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1、论著 文章编号： 1000-5404 （2005） 22-2242-03 成年大鼠局灶性脑梗死后神经元前体细胞的迁移研究 谭新杰1， 胡长林1， 蔡文琴2， 杨 忠2 （ 1重庆医科大学附属第二医院神经内科，重庆 400010；2第三军医大学基础医学部 神经生物学教研室，重庆 400038） 提 要：目的 探讨成年大鼠大脑中动脉栓塞缺血再灌注后梗死灶周神经元前体细胞的迁移特征。方法 建立一侧 大脑中动脉栓塞缺血再灌注模型， 应用免疫组化及细胞记数检测缺血再灌注后 1、 7、 14、 21 d 梗死灶周神经元前体细胞的 变化。结果 各个时相点的梗死灶周均可见神经元前体细胞； 在缺血再灌注后第7
2、天阳性细胞的数量达到高峰， 随后逐渐 下降； 但在梗死区域的镜像区域未见到阳性细胞的表达。结论 成年大鼠大脑中动脉栓塞缺血再灌注可激活神经元前体 细胞的发生， 并诱导神经元前体细胞朝着梗死区域迁移。 关键词：神经元前体细胞； 大脑中动脉栓塞； 缺血再灌注； 迁移 中图法分类号：R-322；R338. 1；R743. 33文献标识码：A Migration of neuronal precursors after focal cerebral ischemia in adult rats TAN Xin-jie1，HU Chang-lin1，CAI Wen-qin2，YANG Zhong2（1D
3、epartment of Neurology，The Second Affiliated Hospital， Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing 400010，2Department of Neurobiology，College of Medicine，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China） Abstract： Objective To study the migration of neuronal precursors around the infa
4、rct area after focal cer- ebral ischemia. Methods Animal models of middle cerebral artery occlusion（MCAO）were established in 16 adult rats，and four of another 8 rats served as normal control and four underwent sham operation. Immunohisto- chemistry and cell count were applied to explore and contrast
5、 the migration of neuronal precursors for up to three weeks after a 2-hour episode of focal cerebral ischemia. ResuIts The migration of neuronal precursors toward the infarct area could be found at various timepoints. The number of neuronal precursors started to increase in 1 d after reperfusion aro
6、und the infarct area and reached the peak in 7 d，then declined till day 21. However，the neuronal precursors could not be examined in the corresponding non-ischemia area. ConcIusion The neuronal precursors could migrate into the ischemic penumbra. It indicates that after cerebral ischemia，neuronal pr
7、ecur- sors are directed toward the sites of brain injury，where they might be in a position to participate in brain repair and functional recovery. Key words：neuronal precursors；middle cerebral artery occlusion；reperfusion；migration 在成年大鼠脑内神经元的产生主要局限于两个区 域： 沿着侧脑室的室下区 （subventricular zone，SVZ） 和 齿状回的粒
8、下层（subgranular zone，SGZ） 1。现有的 一些研究表明脑损伤可以刺激成年脑的神经发生， 并 且在某些情况下可以诱导新生的神经元偏离正常的迁 移路线而朝着病灶定向迁移。因此研究神经元前体细 胞的迁移具有极其重要的意义。本实验采用神经元前 体细胞的标志物 （doublecortin，DCX） 探索大脑中动脉 栓塞 （middle cerebral artery occlusion，MCAO） 缺血再 灌注后梗死灶周神经元前体细胞的迁移特征， 以期为 作者简介： 谭新杰 （1977 - ） ，男，江西省遂川县人，博士研究生，主要从事 神经元前体细胞迁移方面的研究。电话：（023）
9、 68752232，E-mail： txj1012 tom. com 收稿日期： 2005-05-13； 修回日期： 2005-09-18 脑血管病的治疗提供一定的理论依据。 1 材料与方法 1. 1 实验动物及分组 成年雄性 Wister 大鼠 24 只， 体质量 200 250 g， 由第三军 医大学实验动物中心提供。随机分为以下各组： 正常对照组 （4 只） ； 假手术对照组 （4 只） ； 缺血后 1 d 组 （4 只） ； 缺血后 7 d 组 （4 只） ； 缺血后 14 d 组 （4 只） ； 缺血后 21 d 组 （4 只） 。对照组 除不栓塞大脑中动脉外其余处理同梗死组。 主要
10、试剂 ： 羊多抗 Doublecortin 购自 Santa Cruz Biotechnol- ogy；SABC 免疫组化试剂盒及 DAB 显色试剂等均购自武汉博 士德生物技术公司。 1. 2 线栓法大 MCAO 缺血再灌注模型的制作 0. 4%戊巴比妥钠 （40 mg/ kg） 腹腔麻醉， 取仰卧位， 做颈部 前正中切口， 分离暴露右侧颈总动脉、 颈外动脉、 颈内动脉及翼 2422 第 27 卷第 22 期 2005 年 11 月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE Vol. 27，No. 22 Nov. 20
11、05 第 22 期 谭新杰， 等. 成年大鼠局灶性脑梗死后神经元前体细胞的迁移研究 腭动脉， 用微动脉夹暂时夹闭颈总动脉、 颈内动脉及翼腭动脉， 并在颈外动脉近心端、 远心端分别穿线， 远心端系紧， 近心端系 一个松结 （备线） ， 在颈外动脉的两线间剪一个小口， 将一预先 制备好的栓线， 经小口插入颈外动脉， 为防止滑出和出血， 将颈 外动脉的备用丝线系紧， 然后移去颈内动脉处的动脉夹。尼龙 线经分叉进入颈内动脉， 并继续伸入大脑前动脉近端， 此时可 遇轻微阻力 深度为 （18. 5 0. 5） cm ， 这样就阻断了大脑中动 脉的血流来源。外留 1 cm 长尼龙线， 缝合皮肤。栓塞 2 h
12、 后提 拉尼龙线至有阻力时止， 此时尼龙线已退至颈外动脉切口处， 血流再通制成再灌注模型。 按照 Longa 等 25 级神经功能缺陷评分法进行神经功能评 价， 选取评分 1 级以上的大鼠进入下一步实验。 1. 3 冰冻切片的制备 将各组大鼠根据不同时相点用 0. 9% 生理盐水和 4% 多聚 甲醛经心脏灌注后迅速取脑， 30%蔗糖脱水直至组织沉底后行 冰冻切片 （厚度为 30 m） 。 1. 4 Nissl 染色 将冰冻切片放入 0. 1%甲苯胺蓝内， 60 3 min；快速蒸 馏水洗； 95%乙醇分色 10 s 左右， 镜下控制反应； 70%、 80% 及 100%乙醇上行脱水， 二甲苯透
13、明、 中性树胶封片， 显微镜下观 察。 1. 5 免疫组化染色 组织切片经 3%H2O2及正常兔血清封闭后， 加入一抗 DCX （1: 200） 后 4 过夜， 后续操作采用免疫组织化学 SABC 法， DAB 显色， 光镜下观察。胞体及突起染色呈棕色为阳性结果； 阴性对照用 PBS 代替一抗。 1. 6 统计学方法 400 倍光镜下观察梗死灶周 DCX 阳性细胞数， 每只大鼠选 取 5 个非连续的脑片进行计数。实验结果以 -x s 表示， 采用 SPSS 10. 0 统计软件进行多组均数的方差分析和 t 检验。 2 结果 2. 1 MCAO 模型脑组织的形态学观察 本试验所使用的动物模型中脑
14、梗死主要发生在大脑中动 脉供血区， 即额叶及顶叶的皮层和纹状体 （图 1） ， 以第 7 天最 为明显。梗死侧脑组织肿胀， 中线移位； 梗死区细胞层次紊乱， 胞体呈淡染、 无光泽， 胞核碎裂， 尼氏体溶解。 a：Non-ischemia area；b：Ischemia area 图 1 大脑中动脉栓塞后 Nissl 染色结果 （ 100） Fig 1 Cortical layer and striatum of frontal lobe and parietal lobe after the middle cerebral artery occlusion （ 100） 2. 2 DCX 的免
15、疫组化染色 假手术组和正常鼠脑中 DCX 阳性细胞主要位于海马和室 下区， 在皮层锥体细胞层有较少的分布。在梗死后1 d 组， 梗死 灶周可见极少量 DCX 阳性细胞， 环绕梗死区， 胞体颜色淡染， 与成熟神经元相比， 胞体较小， 呈梨形， 前导突起明显且较短， 并指向梗死区， 这些细胞具有典型的正在迁移中的神经元的形 态特征 3， 提示神经元前体细胞的存在和正朝梗死区迁移。在 梗死后 7 d 组， 梗死灶周的 DCX 阳性细胞明显增加， 神经元前 体细胞的形态与 1 d 组相似。在梗死后 14 d 及 21 d 组， DCX 阳性细胞的数量逐渐减少， 21 d 时接近正常。同时， 在所有时
16、相点中， 梗死区中央均未见到 DCX 阳性细胞； 并且在梗死皮层 和纹状体的镜像区域均未见到 DCX 的阳性表达 （图2） ， 但在所 有时相点的胼胝体中及其背侧可见到 DCX 阳性细胞流（图 3） 。梗死后不同时相点梗死区附近 DCX 阳性细胞数的变化见 表 1。 A：The infarct of cortex（SABC 100） ，a：Non-ischemia area，b：Ischemia area；B：Magnification of the neuronal precursors around the infarct area of Fig 2A（SABC 400） ，：Neuron
17、al precorsors；C：The infarct area of striatum（SABC 100） ，a：Non-ischemia area，b：Ischemia area 图 2 缺血再灌注后 7 d 梗死灶周神经元前体细胞的 DCX 表达 Fig 2 The neuronal precursors around the infarct area in 7 days after reperfusion 3422 a：Corpus callosum；b：Migrating stream of neuronal precursors 图 3 缺血再灌注后 7 d 胼胝体周围的神经元前体
18、细胞迁移流 （SABC 100） Fig 3 The migrating stream of neuronal precursors around the corpus callosum in 7 days after reperfusion （SABC 100） 表1 脑缺血再灌注后不同时相点 400 倍光镜下梗死灶周 DCX 阳 性细胞数 （-x s） Tab 1 Number of DCX positive cells at various timepoints after reperfusion（-x s） ControlSham-operation1 d7 d14 d21 d DCX
19、+cells 1.5 0.61.7 0.95.8 1.3 23.3 1.7*7.3 1.33.0 0.8 *：P 0.01，vs other groups 3 讨论 脑梗死后神经元的坏死导致了相应的神经功能缺 失， 这提示我们可以采用细胞替代疗法来减轻或恢复 神经功能。从临床的角度看， 一个更深层次的问题是 新生神经元能否迁移入病灶并替代已死亡的神经元。 因此， 研究神经元前体细胞的迁移具有重要的意义。 Doublecortin 是在迁移和分化中的神经元上表达 的一种微管相关蛋白， 主要表达在迁移中的神经元胞 体和前导突起上以及分化中的神经元轴突上 4。在 胚胎期及生后发育过程中中枢和周围神经
20、系统的迁移 神经元上均有 DCX 的表达。研究表明 DCX 可能是通 过调节微管的组构和稳定性来指导神经元的迁移 5。 本实验显示局灶性脑梗死再灌注后有新生神经元迁移 入梗死大脑皮层和纹状体的周围。这些细胞具有典型 的正在迁移中的神经元的形态特征， 例如梭形的胞体 和单个的前导突起， 符合 O Rourke 等 3报道的神经 元前体细胞的特征。在梗死后 1 d 即可发现灶周神经 元前体细胞的存在， 提示这些细胞可能来源于原位的 增殖。随着再灌注时间的延长， 梗死灶周的神经元前 体细胞逐渐增多， 并于第 7 天时达到高峰， 随后又逐渐 减少， 并于 14 d 后逐渐降至正常水平， 这与国内一些
21、研究结果相似 6， 7。在所有时相点的梗死区中央均未 见到神经元前体细胞的存在， 这提示梗死灶内的微环 境可能不适合神经元前体细胞的生存， 或者是梗死区 内产生了某种排斥性导向因子， 从而阻止了神经元前 体细胞迁移入梗死区内， 这与国外学者 Jin 等 8的研 究相一致， 原因还有待于进一步的分析和研究。至于 在梗死 1 2 周以后神经元前体细胞逐渐减少的原因， 我们认为可能有一些神经元前体细胞分化成熟的神经 元而不再表达 DCX， 又或是进入了一种迁移后的细胞 死亡， 对此我们正在进行进一步的研究。 目前国外的一些神经科学研究者对神经元前体细 胞的迁移进行了一定的研究， 并发现了一些导向因子
22、， 如吸引性导向因子 Chemotaxis 和排斥性导向因子 Slit。 脑梗死后神经元前体细胞能定向迁移入梗死灶周， 表 明梗死脑组织产生并释放了某种或某些导向信号因 子， 从而引导神经元前体细胞的迁移。但迁移过程中 是否有排斥性因子的作用参与呢？这需要进一步的探 索。 总之， 我们的研究结果初步表明梗死刺激可以激 活内源性神经元前体细胞朝着正常情况下无神经发生 的区域迁移。这就让我们有可能利用这些细胞来替代 梗死后死亡的神经元或丧失功能的神经元， 从而改善 患者的神经功能缺损。 参考文献： 1Santarelli L，Saxe M，Gross C，et al. Requirement of
23、 hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants J . Science， 2003， 301 （5634） ： 805 -809. 2Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，et al. Reversible middle cere- bral artery occlusion without craniectomy in rats J . Stroke， 1989， 20 （1） ： 84 -91. 3O Rourke N A，Sullivan D P，Kaznowsk
24、i C E，et al. Tangential mi- gration of neurons in the developing cerebral cortex J . Development， 1995， 121 （7） ： 2165 -2176. 4Francis F，Koulakoff A，Boucher D，et al. Doublecortin is a develop- mentally regulated，microtubule-associated protein expressed in migra- ting and differentiating neurons J .
25、Neuron，1999，23 （2） ：247 - 256. 5Moores C A，Perderiset M，Francis F，et al. Mechanism of microtu- bule stabilization by doublecortin J . Mol Cell， 2004， 14 （6） ： 833 - 839. 6刘玲玉，曾庆杏. 脑缺血再灌注神经干细胞原位激活的研究 J . 卒中与神经疾病， 2003， 10 （6） ： 329 -332. 7张 波， 王任直， 李桂林， 等. 成年大鼠脑梗死后自体神经干细胞 的原位增殖 J . 基础医学与临床， 2003， 23 （6） ： 616 -619. 8Jin K，Sun Y，Xie L，et al. Directed migration of neuronal precursors into the ischemic cerebral cortex and striatum J . Mol Cell Neurosci， 2003， 24 （1） ： 171 -189. （编辑 汪勤俭） 4422 第 三 军 医 大 学 学 报 第27 卷