliable method for detection and identification of EHEC O157: H7 and V. cholerae O139 simultaneously. Key words oligonucleotide microarray； multiplex PCR； Escherichia coli O157: H7； Vibrio cholerae O139 肠出血性大肠杆菌 （enterohemorrhagic Escherichia coli， EHEC

11、） O157: H7 于 1982 年首次被证实为致病菌 1， 能引起 出血性肠炎和溶血性尿毒综合征等严重的临床症状， 可通过 食物和饮水导致大规模暴发 2， 3。EHEC O157: H7 的致病性 与多个基因有关， 其中包括产志贺样毒素基因 stx1、 stx2 4， 5， -葡糖醛酸糖苷酶基因 uidA （gusA） 等 6， 7。有研究者采用 stx 基因对 EHEC O157: H7 进行鉴定 8， 但 O157 家族成员中 非 H7 型及其他致病性大肠肝菌也可能含有 stx 基因 9， 因 221 军事医学科学院院刊 2006 年 4 月 第 30 卷 第 2 期 Bull Aca

12、d Mil Med Sci，Apr 2006； Vol 30 No 2 此， 只针对 stx 基因的检测结果进行鉴定并不可靠， 还需结合 O157: H7 特异性基因的检测才能进行鉴定。研究表明， O157: H7 型的 uidA 基因中 + 93 位碱基特异性的由 T 突变 为 G 10， 这为 O157: H7 与其他产 stx 毒力基因的肠道菌进行 区分提供了依据。有研究者通过核酸杂交法对 O157: H7 uidA基因内保守突变位点进行检测， 从而对 O157: H7 型与 非 H7 型进行鉴别 10。 霍乱弧菌 O139 是 1992 年才发现的一种新型菌株， 也可 引起以腹泻为主要

13、症状的烈性传染病 11， 以发病急、 传播 快、 波及范围广、 能引起大规模流行为特征。研究表明， 霍乱 弧菌 O139 型是由 O1 型变异而来 12。O139 型和 O1 型霍乱 弧菌都含有两种主要的毒力基因 ctxA 和 tcpA 13， 但它们的 糖基转移酶基因 （LPSgt） 组成却存在差异 14。有应用 PCR 技术进行快速诊断的研究， 其中通过识别 PCR 产物中的 ctxA 和 tcpA 来区分霍乱菌株和非霍乱弧菌， 然后根据 tcpA 基因的不同 DNA 序列来区分古典生物型和埃尔托生物型。 但不能区分出 O139 型菌株。最近法国巴斯德研究所开发出 一种 “一步免疫色谱 d

14、ipstick” 法来检测霍乱弧菌 O1 和 O139 15， 但灵敏性和特异性有待提高。 快速检测和鉴定病原体是突发性传染病诊断、 治疗和控 制的关键。长期以来， 致病性 O157: H7 和 O139 感染的实验 室诊断主要依靠传统的细菌学检测方法， 步骤繁琐且需要数 天才能得出结果 16。免疫学方法也存在特异性和敏感性问 题。因此， 建立一种快速而且特异的诊断方法已成为一项重 要研究课题。近年来， PCR 和核酸杂交技术的应用促进了细 菌检测技术的发展， 但存在一定的局限性。目前， 对于多基 因同时检测才能鉴定的病原体， 基因芯片技术以其特有的优 势已被应用于病原体的检测。基因芯片是近年

15、来发展起来 的能同时检测多基因的技术， 具有高通量、 成本低、 污染少、 可多基因平行检测等特点 4， 17。本研究利用这一技术研制 了一种低密度芯片， 在多重 PCR 基础上， 通过识别 PCR 产物 中 ctxA、 tcpA 和 LPSgt 基因来区分 O139 菌株； 此芯片能同时 检测 O157: H7 的 stx1 和 stx2 毒力基因以及 uidA 基因内保 守突变位点， 从而对 EHEC O157: H7 进行鉴定。 1 材料和方法 1. 1 菌株及模板 EHEC O157 : H7 W933、 882364 株， 霍 乱 弧 菌 O139 M045、 1837 株来自中国药品

16、生物制品检定所； O1 型霍乱弧 菌 569B 株， 小川型霍乱弧菌， O157: H7 和 O139 地方株， 一 些常见肠道菌， 以及临床标本由浙江省疾病预防控制中心提 供。细菌 DNA 用 Promega 试剂盒提取。 用于标记修饰的荧光素 Cy3TMAmidite 购自 Amersham Pharmacia Biotech。实验所用的酶或其他生物学试剂等均购 自 Promega 公司和 TaKaRa 公司。 1. 2 引物和探针 根据 GenBank 和相关参考文献， 应用 PRIMER5. 0 软件 设计引物和探针序列。选择 stx1、 stx2 和 uidA 基因用于 O157:

17、H7 三重 PCR 扩增， uidA 引物间序列包含 +93 位突变 位点； O139 进行三重 PCR 扩增的引物来自 ctxA、 tcpA、 糖基 转移酶基因 （LPSgt） 序列。反向引物序列 5端用荧光素 Cy3 标记修饰。针对上述基因 PCR 产物序列， 共设计 60 条备选 探针， 探针的核苷酸序列与 PCR 产物带有荧光的反向链互 补， 长度为 19 60 mer， 并在 3端氨基修饰。探针和引物序 列经 BLAST 分析确定其特异性。同时还用反向 （荧光标记） 引物的互补序列合成探针， 作为阳性对照， 选择与肠道菌无 关的探针作为阴性对照。引物序列见表 1。备选探针序列 未列出

18、。 表 1 本研究所用的引物序列 基因名称序列 （53）产物长度 （bp）备 注 stx1GAA TTT ACC TTA GAC TTC TCG AC正向引物 TCC TGT TAA CAA ATC CTG TCA C250反向引物 stx2TAC GAT AGA CTT TTC GAC TCA AC正向引物 TCA ATA ATC AGA CGA AGA TGG TC207反向引物 uidATAA TGA GGA GTC CCT TAT GTT AC正向引物 ACT GAT CGT TAA AAC TGC CTG G179反向引物 ctxAACT CAG ACG GGA TTT GTT AG

19、G C正向引物 ATC TAT CTC TGT AGC CCC TAT TAC304反向引物 tcpATTG ACC CAA GCA CAA TGT AAG AC正向引物 CTA CTG TGA ATG GAG CAG TTC C241反向引物 LPSgtACA TCT GTA GGG ATT GTA TTG AC正向引物 ATA ACA ACT GAG ATA TCA AGC GTC340反向引物 1. 3 PCR 扩增 在 20 l 常规 PCR 反应体系中， 正、 反向引物浓度均为 1 mol/ L， 100 mol/ L dNTP，1 U TaqDNA 聚合酶， 1 PCR 反应缓冲液

20、， 50 100 ng 模板 DNA； 扩增条件为： 94预变性 5 min； 经变性 （94， 30 s） ， 退火 （55， 30 s） ， 延伸 （72， 30 s） ， 35 个循环； 最后于 72延伸 5 min。对荧光标记不对 称 PCR 反应条件进行优化。 1. 4 标准质粒构建 EHEC O157: H7 W933 株和霍乱弧菌 O139 M045 菌株中 提取 DNA 作为模板， 用每对引物 （未标记荧光） 进行常规 PCR 扩增。扩增产物经纯化后分别与 pGEM-T 载体连接转 化入大肠杆菌 DH5 中， 37 摇菌过夜， 用 Promega 质粒提 321 第 2 期 徐

21、晓静， 等 . 基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌 O157: H7 和霍乱弧菌 O139 取试剂盒提取质粒。经纯化后测序， 鉴定阳性克隆， 计算所 提取质粒的拷贝数并进行 10 倍系列稀释， -20保存， 作为 PCR 扩增的模板。 1. 5 芯片的制备和杂交 将合成的探针用点样液 （6 SSC， 0. 1% SDS） 稀释至终 浓度 50 mol/ L， 取 5 l 转移至 384 孔板。用 Cartesian 芯片 制备仪将探针点到醛基片 （Telechem） 上， 每点体积约为 0. 5 nl， 点芯间距为 500 m， 点直径约为 200 m， 点样时保 持湿度 90%， 温度 23。点

22、样后的芯片在使用前于室温放 置至少 24 h。 荧光标记的 PCR 产物变性 （98， 2 min） 后与杂交液 （5 SSC， 5 Denhardt 液， 10 g/ ml 鲑精 DNA， 0. 3% SDS） 混 匀， 取 10 l 转移至芯片反应区， 芯片置于杂交盒内， 连同杂 交盒浸入 42水浴中反应 90 min， 杂交后的芯片依次在洗 液 A （1 SSC， 0. 2% SDS） ， 洗液 B （0. 2 SSC） 和洗液 C （0. 1 SSC） 中于室温各洗涤 1 min。置室温晾干后， 芯片用 共聚焦扫描仪 GenePix 4000B 进行扫描， 用 GenePix Pro

23、4. 0 软件分析结果。 2 结果 2. 1 PCR 扩增条件优化 多重不对称 PCR 反应中， 3 对引物之间浓度的改变对目 的基因的扩增效率有明显影响， 每个基因的正向与反向荧光 引物的比例和杂交信号的强弱密切相关。经过多次实验， 使 一个反应管中 3 个产物均能达到相近而且较好的扩增效率 和杂交信号。优化的结果为： O157: H7 多重 PCR 反应中 stx1， stx2 和 uidA 基因的正向引物浓度分别为 0. 15 mol/ L， 0. 1 mol/ L， 0. 1 mol/ L， 反向荧光标记引物浓度分别为 0. 75 mol/ L， 0. 5 mol/ L， 0. 5 m

24、ol/ L； O139 多重 PCR 反应 中 ctxA、 tcpA、 LPSgt 基因的正向引物浓度分别为 0. 15 mol/ L， 0. 15 mol/ L， 0. 2 mol/ L， 反向荧光标记引物浓度分别为 0. 75 mol/ L， 0. 75 mol/ L， 1. 0 mol/ L。20 l 反应体系中， dNTP 为 200 mol/ L， MgCl2为 3 mmol， 2U Taq DNA 聚合酶， 1 PCR反应缓冲液； 扩增条件为： 预变性 （94， 5 min） ，变 性 （94， 30 s） ， 退火 （56， 30 s） ， 延伸 （72， 30 s） ， 40

25、个 循环； 延伸 （72， 5 min） 。结果见图 1。 图 1 单一和多重 PCR 产物电泳检测结果 1 3. 分别为 stx1， stx2， uidA 扩增片段； 4. EHEC O157: H7 三重 PCR 扩增片段； M. DL2000 标志物， 可见的两条带为 250 bp， 500 bp； 6. 霍乱弧菌 O139 三重 PCR 扩增片段； 7 9. LPSgt， ctxA， tc- pA 扩增片段 2. 2 探针筛选 以不同浓度的模板扩增的单一和多重 PCR 产物， 与备 选探针杂交筛选结果如图 2。此图是三重 PCR 产物混合杂 交结果， PCR 扩增模板为 104拷贝质粒

26、 DNA。每个基因有 10 条备选探针， 杂交后扫描分析结果， 在扣除背景值后， 信号强 度以每条探针重复点的均值计算， 所选择的探针见表 2。统 计分析结果为： stx1 的 7 号、 stx2 的 10 号、 uidA 的 9 号、 LPSgt 的 10 号探针在与其不同模板量的 PCR 产物杂交时信号值 都明显高于其他探针， 而且无其他基因探针产生非特异信 号。uidA 基因 +93 位突变位点位于其 9 号探针中间位置， 探针序列较短， 与不含突变位点的 10 号探针相比具有特异 性， 说明此探针可用于检测 uidA 基因的突变位点。ctxA 的3 号、 4 号和 6 号探针杂交信号值

27、统计结果相近， 但 4 号探针 特异性更好。tcpA 的 2 号、 5 号和 9 号杂交信号值在高拷贝 时相近， 但低拷贝时 9 号明显高于 2 号和 5 号。因此， 针对 两种病原体的 6 个基因筛选出的探针分别为 stx1 7 号、 stx2 10 号、 uidA 9 号、 ctxA 4 号、 tcpA 9 号和 LPSgt 10 号。筛选出 的 6 条探针在检测特异性与信号强度方面均较好。将筛选 出的探针连同阳性、 阴性对照按图 3 阵列制备芯片， 再进行 杂交条件优化。 比较了不同成分的杂交液以及离子浓度的改变对杂交 效果的影响， 对所有探针来说， 最终选择的杂交液成分为 6 SSC，

28、 1 Denhardt 液， 0. 2% SDS， 可保证 6 条探针均能达 到很强的杂交信号和较高的信噪比， 杂交温度为 50， 反应 60 min即可使探针与 PCR 产物有效且特异性结合。 图 2 备选探针杂交结果 （PCR 模板为 104拷贝 DNA） 第 1 3 行分别为 stx1， stx2 和 uidA 基因的探针， 检测大 肠杆菌 O157: H7； 第 4 6 行分别为 ctxA， tcpA， LPSgt 基 因的探针， 检测霍乱弧菌 O139 阳性对照stx1stx1stx1stx1阴性对照 （无关探针） 阳性对照stx2stx2stx2stx2阴性对照 （无关探针） 阳性

29、对照uidAuidAuidAuidA阴性对照 （无关探针） 阳性对照ctxActxActxActxA阴性对照 （点样液） 阳性对照tcpAtcpAtcpAtcpA阴性对照 （点样液） 阳性对照LPSgtLPSgtLPSgtLPSgt阴性对照 （点样液） 图 3 基因芯片阵列排布 421军事医学科学院院刊 2006 年 4 月 第 30 卷 第 2 期 表 2 探针序列 基因名称序列 （53） 长度 （bp） 退火温度 （） stx1GTA CGT CTT TAC TGA TGA TTG ATA GTG GCA CAG GG3573. 5 stx2AGT TAT TTT GCT GTG GAT

30、ATA CGA GGG CTT GAT GT3569. 6 uidATGG AAT TGA GCA GCG TTG G1970. 1 ctxACAT ACA GTC CTC ATC CAG ATG AAC AAG AAG TTT CTG CTT TAG GTG4575. 0 tcpACAG GAA GTG CCA ACT TAA ACC TAA CTA ATA TCA CGC ATG TTG AGA4576. 8 LPSgtTCG ATA AGA AGA GAT AAA GAT CTG AGT TAT CTA AAG ATA TTT G4371. 2 阴性对照TCT TCG CCA GAG G

31、CC TGC TAG CCT GGT TCA AGA TAC TAC C4068. 5 阳性对照反向荧光引物互补序列4070. 5 2. 3 探针的特异性检测 为考察探针的特异性， 在优化的三重 PCR 扩增和杂交 反应条件下， 使用基因芯片检测了 149 株不同血清型的肠道 菌。其中包括大肠杆菌 O157: H7 W933、 882364 标准菌株， 97 - O157: H7 等5 株地方株， 大肠杆菌非 H7 型3 株； 霍乱弧 菌 O139 M045、 1837 标准菌株和 72 株地方分离株， O1 型霍 乱弧菌 569B 和小川型， 非 O1 型非 O139 型霍乱弧菌 3 株；

32、常见肠道菌： 侵袭性大肠杆菌 48017、 STM408、 191、 197、 247、 AT 大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌 6538、 沙门菌属、 耶尔森菌 属、 蜡样芽孢杆菌、 志贺菌属、 李斯特菌属、 假单胞菌属、 变形 菌属等。以细菌 DNA 为模板进行两套三重 PCR 扩增， 荧光 标记 PCR 产物与芯片杂交。 表 3 结果显示， 所检测的 O157: H7 都含有 stx1、 stx2 毒 力基因， 而 O157 非 H7 型和一些肠道菌也含有 stx1 或 stx2， 但用于检测 O157: H7 特异性突变位点的 uidA 探针可将以 上细菌区分开。本实验所检测的 O139 型

33、和 O1 型霍乱弧菌 都含有 ctxA、 tcpA， 而毒力基因 LPSgt 探针只与 O139 型霍乱 弧菌特异结合， 可将二者明确区分， 本实验检测的其他肠道 菌以及 3 株非 O1 型非 O139 型霍乱弧菌与检测探针杂交均 无信号产生。 表 3 特异性检测结果 菌株数量stx1stx2uidActxAtcpALPSgt O157: H78+- O157 非 H72+- O157 非 H73+- 191、 1972+- O13974-+ O12-+- 其他肠道菌55- 2. 4 探针的灵敏度检测 将构建的阳性质粒 10 倍系列稀释， 在优化的三重 PCR 反应条件下， 当 PCR 反应模

34、板均为 1 000 拷贝时， 三重 PCR 反应为阳性， 琼脂糖凝胶电泳检测条带可见， 杂交信号为阳 性 （图4） 。当模板浓度为500 拷贝时， 三重 PCR 扩增产物电 泳检测为阴性， 杂交反应为阳性； 将模板再进行 2 10 倍稀 释， 5 倍稀释后扩增产物杂交仍有弱阳性信号， 继续稀释则 杂交反应为阴性 （图 5） 。结果表明， 要达到芯片检测的最低 样品量， 多重 PCR 扩增的 DNA 模板量应大于100 拷贝， 本研 究制备的芯片检测灵敏度比多重 PCR 产物电泳检测灵敏度 高 10 倍， 此芯片检测的灵敏度为一个 PCR 反应体系中 100 拷贝质粒 DNA 模板。 图 4 三

35、重 PCR 灵敏度检测结果 图 5 芯片灵敏度杂交结果 521 第 2 期 徐晓静， 等 . 基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌 O157: H7 和霍乱弧菌 O139 2. 5 对临床样本的检测结果 共检测了 342 份临床备检样本， 备检样本来源于浙江省 一起流行性霍乱 60 例患者的粪便。取病人发病及治疗不同 时期的肛拭子， 于碱性蛋白胨水中增菌 2 3 h， 然后煮沸裂 解 10 min， 12 000 r/ min 离心 2 min， 取上清作为模板进行多 重 PCR 扩增， 产物与芯片杂交。表 4 显示， 有 137 份在芯片 ctxA， tcpA， LPSgt 探针处都出现阳性信号，

36、 鉴定为 O139 型霍 乱弧菌， 其余 205 份除阳性对照外， 未见杂交信号。用传统 细菌培养方法共检出 89 份样本为 O139 型霍乱弧菌， 用荧光 定量 PCR 方法检测 LPSgt 基因共检出 142 份为阳性。结果 表明本研究建立的检测霍乱弧菌 O139 的基因芯片比细菌培 养的方法敏感性高。细菌培养鉴定结果由浙江省疾病预防 控制中心提供， 荧光定量 PCR 检测结果由本实验室研制的 “新发肠道致病菌荧光定量检测试剂盒” 鉴定。 表 4 临床样本的检测结果 检测方法检测指标检出样本数 阳性检出率 （%） 细菌培养生理、 生化特征8926.0 基因芯片ctxA，tcpA，LPSgt

37、13740.0 荧光定量 PCRLPSgt14241.5 3 讨论 以多重 PCR 为基础的基因芯片检测技术， 可同时检测 病原体的多个相关基因， 因此能够较为准确地甄别病原体。 本研究利用这一技术建立了包含 6 个检测探针的基因芯片， 可同时鉴定肠出血性大肠杆菌 O157: H7 和霍乱弧菌 O139 两种病原体。实验结果表明， 此芯片检测的灵敏度为一个 PCR 反应体系中 100 拷贝质粒 DNA 模板量， 比常规用凝胶 电泳方法检测 PCR 产物的灵敏度高 10 倍。但对于细菌量较 少的检测标本， 特别是 10 个菌即可致病的 O157: H7， 要采用 增菌步骤， 然后再进行扩增， 这

38、样可避免出现假阴性结果。 对临床样本的检测结果表明此芯片检测的灵敏度明显高于 传统的细菌学检测方法， 略低于荧光定量 PCR 检测灵敏度。 但荧光定量 PCR 只针对 LPSgt 一个基因进行了检测， 不能鉴 定 O139 菌株的致病性， 而芯片不仅检测了 O139 的特异性基 因 LPSgt， 同时还对毒力基因 ctxA、 tcpA 进行检测， 因此， 结果 更可靠。而且同时还能对 O157: H7 进行鉴定。 此外， 基因芯片检测结果的可靠性与芯片所包含探针的 特异性密切相关。由于生物种类存在一定的同源性， 就要求 所选探针的特异性越高越好。本研究通过多次实验筛选出 的 6 条探针， 在优

39、化好的杂交条件下， 经不同菌株特异性检 验结果表明， 所制备的基因芯片探针设计合理， 每个探针的 特异性良好， 可以对 O157: H7 的 stx1、 stx2 毒力基因和 uidA 特异性突变位点及 O139 的 ctxA、 tcpA、 LPSgt 基因进行特异 性检测。 PCR 技术是目前公认的快速检测病原菌的方法。但由 于临床采集的样本成分复杂， 可能含有与扩增目的片段相似 的序列， 这样就会产生假阳性扩增产物， 而凝胶电泳检测无 法进行区分 18。荧光定量 PCR 的发现， 虽然根除了凝胶电 泳检测 PCR 产物的不足， 但一次只能检测一个基因或一种 病原体， 而对于多个基因同时检测

40、才能进行鉴定的病原体或 多种病原体同时进行检测时却存在一定的局限。相比之下， 基因芯片技术却是一种比较适合的检测方法， 结合其高通量 的特点， 一次实验即可获得大量数据， 即可实现多种病原体 多个样本的同时检测， 为流行病学调查和突发性传染病的早 期诊断提供了一种有效的检测手段。总之， 本研究建立的基 因芯片可同时用于鉴定致病性大肠杆菌 O157: H7 和霍乱弧 菌 O139， 可在 4 6 h 内得到检测结果。 真正实现在一张芯片上完成对所有肠道致病菌进行检 测和鉴定是一项复杂而艰巨的系统工程， 问题的最终解决有 赖于技术、 信息等方面的积累与整合。本研究的开展为寡核 苷酸芯片技术应用于肠

41、道致病菌检测做了有益的探索， 并为 今后实现制备更高密度寡核苷酸芯片， 扩大对肠道致病菌的 检测奠定了基础。 参考文献 1 Fach P，Perelle S，Grout J，et al. Comparison of different PCR tests for detecting Shigatoxin-producing Escherichia coli O157 and development of an ELISA-PCR assay for specific identification of the bacteria J . Microbiol Methods， 2003， 55 （

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47、hogenic O157 : H7 EDL933 and non-pathogenic Escherichia coli strainsJ . Biosens Bioelectron， 2003， 19 （1） ： 1 -8. （下转第 130 页） 621军事医学科学院院刊 2006 年 4 月 第 30 卷 第 2 期 溶解。 在用 Ni-NTA 亲和层析柱纯化 rBoNT/ B Hc 蛋白过程中 发现， 上柱前在样品缓冲液中预先加入少量咪唑 （其终浓度 范围为 2 20 mmol/ L） 是消除非特异性蛋白结合的重要环 节。通过摸索确定当咪唑终浓度达到 15 mmol/ L 时， 既可有

48、 效抑制非特异性蛋白的结合， 又不影响目的蛋白的结合和随 后的洗脱效果， 还降低了分离难度， 从而提高了目的蛋白的 纯度。在进行蛋白上样时， 选择较低的温度 （4） 可保证目 的蛋白与镍柱结合良好。在洗脱目的蛋白时， 选择较高的离 子强度 （200 mmol/ L 咪唑） 一次快速洗脱， 洗脱体积小、 效率 高， 从而获得高浓度的目的蛋白。 Western 印迹分析、 鉴定 rBoNT/ B Hc 时发现， 在普通转 移缓冲液转移 5 h 后， 用丽春红 S 对蛋白染色几乎见不到蛋 白带。原因可能是 rBoNT/ B Hc 属于强碱性蛋白 （理论 pI 为 10. 265） ， 转移效率很低造

49、成的。为提高转移效率， 在普通转 移缓冲液中加入了终浓度为 1% 的 SDS， 结果转移效率明显 提高， 这说明加入 SDS 有助于改善碱性蛋白的转膜效率 8。 总之， rBoNT/ B Hc 的高效表达与快速纯化及其良好的 抗原性， 为下一步建立快速检测方法和制备相应的抗体及亚 单位疫苗奠定了基础。 参考文献 1 Arnon SS，Schecter R，Inglesby TV. Botulinum toxin as a bio- logical weapon：medical and public health management J . JAMA， 2001， 285 （16） ： 1059 -1070. 2 王景林. 肉毒神经毒素及其相关医学防护问题 J . 军事医 学科学院院刊， 2003， 27 （3） ： 213