尼美舒利对人食管癌细胞ECA109 COX2表达及生长的抑制作用.pdf

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1、尼美舒利对人食管癌细胞 Eca-109 COX-2 表达及生长的抑制作用 刘俊茹1，齐凤英1，李 丽1，左连富2，郭建文2， 刘江惠2 （1. 河北医科大学病理学教研室， 河北 石家庄 050017； 2. 河北医科大学肿瘤研究所， 河北 石家庄 050011） 中国图书分类号： R 329. 25； R 329. 28； R 345. 4； R 394. 2； R 73-351； R 735. 1； R 977. 3； R 979. 1 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2005） 09 -1084 -05 摘要： 目的 研究环氧化酶-2 （COX-2） 选择性抑制剂尼美

2、舒 利对人食管癌 Eca-109 细胞株 COX-2 表达和细胞增殖及凋 亡的影响。方法 MTT 法测定尼美舒利对人食管癌 Eca-109 收稿日期： 2005 -01 -04， 修回日期： 2005 -02 -02 基金项目： 河北省自然科学基金资助项目 （No 301354） 作者简介： 刘俊茹 （1969 - ） ， 女， 博士生， E-mail： liujr1207 sina. com； 齐凤英 （1945 - ） ， 女， 教授， 博士生导师， 通讯作者， 研究 方向： 肿瘤药理， Tel： 0311-6265734， E-mail： qfengying1945 yahoo. com

3、. cn 细胞增殖的抑制率； RT-PCR 法检测 Eca-109 细胞 COX-2 mRNA 表达变化； 流式细胞仪检测 COX-2 蛋白表达、 细胞周 期时相分布及凋亡率的变化； 光镜和琼脂糖电泳法进一步观 察细胞凋亡。结果 尼美舒利对人食管癌 Eca-109 细胞有 较强的抑制作用， 有明显的时间和浓度依赖性； 呈浓度依赖 性下调 Eca-109 细胞 COX-2 mRNA 及蛋白表达； 可使 Eca- 109 细胞 G0/ G1期比例增高， S 期细胞减少， 增殖指数降低， 凋亡细胞增多。结论 尼美舒利可能通过对 COX-2 表达的 下调而诱导凋亡和细胞周期阻滞， 从而抑制人食管癌 E

4、ca- 109 细胞生长。 关键词： 尼美舒利； 环氧化酶-2； 人食管癌 Eca-109 细胞株； 凋 亡 2 Sine SM，Claudio T. Gamma- and delta-subunits regulate the af- finity and the cooperativity of ligand binding to the acetylcholine receptor J . J Biol Chem， 1991， 266 （6） ： 19369 -77. 3 杨保仲， 庄心良， 赵雪莲 et al. 肌肉型乙酰胆碱受体在 HEK293 细胞上的表达 J . 中国药理学通报，

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6、ne versus isoflurane J . Anesthesiology， 1995， 82 （4） ： 404 -11. Effects of sevoflurane on the actions of neuromuscular blockers on the muscle nicotine acetylcholine receptor LI Chuan-xiang1， YAO Shang-long1，NIE Hui2， ZHANG Yu-qin2，L Bin3 （1. Dept of Anesthesiology， Union Hospital， 3. Institute of E

7、nvironment Medical，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022， China； 2. Dept of Physiology，Medical College， Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430080， China） Abstract： Aim To investigate the mechanism of sevoflurane enhancement of muscle relaxati

8、on. Meth- ods Poly （A）+ mRNA isolated from the rat$s muscle were microinjected into Xenopus oocytes to express functional ion channels. Voltage clamp technique was used to record the current of the voltage-dependent ion channels. Concentration-effect curves for the inhibition of acetylcholine-induce

9、d currents were established for sevoflurane， rocuranium and vecuronium. Subsequent- ly， inhibitory effects of NDMRS were studied in the presence of the sevoflurane at a concentration equiva- lent to half the concentration producing a 50% inhibi- tion alone. Results Sevoflurane， rocuranium and ve- cu

10、ronium produced rapid and readily reversible con- centration-dependent inhibition.The 50% inhibitory concentration values were 823 molL -1 （95% CI： 681 997 molL -1） ， 33. 4 nmol （95% CI： 27. 1 41. 7 nmolL -1）and 9. 2 nmolL-1 （95% CI： 7. 9 12. 3 nmolL -1） for sevoflurane， rocuranium and vecuronium， r

11、espectively. Coapplication of sevoflurane significantly enhanced the inhibitory effects of rocurani- um and vecuronium. Conclusion Sevoflurane increa- ses the potency of NDMRs，possibly by enhancing an- tagonist affinity at the receptor site. Key words： sevoflurane； nondepolarizing muscle relax- ants

12、；cell membrane；receptors， cholinergic 4801中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Sep； 21 （9） ： 1084 8 近年来研究发现环氧化酶-2 （Cyclooxygenase 2， COX-2） 与多种人类恶性肿瘤的发生密切相关 1 3。 COX-2 选择性抑制剂能诱导多种肿瘤细胞凋亡、 抑 制其生长， 但这种作用是否通过抑制 COX-2 活性而 实现目前尚有很多争论 4。COX-2 抑制剂是否诱 导食管癌细胞凋亡， 其作用机制如何， 目前研究较 少。本实验研究目的在于观察选择性 COX-2

13、抑制 剂尼美舒利 （nimesulide） 对体外培养的 Eca-109 食 管癌细胞 COX-2 表达及细胞增殖和凋亡的影响， 以 期为食管癌的预防和治疗提供依据。 1 材料与方法 1. 1 主要试剂 尼美舒利 （美国 Caymen 公司出 品， 购自晶美公司） 溶于二甲基亚砜 （DMSO） ， 配成 500 mmolL -1母液， 临用前稀释； MTT、 TRIZOL 为 美国 Sigma 公司产品； RPMI1640 购于美国 Gibco 公 司； 羊抗人 COX-2 抗体、 辣根过氧化物酶标记的兔 抗羊 IgG 及 ECL 发光试剂盒购自美国 Santa Cruz 公 司； 反转录酶

14、AMV 及 Taq DNA 聚合酶购自美国 Promega 公司。 1. 2 主要仪器设备 Epics-XL 型流式细胞仪为 美国 Beckman Coulter 公司产品， 使用 Muticycle AV 分析软件；PCR 扩增仪为美国 Biometra 公司产品； 凝胶成像系统为美国 UVP 公司产品； 恒温 CO2培养 箱为日本 SANYO 公司产品。 1. 3 方法 1. 3. 1 细胞培养 人食管癌细胞株 Eca-109 由第 四军医大学实验动物中心提供， 将 Eca-109 细胞置 于含体积分数 10% 胎牛血清、 1 105IUL -1青霉 素及 100 mgL -1链霉素的 R

15、PMI1640 培养液中， 于 37、 5% CO2培养箱中常规培养， 待其贴壁生长至 70% 80% 融合时， 用质量浓度为 2. 5 gL -1的胰 酶和 0. 2 gL -1的 EDTA 混合消化液传代培养。 1. 3. 2 尼美舒利对 Eca-109 细胞生长的影响 取 对数生长期的人食管癌 Eca-109 细胞， 用消化液消 化后， 将细胞以 5 104L -1的浓度接种 200 l 孔 -1于 96 孔板上， 24 h 后轻轻吸去上清， 加入浓度 为 400、 200、 100、 50 molL -1的尼美舒利 200 l， 同时设不含药物的阴性对照孔和等体积的 DMSO 溶剂对照

16、孔， DMSO 的体积分数为0. 08%， 细胞继续 培养 24、 48、 72 h 后每孔加入 MTT （质量浓度为 5 g L -1， 用 0. 01 molL-1 PBS 配制） 20 l， 继续培养 4 h， 弃去上清后每孔加入200 l 浓度为0. 04 mol L -1的酸化异丙醇， 振荡 10 min 充分溶解结晶后用 酶标仪于 490 nm 下读取每孔的光吸收值 （OD） ， 每 浓度每时间点设 6 孔。并通过下列公式计算细胞生 长抑制率： 生长抑制率 （%）=（1 - 实验组 OD 值/ 对照组 OD 值） 100%。 1. 3. 3 RT-PCR 检测 COX-2 的 mR

17、NA 表达 不同 浓度的尼美舒利处理细胞 48 h 后， 按 TRIZOL 试剂 盒说明一步法提取总 RNA， 紫外分光光度仪测定 RNA 纯度并定量。逆转录反应合成第一链 cDNA， 进行 PCR 反应， COX-2 引物上游序列为： 5-AGAAT- GCATTGGAAACATCGACAG-3下游序列为： 5-CCT- GTTGCGGAGAAAGGAGTC-3。内 参 GAPDH 引 物 的上游序列为： 5-CAACAGCCTCAAGATCATCAGC- 3， 下游序列为： 5-TTCTAGACGGCAGCTCAGGTC- 3。反应条件为： 95 预变性 5 min 后， 95 变性 1

18、min， 55退火 50 s， 72延伸 50 s， 共 35 个循环， 最 后 72延伸 10 min。5 l PCR 产物在 20 gL -1琼 脂糖凝胶中电泳， 溴化乙锭显色， 目的条带用凝胶成 像分析系统作光密度测定， COX-2 与 GAPDH 光密 度的比值作为 COX-2 mRNA 的相对含量。 1. 3. 4 流式细胞仪免疫荧光标记法分析 COX-2 蛋 白表达 用不同浓度的尼美舒利处理细胞 48 h 后， 收集细胞用体积分数为 0. 70 的乙醇固定， 加入羊抗 人 COX-2 抗体， 室温孵育 30 min， PBS 洗涤后加入 FITC-IgG 二抗， 上机检测。蛋白表达

19、量用荧光指数 （fluoresence index， FI） 表示， FI = 实验处理组的荧光 强度/ 实验对照组的荧光强度。 1.3. 5 光镜观察细胞形态 不同浓度的尼美舒利 处理 6 孔板内爬片培养的细胞 72 h 后， 取出内置的 盖玻片， 用体积分数为 0. 95 的乙醇固定后， 行 HE 染色， 观察细胞的形态学改变。 1.3. 6 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率 收集 不同浓度尼美舒利处理 72 h 的细胞， 每组重复 3 瓶， PBS 洗 3 次， 用体积分数为 0. 70 的乙醇固定， PI 染液 （含质量浓度50 mgL -1的 PI， 体积分数1. 0% 的 Trito

20、n X-100 和质量浓度 10 mgL -1 Rnase A） ， 4避光染色 30 min， 用 Epics-XL 型流式细胞仪 检测细胞凋亡率、 增殖指数和细胞周期分布。增殖 指数 = （S 期 + G2M 期） 细胞数/ （G0/ G1期 + S 期 + G2M 期） 细胞数。 1. 3. 7 细胞凋亡的 DNA 片断检测 参照 Smith 等 5方法略有改进。收集溶剂组和 100、 200、 400 molL -1尼美舒利组培养 72 h 细胞， PBS 洗 2 次， 溶于 400 l 裂解液 1% NP40、 500 mmolL -1 Tris. HCl（pH 8. 0）20 mm

21、olL -1 EDTA ， 55水浴 16 h， 离心， 取上清加入终浓度为 20 mgL -1 的 RNA 酶A、 1% SDS37 水浴1h， 加入蛋白酶K至终浓 5801中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Sep； 21 （9） Tab 1 Inhibitory effect of growth of Eca-109 cells cultured with different concentrations of nimesulide（*x s， n =6） Group 24 h OD490IR/ % 48 h OD490IR/ %

22、72 h OD490IR/ % Control0.297 0.014-0. 544 0. 005-1. 045 0.033- DMSO0.293 0.0231.40. 529 0. 0232. 81. 007 0. 0283. 6 Nimesulide/ moll -1 500.295 0.0110.70. 515 0. 020*5. 30. 913 0. 027*12. 6 1000.284 0.009*4.40. 485 0. 007*10. 90. 677 0. 035*35. 2 2000.253 0.015*15.70. 407 0. 032*35. 10. 531 0. 018*4

23、9. 2 4000.199 0.013*32.90. 254 0. 017*53. 30. 330 0. 014*68. 4 *P 0. 01 vs DMSO group； IR：inhibition rate 度 20 mgL -1， 37水浴1 h， 加入1/10 体积3 mol L -1的醋酸钠及 2 倍体积的冰乙醇， -20放置 1 h 以上， 离心， 沉淀溶于 pH 8. 0 的 TE 液中， 18 g L -1琼脂糖凝胶电泳鉴定， 自动凝胶成像系统摄影。 1. 3. 8 实验资料的统计学处理 实验数据均用*x s 表示， 采用 SPSS 12. 0 统计软件行方差分析和直 线回归相

24、关分析。 2 结果 2.1 尼美舒利对 Eca-109 细胞生长抑制作用 50 400 molL -1 尼美舒利作用 Eca-109 细胞 24、 48、 72 h 后， 可抑制细胞的生长， 随着尼美舒利剂量 的增加和作用时间的延长， 其对 Eca-109 细胞的抑 制作用明显增强 （P 0. 01， Tab 1） ， 相关分析表明 呈时间和浓度依赖性 （r = 0. 917 0. 996， P 0. 05 或 P 0. 01） 。 2. 2 尼美舒利对 Eca-109 细胞 COX-2 mRNA、 蛋 白表达的影响 尼美舒利处理 Eca-109 细胞 48 h 后， COX-2 mRNA 及

25、蛋白表达均下降。其抑制作用 随干预浓度的增加而增强， 呈剂量依赖关系 （ Fig 1， Tab 2 ） ， 表明尼美舒利能下调 COX-2 mRNA 及蛋白 表达。 2.3 流式细胞仪分析细胞凋亡和细胞周期分布 尼美舒利作用 Eca-109 细胞 72 h 可明显提高 Eca- 109 细胞的凋亡率并使 G0/ G1期细胞明显增高， 增 殖指数和 S 期细胞比例明显降低 （P 0. 05 或 P 0. 01） ， 但对 G2/ M 期细胞比例没有明显影响 （Tab 3） 。 Tab 2 Effect of nimesulide on mRNA and protein expressin of

26、COX-2 in Eca-109 cells at 48 h（*x s， n =3） GroupCOX-2 mRNACOX-2 protein/ FI Control0. 727 0. 0531 Nimesulide/ molL -1 500. 605 0. 042*0. 870 0. 054* 1000. 576 0. 027*0. 573 0. 037* 2000. 296 0. 031*0. 504 0. 022* 4000. 224 0. 035*0. 427 0. 014* *P 0. 05 vs control Fig 1 Expression of COX-2 mRNA in E

27、ca-109 cells cultured with different concentrations of nimesulide for 48 h 1：Marker； 2： Control； 3 6： 400， 200， 100， 50 molL -1 nimesulide 2. 4 光镜观察细胞形态学变化 正常生长的 Eca- 109 细胞呈单层、 多边形贴壁生长， 细胞轮廓清晰。 尼美舒利作用于细胞后， 随着浓度增加、 时间延长， 细胞生长明显减慢， 处于分裂期的细胞明显减少， 细 Tab 3 Effect of nimesulide on apoptosis rate ， prolif

28、eration index and distribution of cell cycles of human Eca-109 cells （*x s， n =3） GroupApoptosis rate/ %Proliferation rate/ % Distribution of cell cycles/ % G0/ G1SG2M Control2. 39 0.1253.00 1.9847. 00 1. 9836.95 3. 8816. 05 1. 91 DMSO2. 85 0.2952.70 1.2747. 35 1. 3433. 35 2. 7619. 35 1. 48 Nimesuli

29、de/ molL -1 506.68 0.37*48.25 1.21*51. 70 1. 14*31. 55 0. 5416. 70 0. 71 1009. 09 0.51*43.30 1.98*56. 70 1. 98*28. 75 1. 6914. 55 2. 77 20014. 03 0.47*40.55 1.06*59. 40 0. 99*25. 25 1. 37*15. 3 1. 55 40019. 68 1.32*36.30 2.57*63. 70 1. 03*17. 05 0. 47*19. 25 3. 08 *P 0. 05，*P 0. 01 vs control 6801中国

30、药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Sep； 21 （9） 胞间隙变大， 胞膜皱缩、 凹陷， 细胞内出现颗粒沉着。 有的胞膜内出现数量不等的凋亡小体， 部分细胞脱 壁。 2. 5 细胞凋亡的 DNA 片断检测 尼美舒利作用 72 h 后， 将 Eca-109 细胞的 DNA 提取物进行凝胶电 泳， 400、 200 molL -1 组均出现凋亡细胞典型的 DNA 梯状条带 （DNA ladder） ， 而对照组细胞的 DNA 提取物仅显示完整的基因组 DNA， 未出现 DNA 梯 状条带 （Fig 2） 。 Fig 2 DNA fragmen

31、tation in Eca-109 cells induced by different concentrations of nimesulide for 72 h 1： Control； 2 4： 400， 200， 100 molL -1 nimesulide 3 讨论 COX 是催化花生四烯酸生成前列腺素的关键 酶， 有两种基因型： COX-1 和 COX-2， COX-1 被称为 “看家基因” ， 呈结构性表达， 在人体中保持相对稳 定， COX-2 则可被缺氧、 炎症、 细胞因子、 生长因子、 有丝分裂原及肿瘤促进因子等多种因素诱导产生， 是非甾体类抗炎药抗炎 （nonsteroid

32、al anti-inflamma- tory drugs， NSAIDs） 作用的靶基因， COX-2 不仅是抗 炎作用的中心环节， 而且在多种肿瘤组织中表达上 调， 在肿瘤的发生和发展中起着重要作用 1 3， 作者 的前期研究发现， 随着食管上皮异型性的增高， COX-2 表达迅速增多， 在癌组织中表达最高 3。流 行病学及实验室研究资料表明， 长期服用阿司匹林 或其它 NSAIDs 的人群之中， 不仅能显著减少结肠 腺瘤的大小、 数目， 降低家族性腺瘤样息肉病患者结 肠癌的发病率， 而且可降低乳腺癌、 肺癌的发病 率 6， 7， 体外研究也发现阿司匹林可诱导人肺腺癌 细胞凋亡 8。NSAI

33、Ds 的主要作用靶点是 COX， NSAIDs 能否抑制 COX-2 基因的表达报道不一。 本研究选择 NSAIDs 类药物尼美舒利作为干预 药物， 尼美舒利属甲磺酰胺类化合物， 对 COX-2 有 选择性抑制作用， COX-2 选择性抑制剂能显著降低 传统的 NSAIDs 如阿司匹林等所引起的胃肠道不良 反应的发生， 正试图被用作化学治疗和化学预防药 物 9。动物实验发现尼美舒利可抑制胰腺癌、 结肠 癌、 肺癌细胞的生长并诱导肿瘤细胞凋亡 10 12。选 择性 COX-2 抑制剂戊地昔布可使人胃癌 BGC823 细 胞 G0/ G1期比例增高， S 期、 G2M 期比例下降， 诱导 G0/

34、G1期阻滞并诱导细胞凋亡而抑制胃癌细胞生 长 13。本研究结果显示尼美舒利能有效抑制人食 管癌 Eca-109 细胞 COX-2 mRNA 和蛋白的表达， 并 使细胞周期发生变化， G0/ G1期比例增高， S 期、 G2M 期比例下降， 呈 G0/ G1期阻滞， 提示尼美舒利将细 胞阻滞于 DNA 合成前期， 阻止 DNA 合成； 研究还发 现尼美舒利能显著抑制细胞增殖并诱导凋亡， 而且 这种作用有时间、 浓度依赖性， 因此推测尼美舒利可 能通过 COX-2 依赖途径即抑制 COX-2 基因和蛋白 的表达， 从而影响细胞周期时相分布， 抑制细胞增 殖， 进一步诱导细胞凋亡。 目前关于 COX

35、-2 抑制剂的抗肿瘤机制有研究 发现 还 可 通 过 非 COX-2 依 赖 途 径。Waskewich 等 14发现 COX-2 抑制剂 Celecoxib 可抑制不表达 COX-2 的肝癌细胞株的生长。COX-2 抑制剂 NS- 398 可通过促进细胞释放细胞色素 C 和凋亡诱导因 子 （AIF） 激活 caspase， 诱导非小细胞肺癌 COX-2 高 表达细胞株 （MOR-P） 和不表达细胞株 （H-460） 细胞 凋亡 14， 提示 COX-2 抑制剂的抗肿瘤机制可能是 复杂多样的， 不同种类的 COX-2 抑制剂、 作用于不 同类型的肿瘤细胞， 其机制可能会有所不同。 综上所述，

36、尼美舒利对高表达 COX-2 的人食管 癌细胞株 Eca-109 可能通过降低 COX-2 表达而抑制 细胞增殖和诱导凋亡。提示尼美舒利作为一种化学 治疗和化学预防药物可能对高表达 COX-2 的食管 癌有效。 参考文献： 1 Leng J，Han C， Demetris AJ et al. Cyclooxygenase-2 promotes hepatocellular carcinoma cell growth through akt activation： evi- dence for akt inhibition in celecoxib-induced apoptosis J . H

37、epa- tology， 2003， 38 （3） ： 756 -64. 2 Williams CS， Mann M，DuBois RN. The role of cyclooxygenase in inflammation， cancer and development J . Oncogene， 1999， 18 （55） ： 7908 -16. 3 张林西， 齐凤英， 左连富 et al. 食管鳞癌及癌前病变中环氧化 酶 -2 及 p53 表达上调 J . 中国肿瘤临床， 2003， 30 （3） ： 159 -162. 7801中国药理学通报 Chinese Pharmacologic

38、al Bulletin 2005 Sep； 21 （9） 4 Yoshimi K， Shingo T， Masahiko T et al. Cyclooxygenase-2 activity altered the cell-surface carbohydrate antigens on colon cancer cells and enhanced liver metastasis J . Cancer Res， 2002， 62 （5） ： 1567 -72. 5 Smith CA，Williams GT， Kongston R et al. Antibodys to CD3/ T ce

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45、40 （1） ： 33 -44. Inhibitive effects of nimesulide on cyclooxygenase-2 expression and proliferation in human esophageal carcinoma Eca-109 cells LIU Jun-ru1，QI Feng-ying1，LI Li1，ZUO Lian-fu2， GUO Jian-wen2， LIU Jiang-hui2 （1. Dept of Pathology， Hebei Medical University， Shijiazhuang 050017， China； 2.

46、Dept of Cancer Institute，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011， China） Abstract： Aim To study the effects of selective cy- clooxygenase-2 （ COX-2 ） inhibitor，nimesulide，on COX-2 expression，cell proliferation and apoptosis of humanesophagealcarcinomaEca-109celllines. Methods MTT assay was used

47、 to observe the prolifer- ative effect； COX-2 mRNA expression was evaluated with RT-PCR；COX-2 protein expression， cell cycle and apoptosis were analyzed with flow cytometry； micro- scope and agarose gel electrophoresis of DNA were also used to observe the apoptosis. Results Nimesulide significantly

48、inhibited the proliferation of Eca-109 cell lines in a time and dose-depenent fashion，down-regu- lated the expression of COX-2 mRNA and COX-2 pro- tein in a dose-dependent fashion； nimesulide also de- creased the proliferation index and the proportion of cells in S phase，meanwhile increased the prop

49、ortion of cells in G0/ G1phase and induced apoptosis. Conclu- sion COX-2 selective inhibitor nimesulide inhibits proliferation， induces apoptosis and cell cycle arrest of human esophageal cells via down-regulation of COX-2 expression. Key words： nimesulide；Cyclooxygenase-2； human e- sophageal carcinoma E