差异蛋白质组学技术及其在体液研究中的应用.pdf

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1、1 4 6 重庆医 科大学学报2 0 0 6 年第3 1 卷增刊 ( J o u r n a l o f C h o n g q in g M e d ic a l U n iv e r s it y ) 1 9 周 正， 刘丽萍， 张赤志， 等.抗纤软肝冲剂对肝星状细胞自 分 泌转化生长因 子 0 1 的影响 J 1 . 中国中 西医结合消化杂志， 2 0 0 3 ; 1 1 ( 3 ) : 1 5 7 - 1 5 9 . 2 0 S a k a i d a I , H i r o n a k a K , K i m u r a T , e t a 1 .H e r b a l m e d

2、i c i n e S h o - s a ik o - t o ( T J - 9 ) i n c r e a s e s e x p r e s s i o n m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P s ) w i t h r e d u c e d e x p r e s s i o n o f t i s s u e i n h i b i t o r o f m e t a l l 叩r o t e i n a s e s (T I M P s ) i n r a t s t e l l a t e c e l

3、 l J .L if e S c i , 2 0 0 4 ; 7 4 ( 1 8 ) :2 2 5 1 - 2 2 6 3 . 2 1 1丁惠国， 王宝恩， 尚宏伟， 等. 复方中药8 6 1 对大鼠肝星状细胞 系一氧化氮合酶表达及其活性的影响 J 1 . 中国中西医结合杂志， 2 0 0 2 ; 2 2 ( 5 ) : 3 6 2 - 3 6 4 . 2 2 丁惠国， 唐淑珍， 王宝恩， 等. 复方8 6 1 对肝星状细胞分泌表达 内 皮素一1 蛋白 及m R N A的影响 J . 中 华肝脏病杂志， 2 0 0 3 ; 1 1 ( 5 ) : 3 0 8 . 2 3 王军民， 姚希贤， 李

4、校天， 等. 丹参对肝星状细胞胞浆游离钙的 影响J 1 . 四 川大学学报( 医学版) , 2 0 0 5 ; 3 6 ( 2 ) :2 2 1 - 2 2 4 差异蛋白质组学技术及其在体液研究中的应用 熊正宁 综述， 王济明 审校 ( 重庆医 科大学附属第一医院肝胆外科， 重庆 4 0 0 0 1 6 ) 虽然对人类的重大疾病进行了大量的研究，也取得了 很多的成果。 但至今仍无突破性进展。 如何预防、 诊断及治疗 这些危及人类健康的重大疾病是PT R 待解决的难题。 随着蛋白 质组学及差异蛋白质组学研究方法的开展， 近年来采用差异 蛋白 质组学方法对人类重大疾病蛋白 质组进行研究， 特别是

5、在研究细胞的增殖、 分化、 异常转化、 肿瘤形成等方面进行了 有力探索， 鉴定了一些与疾病相关的差异蛋白质， 为疾病的 诊断、 药靶的发现、 疗效判断和预后提供了重要依据0 。目 前 研究表明体液在疾病发生过程中 会产生差异表达的蛋白 质， 所以对体液蛋白质分析对于疾病的诊断、 疾病的发生机制研 究和疾病治疗、 疫苗和药物开发等都有着重要意义。当前借 助于有着高通量分析能力的差异蛋白质组学研究方法， 体液 蛋白 质组学研究正蓬勃发展。 本文就差异蛋白 质组学研究方 法及其在体液研究中应用概况综述如下。 离( E S I ) 和基质辅助激光解析电离( M A L D I ) 为代表的软电 离技术

6、， 能高效地电离一些完整或片断的大分子生物聚合 物， 可以测定分子量达4 0 万的生物大分子， 通过肤质量指纹 图 谱( p e p t i d e m a s s f i n g e r p r i n t i n g ) , 肤序列标签( p e p t i d e s e - q u e n c e t a g ) 和肤阶 梯序列( p e p t i d e l a d d e r - s e q u e n c i n g ) 等 方 法， 结合蛋白 质数据库检索可实现对蛋白 质的快速鉴定和高 通量筛选4 1 0 1 .3 蛋白 质组信息学 蛋白 质组信息学主要包括蛋白 质组研究结果

7、的公布、 查 询及应用等。相应的蛋白质数据库及分析软件的出现大大提 高了蛋白 质组分析的效率， 使蛋白质的快速鉴定成为可能rn 将差异蛋白质位点进行鉴定， 可分析已知蛋白质的结构、 性 质和功能， 亦可丰富现有蛋白质数据库， 进而展开功能蛋白 质组学研究。 1 差异蛋白质组学研究方法2 差异蛋白质组学在体液研究中的应用 1 . 1 双向凝胶电泳技术 双向 凝胶电 泳技术( t w o - d i m e n s i o n a l p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s , 2 D - P A G E )

8、双向 凝胶电 泳是目 前 应用的 最多 的蛋白质技术，也是差异蛋白质组学研究的重要手段之一。 8 0 年 代出 现的固 相p H 梯度( I P G ) 凝 胶， 克 服了 载 体 两 性电 解质引起的聚胶时间延长、 梯度不稳、 阴极漂移等现象， 使得 双向电泳的稳定性和重复性得到明显改善。配合银染、 荧光 染色或放射性标记等方法17 1 ， 一般可以 分离到1 0 0 0 - 3 0 0 0 个 蛋白质样点， 最多可以分离到 1 1 0 0 0 个左右蛋白 质样点3 ， 分 辩率可以 达到n g 级， 促进了 双向电 泳的 应用和推广。 1 .2 质谱技术 质 谱技 术( m a s s s

9、 p e c t r o m e t r y ,M S ) 与电 泳 技术联用已 成 为当今大规模自 动化鉴定蛋白 质组的主要方法。 其基本原理 是使样品离子化后， 根据不同离子间的质荷比( m / z ) 的差异 来分离并确定相对分子量。8 0 年代中期出现的以电喷雾电 体液是机体内 所有物质交换和运输的场所， 包括细胞 内液和细胞外液。一般意义上的体液是指细胞外液， 包括血 液、 脑脊液、 尿液、 唾液、 泪液、 乳汁、 精液、 胆汁等。已有的医 学理论与迄今为止的疾病研究诊治实践都表明， 体液与人的 生理、 病理都有着密切关系。疾病发生过程都伴有体液蛋白 质表达差异。 对生理状态和病理状

10、态下体液差异蛋白质的深 人研究， 既能推动生物医学基本理论研究的进程， 又将为临 床领域提供了多种可能的诊断标志物、 预后评估指标和药物 作用靶点。 所以现在对各种体液的蛋白质组学研究正蓬勃发 展起来。 现就目 前差异蛋白 质组学在体液研究的应用概述如 下。 2 . 1 差异蛋白质组学在血液系 统疾病研究中的应用 血液通过循环系统与全身各个组织、 器官密切联系， 参 与机体各项生理活动， 维持机体正常新陈代谢和内外环境平 衡。 在某些病理情况下， 血液系统疾病除直接累及血液外， 还 重庆医科大学学报2 0 0 6 年第3 1 卷增刊 ( J o u r n a l o f C h o n g

11、q i n g M e d ic a l U n iv e r s it y ) 1 4 7 可影响全身组织、 器官， 而各组织、 器官的病变也可直接或间 接地引起血液发生变化。 所以通过对血液蛋白质组学分析将 为诊断和治疗血液系统疾病及其他组织、 器官的疾病提供新 的选择。 当前对血液蛋白质的研究主要集中在血液系统肿瘤 和其他系统的肿瘤及某些疾病的血清或血浆蛋白 质。 特别在 寻找血清肿瘤标志物及肿瘤相关蛋白 质， 为应用临床诊断方 面做了较多研究， 取得了不少的成果。现将近期的应用进展 概述如下。 H a n a s W等运用2 一 D E方法研究儿童白 血病和其他恶 性血液系统疾病。他们

12、发现， 在儿童急性白血病， 癌性蛋白 1 8 ( o n e o p r o e i n , O p 1 8 ) 磷酸化程度明显与细胞周期中S 期细 胞比 例相关。 调节O p 1 8 的 表达及磷酸化状态， 可望有效地抑 制白血病细胞增殖。 意大利学者在研究局灶性节段性肾小球硬化症时采用 先色谱后电 泳的方法分析了病人的血浆样品， 共纯化了1 0 种差异表达的血浆蛋白质， 质谱鉴定了其中六种， 分别是白 蛋白 异构体、 载脂蛋白J 、 玻基结合素、 纤维蛋白 原 ，链、 li b u l i n 和植物凝集素相关的丝氨酸蛋白 水解酶rn A l e x e 8 I等将来自 于卵巢癌患者和健康

13、人的血清蛋白质 质谱数据资料进行比较分析利用其中仅7 - 9 种多肤构建了 几种完全能重复的模型， 提出了一种利用蛋白 质组学新的卵 巢癌诊断系统， 其灵敏度和特异性可达1 0 0 %. K l a d e 9 等人先比较了健康肾脏与肾细胞癌肾脏组织的 2 一 D E 蛋白 质图谱， 再分别用病人及健康人的血清样本进行 免疫杂交， 结果发现5 个特异性的点与病人血清样本发生免 疫反应， 提示这5 个点的蛋白 质可能是肿瘤相关抗原。且鉴 别出 两种肿瘤相关抗原分别是平滑肌蛋白2 2 一a和碳酸醉 酶。 在寻找乳腺癌早期诊断的蛋白 质标记的实验中， B r y n - m o r 0 I等通过对乳

14、腺癌患者和健康的对照组样品进行血清蛋 白 分析， 发现了在乳腺癌样品中特异表达的蛋白质， 并对其 进行进一步研究， 证实了N M P 6 6 蛋白在转移、 晚期、 早期乳 腺癌中的检测率达到 1 0 0 %， 成为有效的乳腺癌早期诊断标 记物。 Q u u 等利用差异蛋白 质组学方法比 较分析了 前列腺癌 患者和健康患者的血清标本发现了1 2 4 个特异峰， 敏感性和 特异性均达到1 0 0 %。 鉴定其中一些特异蛋白 质可作为前列 腺肿瘤的标记蛋白。 C h e n 21等用差异蛋白 质组学方法分析了肺腺癌患者和 非肺癌患者的血清， 发现区分肺腺癌与非癌患者的标记物， 并发现 I 期肺癌与m

15、 期肺癌蛋白表达有明显差异。 浙江大学肿瘤研究所利用S E L D I 和人工神经网络分析 了不同分期的结肠癌患者和健康人血清， 找到4 个特异性 峰，以此作为标记物经训练后的敏感性及特异性分别为 9 2 %和8 8 %， 远远高于C E A的2 0 %敏感性1 3 其他尚有很多利用血清或血浆蛋白质分析来对相应的 疾病的诊断和治疗的研究正在广泛开展。 但就总体来说仍处 于探索阶段， 尚有很多不完善的地方。 2 . 2 差异蛋白质组学在脑眷液研究中的应用 脑脊液作为脑和血液之间进行物质交换的中 介， 在大 脑发生某些疾病时脑脊液中的蛋白 质可发生不同程度的量 和质的变化。 对脑脊液蛋白质组的差异

16、比 较的研究有助于一 些神经系统的疾病的诊断及探明其病因。 目 前对脑脊液蛋白 质组的研究主要集中 在阿尔茨海默 病和某些精神疾病及一些脑肿瘤。 T o w n s e n d 1 A过对阿尔茨 海默病患者的脑脊液蛋白质的比较分析， 发现了一些有显著 差异的关键蛋白质， 其所作的脑脊液蛋白表达谱共注释了 1 1 3 1 个点，潜在的阿尔茨海默病标志物就存在其中。 D a v i d s s o n I 等人研究了不同病理时期病人脑脊液蛋白质图 谱中的突触蛋白在神经精神类疾病的作用， 他们发现特殊种 类的突触囊蛋白 在神经胞外传导中发挥重要作用。 患精神分 裂症或阿尔茨海默病时， 许多种类的突触

17、蛋白的表达情况都 发生改变， 这些疾病特异蛋白为深人了解疾病病理、 更好地 进行早期诊断提供了 线索。 刘建161 等利用S E L D I - T O F - M S 分 析了脑胶质瘤和非肿瘤患者的脑脊液， 发现了脑脊液中4 个 特异峰， 以此作为标记物区分脑胶质瘤和非肿瘤的敏感性和 特异性分别为 1 0 0 %和8 8 .9 %。虽然对脑脊液蛋白质组的研 究还处于起步阶段， 但也显示了其一些独特的 优势。 2 . 3 差异蛋白质组学在尿液研究中的应用 尿液作为血液代谢的产物， 全身很多疾病都可引起尿 液蛋白质的变化。 因此对尿液蛋白 质的研究开始的较早。 大 量的研究都将重点放在特殊疾病标

18、志物和毒理化学的机理 研究上。O s t e r g a a r 4 ( 3 ) : 2 6 5 一 2 7 4 . 6 H a n a s h S M, T e i c h r o e w D . M i n i n g t h e h u m a n p r o t e o m e e x p r e r i e n c e w it h th e h u m a n l y m p h o i d p r o t e i n d a ta b a s e J .E l e c t r o p h o r e s i s , 1 9 9 9 ; 1 8 ( 4 c ) : 2 9 6 7

19、一 2 9 7 1 . 7 M u s a n t e L e t a 1 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f p l a s m a f a c t o r s t h a t a l t e r t h e p e r - m e a b i l i t y t o a l b u m i n w i t h i n i s o l a t e d g l o m e ru l i J .P r o t e o m i c s , 2 0 0 2 ; 2 : 1 9 7一2 0 5 . 8 A l e x e G , A l e x e S , L

20、i o tt a L A , e t a l . O v a r i a n c a n c e r d e t e c t i o n 勿l o g i c a l a n a l y s i s o f p r o t e o m i c d a t a J .P r o t e o m i c s , 2 0 0 4 ;4 ( 3 ) : 7 6 6 一 7 8 3 . 9 K l a d e C S , V o s s T , K r y s t e k E e t a l I d e n t i f i c a t i o n o f t u m o r a n t i g e n

21、s i n r e n a l c e l l c a r c i n o m a b y s e r o l o g i c a l p r o t e o m e a n a l y s i s J I .P r o t e o m ic s , 2 0 0 1 ; 1 ( 7 ) : 8 9 0 一 8 9 8 . 1 0 B r y n m o r W, R o b e rt S , S h a n n o n B , e t a l . D e t e c t i o n o f e a r l y - s t a g e c a n c e r b y s e ru m p r o

22、 t e i n a n a l y s i s J .A m L a b , 2 0 0 1 ; 3 3 (9 ) : 3 2 一 3 6 . 1 1 Q u Y S ， A d a m B L , Y u t a k a Y , e t a l . B o o s t e d d e c i s i o n t r e e a n a l y s i s o f S E L D I m a s s s p e c t r a l s e ru m p r o f il e s d i s c r i m i n a t e s p p r o s t a t e c a n c e r f

23、 ro m n o n c a n c e r p a t i e n t s J .C l i n C h e m , 2 0 0 2 ;4 8 ( 1 0 ) : 1 8 3 5 一 1 8 4 3 . 1 2 C h e n G，G h a r ib T G , H u a n g C C , e t a 1 .P r o t e o m i c a n a l y s i s o f l u n g a d e n o c a r c i n o m a : i d e n t i f i c a t i o n o f a h i g h l y e x e p r e s s e

24、d s e t o f p ro t e i n s i n t u - m o r J .C l i n C a n c e r R e s , 2 0 0 2 ;8 (7 ) : 2 2 9 8 一 2 3 0 5 . 1 3 陈 益 定， 郑 树， 余捷凯， 等. 血清蛋白 质质谱模型 在大 肠癌诊 断中 的 应 用J 中 华 肿 瘤 杂 志， 2 0 0 4 ;6 ( 7 ) : 3 8 1 一 3 8 3 . 1 4 P a t t e r s o n S D . M a s s s p e c t ro p h m e t r y a n d p ro t e o m i c s

25、J .P h y s i o l G e - n o m i c s , 2 0 0 0 ;2 (2 ) : 5 9 一 6 5 . 1 5 D v i d s s o n P， P u c h a d e s M， B l e n n o w k . I d e n t if ic a t io n o f s y n a p t ic v e s i c l e , p r e - a n d p o s t s y n a p t i c p r o t e i n s i n h u m a n c e r e b ro s p in a l fl u i d u s i n g l

26、i q u i d - p h a s e i s o e l e c t r i c f o c u s i n g J . E l e c t r o p h o r e s i s , 1 9 9 9 ; 2 0 ( 3 ) : 4 3 1 一 刘 建， 郑 树， 余捷凯， 等胶质瘤脑脊液蛋白 指纹图质谱仪 参考文献 1 S e o w T K . T w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s m a p o f t h e h u m a n h e p - a t o c e l l u l a r c a r

27、 i n o m a c e ll l i n e , H C C - M, a n d i d e n t i f i c a t i o n o f t h e s e p a r a t e d p ro t e i n s b y m a s s s p e c t ro m e t ry J .E l e c t r o p h o r e s i s , 2 0 0 0 ;2 1 : 1 7 8 7 . 2 V u o n g G L , We i s s S M, K a m m e r W, e t a l .I m p ro v e d s e n s i t i v i t

28、 y p r o - t e o m i c s 场 p o s t h a r v s t a l k y l a t i o n a n d r a d i o a c t i v e l a b e l i n g o f p r o te i n s J E l e c t r o p h o r e s i s ,2 0 0 0 ;2 1 ( 1 3 ) : 2 5 9 4 . 3 Wil k i n s M R，C a s t e i g e r E , S a n c h e z J C , e t a 1 .T o w - d i m e n s i n o n a l e l

29、 c t r o p h o r e s i s f o r p ro t e i n p r o j e c t s : t h e e f f e c t s o f p r o t e i n h y d r o p h o b i e t y a n d c o p y n u m b e d J . E l e c t ro p h o r e s i s , 1 9 9 8 ; 1 9 : 1 5 0 1 . 应万涛， 钱小红.生物质谱技术应用及进展 J l - 军事医 学科学院 ， 2 0 0 0 ;6 ( 2 4 ) : 1 4 6 . S t u p k a E . L a

30、r g e s c a l e o p e n b i o i n f o r m a t i c s d a t a r e s o u r c e s J .C u r r 分析及其在临床诊断中的 应用 J . 中 华神经外科， 2 0 0 4 ;2 0 ( 5 ) : 3 6 2 - 3 6 6 . 1 7 O s t e r g a a r d M , W o l f H , O m t o f t T F , e t a l .P s o r i a s i n ( s 1 0 0 a 7 ) : A p u t a - t i v e u r i n a r y m a r k e

31、 r f o r t h e f o ll o w - u p o f p a t i e n t s w i t h b l a d d e r s q u a m o u s c e l l c a r c i n o m a J .E l e c t ro p h o r e s i s , 1 9 9 9 ;2 0 (2 ) : 3 4 9 . 1 8 C u t il l a s P R， N o r d e n A G， C r a m e r R， e t a l . D e t c t i o n a n d a n a l y s i s o f u r i n a ry p

32、 e p t i d e b y o n - l in e l i q u i d - c h ro m a t o g r a p h y a n d m a s s s p e c t ro m - e t ry: a p p l i c a t i o n t o p a t i e n t s w i t h r e n a l F a n c o n i s y n d ro m e 田.C l i n S c i , 2 0 0 3 ; 1 5 . 1 9 Y a o Y , B e r g E A , C o s t e l l o C E , e t a 1 .I d e n

33、t if ic a t io n o f p r o t e i n c o m p o - n e n t s i n h u m a n a c q u i r e d e n a m e l p e l l i c l e a n d w h o l e s a l i v a u s i n g n o v e l p r o t e o m i c s a p p r o a c h e s J . B io l C h e m , 2 0 0 3 ;2 7 8 ( 7 ) : 5 3 0 0 一 5 3 0 8 . 2 0 P a w e l e t z C P , T r o c

34、 k B , P e n n a n e n M e t a l .P ro t e o m ic p a tt e rn s o f n ip - p l e a s p i r a t e fl u id s o b t a i n e d b y S E L D I - T O F : p o t e n t i a l f o r n e w b io m a r k e r s t o a i d i n t h e d i a g n o s i s o f b r e a s t c a n c e r ) . D i s M a r k e r s , 2 0 0 1 ; 1 7 ( 4 ) : 3 0 1 - 3 0 7 . 2 1 K r i s t i a n s e n T Z , B u n k e n b o r g J , G ro n b o r g M , e t a l . A p r o t e o m i c a n a l y s i s o f h u m a n b i l e J . M o l C e l l P r o t e o m i c s , 2 0 0 4 ;3 : 7 1 5 - 7 2 8 . 刊 4院5