小鼠胎儿胸腺T细胞体外培养的分化和成熟.pdf

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1、第 2 7 卷 2 00 1 第 6 期 年 白求恩医科大学学报 1 . N. B E T HUN E UNI V. ME D . S C I . Vo l . 2 7 No . 6 2 0 0 1 仁 文章编号 0 2 5 3 - 3 7 0 7 ( 2 0 0 1 ) 0 6 - 0 5 7 5 - 0 3 小鼠胎儿胸腺T细胞体外培养的分化和成熟 林承赫， ， 龚宁良 “ ， 赵勇 2 a.吉林大学第一医院核医学科， 吉林 长春1 3 0 0 2 1 ; 2 .吉林大学卫生部放射生物学重点实验室) 摘 要 目的: 观寨B A L B / c 小鼠胎儿胸睬T细胞体外培养的分化和成熟。 方法:

2、 未用小鼠胎儿胸腺器 官休外培养体系 及流式细胞米浏其T细胞C D 4 , C D 8 和T C R的表达。 结果: 受孕1 5 d 胎鼠 肋睬T细胞 主要为C D 4 - C D 8 一 细胞( 9 6 . 0 0 a ) ; 休外培养3 d 后， 大部分分化为C D 4 十 C D 8 + iv胞( 6 5 . 4 %) ， 小部分成 熟为C D 4 十 C D 8 - ( 1 4 . 3 0/ n ) 和C D 4 - C D 8 + ( 1 1 . 2 0 o ) 细胞; 培养5 d 后, C D 4 - C D 8 十 细胞( 5 9 . 7 0 0 ) 减少， 而 C D 4 +

3、C D 8 - ( 1 4 . 3 环) 和C D 4 - C D 8 + ( 1 5 . 8 % ) 增多; 培养后 1 0 d , C D 4 C D 8 细胞降低-f 1 4 7 . 2 %, C D 4 C D 8 一 和C D 4 - C D 8 细胞分ff d 增加到2 0 . 0 %和2 4 . 9 %, 同时T C R明显表达。 结论: 应用小鼠胎儿 胸腺器官培养休系进一步通过胸腺细胞的阳性和阴性选择证实其T细胞的分化和成熟过程。 关 键 词 小鼠; 胸睐; T细胞; 分化; 成熟 中图分类号 R - 3 3 ; C Q3 4 3 . 6 ) 文献标识码 A 胸腺是T细胞分化、

4、 成熟的中 枢免疫器官， 也是 驯化和选择T细胞的 场所。 在T细胞分化、 成熟过程 中， 发生选择作用， 即阳性选择和阴性选择， 并受细胞 凋亡的调节 1 2 1 涉及T C R和M H C分子的 相互作用。 阳性和阴性选择的 差异是由 于肤 - M H C复合物结合到 T C R的 亲合性或T C R结构改变的 不同 所致 3 51 。 成 熟的T细胞， 具有C D 4 分子的受MH C I 类分子制约， 具有C D 8 分子的受MH C工 分子制约。本研究 应用小 鼠 胎儿胸腺器官培养( MF T O C ) 体系观察其胸腺T细 胞体外培养的阳性和阴性选择， 进一步通过体外实验 证实T细

5、胞的 分化和成熟过程。 1 材料与方法 1 . 1 动 物成年B A L B / c 雌性小鼠， 购自 本 校实验动物部。 1 . 2 小鼠胎儿胸腺器官 培养 成年雌性小鼠 受 孕1 5 d ， 剖腹取胎摘取胸腺， 置硝酸纤维滤膜上培养 3 , 5 和t o d , 滤膜悬浮于D M E M培养基， 另 加1 0 %胎 牛血清, 3 m m o l / L L 一 谷氨酞胺、 1 i n m o l / L 丙酮酸钠、 1 X M E M 非必需氨基酸、 5 0 p m o l / L 2 - 琉基乙醇、 2 0 m m o l / L H E P E S ( p H 7 . 2 ) , 1

6、0 0 U / m l 青霉素和 1 0 0 r i g / m l 链霉素( 完全D M E M) 。 每2 d 换半量培养 液 。 1 . 3 C D 4 , C D 8 和T C R表达浏定调胸腺细胞 浓度为5 X1 0 6 “ m l - e 测C D 4 和C D 8 ， 每份样品取 2 0 0 K 1 ， 加 ;D 4 - P E 和C D 8 - F I T C 单克隆抗体( B - D公 司， 美国 ) 各2 0 风进行双荧光染色。 测T C R ， 每份 样品 取1 0 0 川， 加T C R a 准F I T C 单克隆抗体( B - D公司， 美 国) 1 0 风进行单荧

7、光染色。然后， 分别在 4 反应 4 5 m i n ， 再用。 . 0 1 m o l / L P B S 洗2 次。 用流式细胞仪 ( B - D公司， 美国 ) 检测， 用F A C S c a n 软件收 集细胞， 每 份样品收集1 0 0 0 0 个细胞， 用L y s y s 软件分析处理数 据， 记录阳性细胞百分数， 减去非特异性对照值。 2 结果 应用小鼠 胎儿胸腺器官培养体系观察其在体外培 养0 , 3 , 5 和1 0 d 胸腺T细胞分化和成熟过程。 从图1 中可以看出， 第一( 左上) 、 二( 右上) 、 三( 左下) 和四( 右 下) 象限分别为C D 4 + C D

8、 8 - , C D 4 + C D 8 十 、 C D 4 - C D 8 - 和C D 4 - C D 8 + 表达的T细胞亚群。在图I A中， 受孕 1 5 d 胎鼠胸腺T细胞绝大部分为C D 4 - C D 8 一 亚组细 胞 ( 9 6 . 0 肠) ， 少部分呈现 C D 4 + C D 8 - ( 1 - 3 环 ) 和 C D 4 - C D 8 十 ( 2 . 5 0 a ) 亚组细胞。 受孕1 5 d 胎鼠 胸腺培 养3 d后， 大部分 T细胞为C D 4 + C D 8 + 亚组细胞 ( 6 5 . 4 % ) ， 依次为C D 4 - C D 8 ( 1 8 . 3 %

9、) , C D 4 - C D 8 + ( 9 - 8 环) 和C D 4 十 C D 8 - ( 6 . 6 写) 亚组细胞( 图1B).胸腺 培养5 d 后， 大部分T细胞仍为C D 4 + C D 8 + 亚组细胞 ( 5 9 . 7 0 0 ) ， 依次为C D 4 - C D 8 - ( 1 5 . 8 %) . C D 4 C D 8 - 二 收 稿日 期 2 0 0 1 - 0 4 - 0 9 二 作者简介 林承赫( 1 9 6 7 -) ， 男， 吉林省龙井市人， 主治医师， 在读医 学博士， 主要从事核医学研究。 万方数据 白 求恩医科大学学报 2 0 0 1 年 第2 7

10、卷 第6 期 A。 闪。u.。”onl伪 ， 1 o1 J . 它. 。 ， F l u o r e s c e n c e 1 Fl u o r e s c e n c e 1 。 . 。 D . - = .I. _ e 礴牛一宫六 闪山吕。u.巴。二国 . C . . 小口， 二 盆毛. 口: .且 。u。吮on- 二1 用. 几 砂叹. F l u o r e s c e n c e 1 . . ;， . ; s c e n c e 1 F i g . 1 C D 4 a n d C D 8 e x p r e s s i o n s o f T c e l l s 0 ( A ) ,

11、3 ( B ) , 5 ( C ) a n d 1 0 ( D ) d a y s a f t e r m o u s e f e t a l t h y m u s o r g a n ( 1 5 d a y o f g e s t a t i o n ) c u l t u r e i n v i t r o 熟的C D 4 - C D 8 一 或C D 4 - C D 8 + 亚组细胞 比例进一步减少， 成熟的C D 4 十 C D 8 一 和 C D 4 - C D 8 十 亚组细胞增多; 培养1 0 d 后， C D 4 - C D 8 一 和C D 4 - C D 8 + 亚组细胞

12、分别 减少不足T细胞比 例的1 0 写和5 0 写， 成 熟的C D 4 十 C D 8 一 和C D 4 - C D 8 一 亚组细胞 达到T细胞的2 0 0 o 或以 上。上述结果提 示， 受孕1 5 d 胎鼠 胸腺T细胞基本处于 原始、 未成熟阶段， 随着胎鼠胸腺体外培 养时间的 推移. T细胞通过阳性和阴性选 择， 不断地分化为C D 4 + C D 8 + 亚组细胞， 并 进 一 步 成 熟 为 C D 4 + C D 8 一和 C D 4 - C D 8 十 亚组细胞， 待胸腺培养 1 0 d 后已 有相当数量的T细胞成熟为单阳性 亚组细胞。 胸腺T C R的出现， 标志着T细胞分

13、 化的 成熟。 本实验结果证实， 受孕1 5 d 胎 鼠的胸腺经i o d 体外培养， T C R a , p 明显 表达( 图2 ) ， 与上述成熟的T细胞单阳性 亚组细胞C D 4 + C D 8 一 和C D 4 - C D 8 十 表达 的 结果一致。分子遗传学研究证明， 在胚 胎期前T细胞进入胸腺时， 其受体墓因 还未发生重排。在胎生小鼠巧 d ， 重 排的 T C R Y 转录达高峰, T C R R 墓因开始重 ( 1 4 . 3 % ) 和C D 4 - C D 8 + (11 . 2 0 o ) 亚组细胞( 图1 C ) , 胸 腺培养 1 0 d后， T细胞 C D 4 +

14、 C D 8 亚组细胞仅为 4 7 . 2 %， 依次为 C D 4 - C D 8 ( 2 4 . 9 %) , C D 4 + C D 8 - ( 2 0 . 0 %) 和C D 4 - C M- ( 7 . 9 % ) 亚组细胞( 图1 D ) 。 受 孕 1 5 d 胎鼠胸腺培养1 0 d 后， 其T C R a , p 明显表达 ( 图2 ) , 3 讨论 本研究 根据Z h a o 等人提供的 培养体系 1 6 1 ， 取受孕 后巧d 胎鼠 胸腺器官 进行培养， 观察其培养后不同时 间T细胞C D 4 , C D 8 和T C R的 表达， 其结果满意。此 法可作为体外研究胸腺T细

15、胞分化和成熟的重要手 段， 值得采用。 小鼠 在妊娠1 1 - 1 3 d , 胚肝是造血干细 胞增殖分化的场所， 前T细胞可由 此迁入胸腺， 因此 选用受孕1 5 d 雌性小鼠， 取其胎鼠 胸腺进行体外培 养， 观察T细胞分化和成熟过程。 从图1 可以 看出， 受 孕1 5 d 胎鼠胸腺T细胞墓本为C D 4 - C D 8 + 亚组细 胞; 经过体外培养 3 d后， 大部分T细胞分化为 C D 4 + C D 8 亚组细胞， 并且部分 T细胞成熟为 C D 4 - C D 8 + 和C D 4 十 C D 8 一 亚组细胞; 培养5 d后， 未成 1 2B 1 2 ,0 0 _ . 卯，

16、. 1 6 9 0 ,. 1 8 90. 。 1 1 0 0 0 0 6 V .-10, 10, 10, 10, 勺创一勺巴.二。 F i g . 2 T C R e x p r e s s i o n 1 0 d a y s a f t e r m o u s e f e t a l t h y m u s o r g a n ( 1 5 d a y s o f g e s t a t i o n ) c u l t u r e i n v i t r o 排， T C R a 墓因重排晚 于T C Rp 墓因 2 d , T O R Y , p 主 要在胚胎胸腺未成熟的T细胞膜上表达， 而

17、T C R a , 日 主 要在成熟T细胞膜上表达。 几无功能荃因活化的 细 万方数据 林承赫等 小鼠 胎儿胸腺T细胞体外培养的分化和成熟 胞均在胸腺内 死亡， 这可能是胸腺凋亡的一种方式。 C 今考文献 二 1 , J a n e w a y C A . T h y m ic s e l e c t io n : tw o p a t h w a y s t o l if e a n d t w o t o d e a t h J . I m m u n i t y , 1 9 9 4 . 1 : 3 - 4 2 W e is s m a n I L . D e v e l o p m e

18、n t a l s w it c h e s in t h e i m m u n e s y s t e m J . C e l l . 1 9 9 4 , 7 6 : 2 0 7 - 2 1 8 . 3 1 H o g q u i s t K A , J a m e s o n S C , H e a t h W R , e t a l . T ce l l r e c e p t o r a n - t a g o m s t p e p t id e s in d u c e p o s it i v e s e l e c t i o n J . C e l l , 1 9 9 4

19、. 7 6 1 7 - 2 7 . L 4 A s h t o n - R i c k a r d t P G, i l a n d e i r a A . D e l a n e y J R , e t a l . E v id e n c e f o r a d i f f e r e n t i a l a v i d i t y m o d e l o f T c e l l s e l e c t i o n i n t h e t h y m u s J C e l l , 1 9 9 4 , 7 6 : 6 5 1 - 6 6 3 . 5 S e b z d a E , W a

20、l l a c e V A , M a y e r J , e t a t . P o s i t i v e a n d n e g a t i v e t h y - t n o c y t e s e l e c t io n i n d u c e d b y d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f a s in g l e p e p t i d e口 . S c i e n c e , 1 9 9 4 , 2 6 3 : 1 6 1 5 - 1 6 1 8 . 6 Z h a o Y , L w a t a M . C r

21、 o s s - li n k in g o f t h e T C R - C D 3 r o m p l e x w ith C D 4 , C D 8 o r L F A - 1 in d u c e s a n a n t i - a p o p t o t i c s ig n a l in t h y t n o - c y t e s ; t h e s i g n a l i s c a n c e l e d b y F K 5 0 6 J . I n t I m m u ml , 1 9 9 5 , 7 : 1 3 8 7 - 1 3 9 6 . D i f f e r e

22、 n t i a t i o n a n d ma t u r a t i o n o f T c e l l s i n mo u s e f e t a l t h y mu s i n v i t r o L I N C h e n g - h e , G O N G S h o u - l i a n g , Z H A O Y o n g ( 1 D e p t . o f N u c l e a r Me d i c i n e , F i r s t H o s p i t a l , J i l i n U n i v e r s i t y , C h a n g c h u

23、 n 1 3 0 0 2 1 C h i n a ; 2 MH R a d i a b i o l o g y R e s e a e h U n i t , J i l i n U n i v e r s i t y ) A b s t r a c t O b j e c t i v e : T o o b s e r v e t h e d i f f e r e n t i a t i o n a n d m a t u r a t i o n o f T c e l l s i n B A B L / c m o u s e f e t a l t h y m u s i n v i

24、t r o . Me t h o d s ; T h e e x p r e s s i o n s o f T c e l l C D 4 , C D 8 a n d T C R w e r e d a t e r m i n e d w i t h m o u s e f e t a l t h y m u s o r - g a n c u l t u r e s y s t e m a n d fl o w c y t o m e t r y . R e s u l t s : T h e T c e l l s o f f e t a l t h y m u s ( d a y 1

25、5 o f g e s t a t i o n ) w e r e m a i n l y t h e C D 4 - C D 8 - c e l l s ( 9 6 . 0 %) . T h e g r e a t e r p a r t o f t h e C D 4 - C D 8 - c e l l s w a s d i f f e r e n t i a t e d i n t o t h e C D 4 十 C D 8 十 c e l l s ( 6 5 . 4 写) 3 d a y s a f t e r t h y m u s o r g a n c u l t u r e

26、i n v i t r o , a n d t h e s m a l l e r p a r t o f t h e m w a s m a t u r e d i n t o t h e C D 4 十 C D 8 - ( 1 4 . 3 % ) a n d C D 4 - C D 8 十 ( 1 1 . 2 %) c e l l s . T h e C D 4 T C D 8 十 c e l l s ( 5 9 . 7 0 o ) d e c r e a s e d 5 d a y s a f t e r c u l - t u r e , w h i l e t h e C D 4 C

27、 D S - ( 1 4 . 3 0 0 ) a n d C D 4 - C D 8 十( 1 5 . 8 %) c e l l s i n c r e a s e d . T h e C D 4 + C D 8 + c e l l s d e c r e a s e d b y 4 7 . 2 % 1 0 d a y s a f t e r c u l t u r e , w h i l e t h e C D 4 十 C D 8 - a n d C D 4 - C D 8 + c e l l s i n c r e a s e d b y 2 0 . O s/ o a n d 2 4 .

28、9 %, r e s p e c t i v e l y , me a n t i m e t h e T C R e x p r e s s e d o b v i o u s l y . C o n c l u s i o n : T h e c o u r s e o f T c e l l d i f f e r e n t i a t i o n a n d m a t - o r a t i o n w a s f u r t h e r d e m o n s t r a t e d b y t h y m o c y t e p o s i t i v e a n d n e

29、g a t i v e s e l e c t i o n s w i t h m o u s e f e t a l t h y m u s o r g a n c u l t u r e s y s t e m. K e y w o r d s m o u s e ; t h y m u s ; T c e l l s ; d i f f e r e n t i a t i o n ; m a t u r a t i o n 电视腹腔镜胆囊切除术3 0 例临床分析 武警吉 林省总 队医 院 普外科 刘 置 某 魏冰 李密 馥 1 9 9 。 年8 月一2 0 0 0 年1 0 月采用电 视

30、腹腔镜行胆囊切除术( L O 3 0 例， 取得了良 好效果， 现报道如下。 1 临床资料 一般资料: 本组3 0 例L C患者中， 男1 2 例， 女1 8 例， 年龄1 9 - 6 2 岁， 平均4 7 岁。 病程2 个月一1 6 年。 ”例有 不同程度的上腹部胀痛、 隐 痛及消 化不良 病史。 其中胆囊息肉8 例， 胆囊结石2 2 例， 术前均诊断明 确。 操作方法: 平卧位全麻下行 人工 气腹后取脐下操作A孔， 置入镜头， 剑突下经肝圆韧带为B 孔， 于右肋缘下依次取C , D孔， B 孔置操作钳, C , D孔置抓钳。 手术 关键在于操作钳分离胆囊三角处取头高 3 0 , 、 左倾1

31、 5 . 体位充分暴露胆囊， 先处理胆囊三角处解剖关系， 然后顺行切除胆囊后反复冲 洗胆囊床及离断胆囊管 处， 观察有无 渗血 及胆汁样 物， 必要时放置引流管， 术毕放出 气体。 手术结果: 3 0 例均成功， 无一例中 转， 恢 复良 好。 术后1 2 2 4 h 可下床活动， 次日 进食。 术后补液及应用杭生素3 d ， 平均住院6 d ， 一般术后4 d 出院。 2 讨论 L C最大的优点是创伤小， 痛苦少， 恢复快， 已 成为治疗胆囊疾病的一种安全有效的新方法， 但操作技术较直视手 术有一定困难。 开展此项技术体会如下: (互 ) 病例选择 单纯胆囊息肉， 胆囊结石， 慢性胆囊炎症，

32、 无黄疽病史. 1 术前检查: 超声波对 于胆囊病变具有诊断意义， 可以发现胆囊内的结石或息肉， 了 解结石或息肉的数目、 大小、 位置、 胆囊壁厚度。静脉胆道造影可作为 术前常规检查， 了解胆囊的功能以及胆囊内结石情况。 其它常规检查如心电图及肝、 肾、 肺功能检查等。 术中如有不能制止的出 血 或怀疑有胆总管损伤、 三角区不能清晰解剖时， 应及时中 转以免造成不必要损伤。 L C手术的并发症为出血、 胆漏、 胆管损伤， 故手术中 应注意以 下几点: 腹肌充分松弛， 保证有良 好术野， 气腹建立可靠。 穿 刺锥在徐缓施转下压的同时又有反向牵引的力 量， 有效地防止用力过猛发生意外。 胆囊床止血要彻底， 不可忽视明显的小血管出 血r 要钳夹止血， 钳夹胆囊管、 胆囊动脉要准确、 牢靠。 剥离胆囊时找准胆囊粘 膜下层这一间隙 进行， 避免过力牵拉损伤胆囊床、 肝 组织， 造成广泛渗血。 ( 国 术毕应先解除气腹后逐一退出器械以免形成网膜戳孔描, 5 7 7 万方数据