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1、!“ 卷# 期 #$“ 年 ! 月 微生物学报 !“#$ %*） 基因的启动子具 有强诱导性和强启动性， 适于外源基因的高水平诱导表达； J* 具有强烈的好氧生长偏爱性， 可进行细胞 高密度培养， 利于大规模工业化生产； J* 可高水平分泌表达外源蛋白， 纯化方便； J* 具有真核细胞的翻 译后修饰功能。 迄今已有 #$ 多种外源蛋白在 J* 中获得表达。但也有许多蛋白表达不理想， 甚至不能表达。要实 现目的蛋白在 J* 中的成功表达并兼顾其实用性和安全性， 必须充分考虑影响表达和应用的各种因素并 采取有效的优化策略。 3目的基因的特性 目的基因的特性是决定表达成败的首要因素。许多高 ) M
2、N 含量的基因由于成熟前终止而不能有 效转录。特定的 )M N 富含区可作为多腺苷酸或转录终止信号， 导致仅产生低水平或截短的 0O-) 。 某些稀有密码子， 尤其是稀有密码子密集区往往成为制约翻译速率的因素。目的基因特性对表达的影 响被认为是一种具有种属特异性的现象 # 。在某些情况下， 可通过定点突变去除成熟前终止结构域 “ 和替换稀有密码子 ! 。但在更极端的情况下， 即基因中存在大量 ) M N 富含区和稀有密码子密集区时， 往往需要进行全基因合成， 使编码序列符合 J* 偏爱性密码子用法和具有更高的 IM 9 含量 A 。 4启动子选择 最广泛应用的启动子 J)KP（醇氧化酶 启动子
3、） C ， 是由甲醇诱导的强启动子。在某些情况下 J)KP 的使用受到限制， 例如： 甲醇不适用于食品工业生产， 也是一种火灾隐患。故其它不用甲醇诱导的启动 子也引人注目。 !“#!（三磷酸甘油醛脱氢酶启动子） $ 是一种组成型强启动子。使用 !“#!在发酵时不需甲醇诱导， 不 必更换碳源， 工艺简单。但 !“#!不宜用于表达对 !% 有毒的蛋白。! 6。目的蛋白 345# 应尽可能具有与 !“#) 345# 相近， 最好是相同的 7 614。一般地， 目的基因编码序 列的第一个 #1“ 应尽可能接近， 最好处于 !“#) #1“ 的位置， 此位置对应于大多数载体多克隆位点的第 一个限制酶切点
4、处。?=AB9C 等通过调整人血清白蛋白 345# 与 !“#) 345# 的 7 614 相同后表达水 平提高 7. 倍以上 )D 。 “起始密码子 #6“ 的旁侧序列 起始密码子不可处于其周围序列形成的 45# 二级结构中。通过 45# 折叠分析可找到可能阻碍翻 译正常起始的二级结构， 利用替代密码子重新设计和调整翻译起始区及旁侧序列 ) 。另外， 必要的 EFGC? 共有序列也有助于翻译的正确起始。 #表达菌株的甲醇利用表型与表达盒的染色体整合位点和方式 通过一种或两种 !“# 基因的删除， 根据利用甲醇的能力， !% 宿主菌可划分为 D 种表型 H 。最广泛 使用的菌株 “:BC9FK
5、 6:KGC:F9 !KJA） 。EI$) （$%表型菌株会转变为 IJ:? *+, 基因的表达载体， 根据 ABCD9 抗性水平与 *+, 基因拷贝数的正相关性， 筛 选到高拷贝重组子 #/ 。*+, 基因很小 （:=0E“） ， 可兼作 -. /0+1 和 !“ 的筛选标志， 故载体很小 （仅 :FE） ， 易 操作。利用抗药性水平获得高拷贝重组子的方法简单快速。但相当大的一部分高抗性转化子不含多拷 贝基因。故在此法基础上， 需进一步筛选确定真正的高拷贝高表达重组子。另外 ABCD9 是一种诱变剂， 有引起转化子突变的可能。 （+） 利用 G4 分析方法检测外源 G4 含量 #1 ， 此法
6、更为直接快捷， 但应辅 以前述方法以降低工作量， 提高筛选效率。 （0） 将目的基因两端连上宿主 ;G4 的非必需片段， 通过同源 重组整合于大量的 ;G4 重复单元中， 以获得高拷贝。此方法见于酿酒酵母表达系统 7) ， 具有在 !“ 中 成功应用的可行性。 基因剂量与表达水平的关系取决于特定的外源蛋白。所以在获得多拷贝重组子的基础上， 要进一 步筛选确定因具有合适拷贝数而显示最佳表达水平的菌株， 亦即高表达菌株的筛选应以表达的蛋白量 为最终标准。可利用 GH! ?+=的可能性可获得较好的表达水平。最大 的障碍就是首先要获得第一步的成功， 即可获得一定水平的表达。取得这一阶段的成功后， 通过
7、调整已 明确的各种参数来优化表达， 常可获得诱人的表达水平 * 。 随着对 $% 表达系统的利用和探索的拓展和深入， 必将不断获得新的优化表达策略， 从而可充分发 掘 $% 表达系统在生物技术领域尤其是基因工程产品产业化方面的应用潜力。 参考文献 # .-.12A84 B，C.4843% D E，B./% B F，!“ #$G 6.46-71-2 H/. /%61345 2I86A-212 48J 2-K.-61/8 /H A-6-./5/7/L2 %./6-182 18 6A- 3-6AI5/6./%A1K I-426 %#+997,+ :,59;#+9? 95+ 895 9(+#$#A,
8、(7 5,4$-,7 4,(, ,;:5,+#9( #( %:5,+#9( 98 S$#- #+$,） ：JGGEI !G N5,44 O U，:5,+#9( =+,7 9( 79, Z#S 7#5, 9:W +,-,#9(0 ;!“(+S-#Z U，.$=,?5(7,5S 20 Y#5, 1N* +5,(#(4 98 %:5,+#9( 98 8$(#9(- ,:95 #( S, W,+ %:5,+#9( 98 S, N(7#7 5$49+ -#:! 4,(, 97#(4 895 :5,+,7 $+#(4 S, 1%/?2 +#4(- :,:#7,0 68, - .#( =W S, W,+ %:5,+#9( (7 S5,5#9( 98 #(+$-#( #( %:5,+,7 #( %!“(+* ;+$ .&+$，!BBQ， !F3： ! H !CI DBD微生物学报G3 卷