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1、第3 0 卷第2 1 期 2 0 0 5 年 1 1 月 中 国 中 药 杂 ，志 C h i n a J o u rna l o f C h i n e s e Ma t e r i a Me d i c a V o l . 3 0 , I s s u e 2 1 N o v e m b e r , 2 0 0 5 山茱英提取物对脑梗死大鼠大脑皮层 一氧化氮与核转录因子一 B表达的影响 李春阳 ) ， 李 林“， 李宇航2 ， 艾厚喜 ， 张 丽 ( 1首都医 科大学 宣武医院， 北京1 0 0 0 5 3 ; 2 . 首都医 科大学 药理教研室， 北京 1 0 0 0 5 4 ) 摘要 目
2、的: 观察光化学法诱导脑梗死大鼠大脑皮层一氧化氮( N O ) 与核转录因子一 ic B ( N F - K B ) 含量的变化， 以及中药山茱英提取物( 主要成分为环烯醚菇昔) 对其的影响。方法: 大鼠预先灌胃给药7 d 后， 制作光化学致脑梗 死模型， 采用分光光度法检测脑组织中N O和一氧化氮合酶( N O S ) 的变化， 免疫组织化学方法检测 N F - ic B阳性细胞 数量的变化。结果: 模型组与对照组相比， 出现了明显的梗死灶， 脑皮层N O 含量与N O S 活性增加， N F - ic B阳性细胞 数量增多。与模型组相比， 山茱英提取物能明显减小脑梗死面积， 降低脑皮层 N
3、 O含量和 N O S 活性， 并显著减少 N F - ic B阳 性细胞数量。 结论: 山茱英环烯醚菇昔可通过影响脑内N O , N F - icB的水平发挥对脑梗死的治疗作用。 关键词 山茱英; 环烯醚菇昔; 光化学法; 脑梗死; 一氧化氮; N F - ic B 中图分类号 R 2 8 5 . 5 文献标识码I A 文章编号 1 0 0 1 - 5 3 0 2 ( 2 0 0 5 ) 2 1 - 1 6 6 7 - 0 4 山茱英具有补肝益肾、 收敛固涩的功效。有文 献报道山茱英可影响免疫系统并对炎症反应有抑制 作 用， 是 一 种免疫抑制剂 。 本室的 研究工作证实 山茱英提取物( 主
4、要含环烯醚菇昔) 能有效地提高大 鼠的脑血流量， 在蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸( O A ) 致 神经细胞损伤模型中对细胞起到有效的保护作用。 脑梗死在我国发病率较高且有上升趋势。应用光化 学法可制备脑梗死动物模型， 其原理为玫瑰红在光 照射下能产生并释放属于自由基的单链氧， 使血管 内皮细胞不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应， 造成 严重的血管内皮损伤， 直接损害血管内皮的完整性， 使血小板勃附于血管内皮表面并发生释放反应， 激 发凝血过程， 导致血管内血栓形成， 使得短时间内光 照区即 可形成局限 性梗死灶 2 1 。 本研究利用光化学 反应致脑梗死模型探讨山茱英提取物对一氧化氮 ( N O )
5、与核转录因子( N F - ic B ) 含量的影响。 1 材料与方法 1 . 1 药品与试剂山茱英提取物由宣武医院药物 收稿日 期 2 0 0 5 - 0 3 - 1 7 基金项目 国家重点基础研究发展计划( 9 7 3 计划) 项目 ( 2 0 0 3 C B 5 1 7 1 0 4 ) ; 北京市科技计划项目( D 0 2 0 4 0 0 3 0 0 0 0 3 1 ) ; 北京市自 然科学基金重大项目( 7 0 5 0 0 0 1 ) ; 北京市中医药重点学科项目( 2 0 0 5 ) 通讯作者I 李林， T e l : ( 0 1 0 ) 6 3 1 3 2 7 7 9 , F a
6、x : ( 0 1 0 ) 6 3 0 4 2 8 0 9 , E - m a i l : l i n l i 9 7 h o t m a i l . c o m 研究室自 行从山茱英中提取， 山茱英生药加水煮沸 后将药液滤出， 减压浓缩， 与9 5 %乙醇充分混匀后 静置 1 周后过滤， 将滤液再次减压浓缩并去除乙醇 后过 H P - 2 0 大孔树脂色谱柱， 并用乙醇洗脱， 最后将 洗脱液进行减压浓缩和真空干燥， 得到环烯醚菇昔 含量 5 4 %的成品， 提取率为 1 . 9 5 %, F o l i n 酚购自 北京鼎国生物技术有限责任公司。玫瑰红( 分子质 量1 0 1 7 . 6 5
7、 , 温州市东升化工试剂厂) ， 一氧化氮 ( N O ) 测试盒、 一氧化氮合酶( N O S ) 测试盒购自 南京 建成生物技术有限公司。兔抗大鼠多克隆N F - K B 抗 体购自 北京中山生物技术有限公司。 1 . 2 仪器S N 一 2 N型大鼠脑立体定位仪( 日 本) ， L T - B冷光源透照仪 ( 河北泊头医疗器械厂) ， W F Z 8 0 0 一 D 3 B 型紫外可见分光光度仪( 北京瑞利分 析仪器公司) ， 6 2 0 一 E型冷冻切片机( 英国山盾公 司) , B H- 2 型光学显微镜( O l y m p u s 日 本) ， M i c ro f u g e
8、低温离心机( B E C K M A N美国) , P T 1 6 0 0 E高速电动匀 浆器( P O L Y T R O N - A g g r e g a t 瑞士) 。 1 . 3 动物与分组 雄性S D 大鼠， 体重2 4 0 - 2 8 0 9 1 S P F ， 级， 购自 北京维通利华实验动物技术有限公司。 根据 S P S S 统计软件产生随机数字后随机分为以下 5 组: 正常对照组、 脑梗死模型组、 山茱英提取物大 剂量、 中剂量和小剂量治疗组( 分别为干粉 1 8 0 , 6 0 , 2 0 m g - k g - 1 “ d - 1 ) 。 每天 灌胃 给药1 次， 对
9、照组和 模 1 6 6 7 第 3 0 卷第 2 1 期 2 0 0 5 年 1 1 月 中 国 中 药 杂 ，志 C h i n a J o u r n a l o f C h i n e s e Ma t e r i a Me d i c a V o l . 3 0 , I s s u e 2 1 N o v e m b e r , 2 0 0 5 型组给予相同容积的生理盐水。连续给药 7d 后造 模。 1 . 4 光化学诱导脑梗死模型的制备参照 W a t s o n 的 方法 2 1 ， 以1 0 % 的 水合氯醛溶液4 0 0 m g - k g 一 经腹 腔缓慢注射麻醉大鼠， 颅顶
10、部作 1 一 1 . 5 c m正中切 口， 用1 0 %的双氧水清洗创口至颅骨清晰暴露。在 右侧股内 侧作一 1 c m小切口， 暴露股静脉， 将5 %玫 瑰红溶液以2 m L “ k g - 的剂量自 股静脉缓慢注射人 血( 注射时间不短于 1 . 5 m i n ) 后将动物固定于大鼠 脑立体定位仪上， 对照组则只注射玫瑰红溶液而不 给予光照。用一圆片( 含一直径约2 m m的圆孔) 覆 盖于暴露的颅骨上， 将孔对准照射部位， 矢状缝右侧 旁开2 . 0 m m ， 前自后2 . 0 m m ， 将单色冷光源的光导 纤维端口对准圆孔， 紧贴但注意避免压迫颅骨。在 注射玫瑰红5 m i n
11、 后打开单色冷光源， 准确照射 2 0 m i n 。照射完毕后， 消毒并小心缝合头皮切口， 从脑 立体定位仪上取下大鼠， 并使其采取侧卧位送回鼠 笼。 1 . 5 动物的处死和取材 2 4 h 后将大鼠按4 0 0 m g . k g - 剂量 腹腔注射1 0 % 水合氯醛麻醉大鼠 。动物 麻醉成功后， 断头处死， 快速取出全脑， 冰浴分离出 大脑皮层， 置液氮中速冻后保存于一 7 0冰箱以备 检测。其余大鼠使其仰卧于平台上， 伸展固定四肢， 开胸腹充分暴露心脏和肝脏。剪开左侧心尖部， 插 导管于左心室并固定， 同时剪开右心耳。快速灌注 温生理盐水约2 0 0 m L 至肝脏完全变白， 右心
12、耳流出 澄清液体后， 换用4 %多聚甲醛固定液灌注约 1 5 0 M L 至大鼠 僵硬， 至大鼠肝脏变硬肢体僵直， 即固定 完成。然后断头， 完整取出鼠脑后投人含 3 0 %蔗糖 的多聚甲醛溶液中固定。至脑下沉后， 即可行冰冻 切片。 1 . 6 大鼠脑皮层 N O含量和 N O S 活性测定将大 鼠患侧的皮层组织在电子天平上称重后， 用高速电 动匀浆器在低温下制成 1 0 %的组织匀浆液。然后 置于低温高速离心机内， 1 2 0 0 0 r “ m i n - 离心3 0 而n o 取上清液分装成2 管， 一管用于N O和N O S 的测定， 另一管用于W e s t e rn b l o
13、t t i n g 的测定。采用F o l in 酚法 进行蛋白定量后， 用分光光度法严格按照 N O和 N O S 测试盒说明书进行检测。脑皮层 N O含量以 p m o l “ g - 蛋白 表 示， N O S 活性以U . m g - 蛋白 表示。 1 . 7 大鼠脑皮层 N F - rc B含量测定每组选择 3 只 动物， 每只动物选3 张冰冻切片( 厚4 0 V a n ) , P B S T 1 6 6 8 洗， 5 m i n x 3 次; 用3 %玩O Z 室温孵育 1 0 m i n ， 去除 内源性过氧化物酶活性; P B S T 洗， 5 m i n x 3 次; 用
14、8 %一 1 0 %封闭羊血清孵育3 0 m i n ， 以减少非特异性 吸附; 吸出封闭血清， 加人按 1 : 3 0 0 稀释好的兔抗大 鼠多克隆N F - K B 一抗， 4孵育过夜; 吸出一抗， P B - S T 洗， 5 m i n x 3 次; 加生物素化标记抗兔二抗( 稀释 度为 1 : 3 0 0 ) ， 室温孵育 1 h ; P B S T 洗， 5 m i n x 3 次; 加 辣根过氧化物酶标记链霉卵白素三抗( 稀释度为l : 3 0 0 ) ， 室温孵育 1 h ; P B S T 洗， 5 m i n x 3 次; 用 D A B 工 作液显色2 m i n 左右，
15、 镜下控制染色程度; 自 来水终 止显色反应， 裱片， 晾干; 梯度乙醇脱水， 二甲苯透 明， 中性树胶封片， 显微镜下观察。用I m a g e - p ro P l u s 图像分析系统进行量化分析。 1 . 8 统计学分析方法全部数据以x 士 : 表示， 组 间 样本均数比 较应用O n e - w a y A N O V A 分析。 2 结果 2 . 1 山茱英提取物对模型大鼠脑梗死面积的影响 对照组大鼠脑皮层未见有任何异常改变; 模型组 大鼠在右侧皮层发现有明显的梗死区， 范围较大且 颜色较深; 而山茱英提取物小、 中、 大剂量组大鼠皮 层梗死区与模型组相比， 颜色浅且梗死区范围较小
16、。 2 . 2 山茱英提取物对脑梗死模型大鼠脑皮层 N O 含量和 N O S 活性的影响结果显示， 模型组 N O含 量和N O S 活性较对照组明显升高( P 0 . 0 5 ) ; 在黄茂与地塞米松并用组中， 黄芭 能明显对抗地塞米松的免疫抑制作用( P 0 . 0 1 ) 。结论: 黄芭不同剂量、 不同给药途径给药对小鼠腹腔巨噬细胞吞 噬能力均有不同程度的增强作用， 并能对抗地塞米松对其抑制作用。 关键词 黄蔑; 小鼠; 腹腔巨噬细胞; 吞噬能力 中图分类号 R 2 8 5 . 5 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 1 - 5 3 0 2 ( 2 0 0 5 ) 2 1 - 1 6
17、 7 0 - 0 3 黄蔑为豆科多年生草本植物蒙古黄蔑或膜荚黄 蔑的根。中医认为其性甘， 微温， 归脾、 肺经， 具有补 气 升阳、 益卫固表、 托毒生肌、 利水退肿之功效 。 临床上主要治疗脾虚证、 汗证、 脾肺气虚证、 气血两 虚证、 疮疡、 水肿等。近年来的研究发现黄蔑含有多 种生物活性成分， 如多糖、 蛋白、 生物碱、 氨基酸、 黄 酮类、 昔类等 2 1 ， 一些活性成分有促进抗体生成， 诱 导干扰素产生和促进免疫反应的作用， 其中以黄蔑 多糖( A P S ) 的研究为多。本试验利用生黄蔑制成黄 蔑水煎剂， 通过不同剂量、 同剂量不同给药途径及黄 蔑与地塞米松并用对比 试验就黄茂对
18、免疫效果的影 响作进一步的研究。 1 材料 1 . 1 动物昆明种健康小鼠， 体重1 8 2 2 g ， 雌雄 各半， 由河南医科大学试验动物中心提供， 合格证号 为豫医试动准字第4 1 0 1 1 7 号。 收稿日 期32 0 0 5 - 0 1 - 1 0 基金项目 安徽教育厅自 然科学基金项目( 2 0 0 5 - k j l 6 0 ) 通讯作者 宁康健， T e l : ( 0 5 5 0 ) 6 7 3 3 1 1 3 , F a x : ( 0 5 5 0 ) 6 7 3 3 1 6 5 E 一 二 1 : n k j 2 1 0 s o h u . c o m 1 6 7 0
19、. 1 . 2 仪器 7 5 6 型分光光度计( 上海第三分析仪器 厂) ; T D L S 。一 2 B台式离心机( 上海安亭科学仪器 厂) ; 生物显微镜( S L - B L - S - 2 ) ; 显微摄影( 日 本 奥林巴斯显微摄影， C H 3 0 - 3 1 3 N附自 动摄影) 等。 1 . 3 药物与试剂生黄蔑购于凤阳药材公司， 经安 徽科技学院中药实验室周宗运副教授鉴定为蒙古黄 茂A s t r a g a l u s m e m b r a n a c e u s ( F i s h . ) B e g . v a r . m o n g h o l ic u s ( B
20、 e g . ) H s i a o 的干燥根片。 地塞米松磷酸钠注射液 ( 天津药业， 批号0 2 0 0 4 2 ) ， 瑞氏染液由基础医学实验 室提供。 黄茂水煎剂制备: 称取黄蔑4 0 0 g ， 清洗后加人 适量水浸泡3 0 m i n ， 第1 次煎9 0 m in ， 第2 次6 0 m i n , 第3 次3 0 m i n ， 合并3 次滤液， 用 2 0 %的氢氧化钠溶 液调节p H 为7 . 0 ， 将滤液浓缩后离心1 0 m i n ( 4 0 0 0 r “ m i n 一 ) ， 取上清液定 量至含生药1 g “ m L - 的 黄茂水 煎剂， 装瓶消毒备用 3 0 黄 蔑 多 糖的 测定4 : 取在1 0 0 干 燥至恒重的 无水葡萄糖0 . 1 g ， 精密称定， 置1 0 0 m L 容量瓶中， 加水溶解并稀释至刻度， 摇匀即得对照品。精密量 取本品5 0 m L ( 如有沉淀， 需先加热溶解， 放冷) 置