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1、应用限制性显示技术筛选 !“#$ 细胞脱核前后差异表达基因 危 敏 %,马文丽%,宋艳斌%,毛向明%,李 凌%,郑文岭$(% 南方医科大学分子生物学研究所,广东 广州?,将两组等量的细胞总+?纯化为?,反转录为3,?,利用+,-.+技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离、筛选./处理前后差异表达的基因。 对筛选出的差异表达基因进行克隆、测序,在AB9/59C检索进行序列同源性 分析。 结果 筛选及克隆了D个差异表达基因,其中水通道蛋白%(?E-%)基因经反转录-.+验证在./诱导脱核的 !细胞松弛素/;水通道蛋白%;差异表达 中图分类号:+FG=H$) 文献标识码:?)文章编号:%IDFJ=$总+?提
2、取试剂(b8a26)购自上海生 物工程公司;?纯化试剂盒购自-45? 连接酶、bJ载体、b5eP,?合成酶、b-混合物以及 其他-.+相关的试剂等购自b5!5+5公 司 。./ (S8:5182956P5156PS38B93BPh2951829P2P.4895P KFG*F$LP 59PV0P!B0PS38J1B34P+B7B534P-2iB31P2PA59:a42(GGJYJ$J%) 作者简介:危 敏(%GD*J),女,在读博士研究生,电话:$JI$D*GG*, NJ ?p) SenseTTAGAGGGTGAAGGAGAAA AnisenseCATGATTACGAATTGGAGC GAPAB
3、 (5CP 5 min, 然后在3P min内逐渐退火降为室温,即 P 3GO min,P 3GO min,=P 3GO min,OP 3GO min,5P 3GO min,CP 3GO min,3P 3GO min,HP 3GO min。 制备好的接头为双链的寡核苷酸分子,结构 如下: 5端为_pGATC的粘性末端,可以与用Sau3A 酶切后同样含有GATC粘性端的cATA片段分子相 连;3端为含有_CA的突出端,可以减少酶切片段间 的自身连接。 P a恒压电泳Ob= V。 电泳结 束后进行银染显色,并制干胶片保存。 P a恒压电泳Ob= V。停止电泳后, 硝酸银染色,可见IA_PCI分组扩
4、增后,每组中基因 危 敏d等G应用限制性显示技术筛选N5OH细胞脱核前后差异表达基因第H期D?B、ADP)表达下调。CA4A基因参与 细胞周期负调控,可通过细胞内信号转导诱导细胞凋 亡,引起细胞周期停滞,抑制细胞增殖6,我们的研究 发现CB可特异性增强该基因在K562细胞中的表 达。其中1个表达上调基因ABP1最值得重视。ABP1 是水通道蛋白家族成员之一,由DCnDCE等细胞中存 在ABP1的转录表达。 用丁酸盐诱导?E细胞向红 系分化后,ABP1的转录表达明显增加, 在人红白血 病K562细胞中也出现了同样的结果。ABP1启动子 中包含红细胞特异的CACCC元件, 研究发现在 ?E和K56
5、2细胞中ABP1启动子的活性是非红系 细胞(?CM细胞)的24倍。维甲酸可通过与 ABP1启 动子中维甲酸反应元件结合特异性地诱导?E细胞 表达ABP1。 无论是全反式维甲酸还是F_顺式维甲 酸都能以剂量依赖的方式明显增加ABP1 IRNA和 蛋白的表达1H。 另外,还有研究发现二甲亚砜和皮质 类固醇可诱导小鼠红白血病NE细胞表达ABP1 蛋白11。以上研究中多种促进红系分化药物都可显著 增强ABP1的表达,说明ABP1在红白血病细胞向红 系分化的调控中可能起到重要作用。 本研究采用CB诱导K562细胞脱核后,ABP1 也出现了特异性表达上调,提示ABP1表达与细胞脱 核及增殖抑制密切相关。目
6、前对于ABP1基因的功能 研究还多局限于与液体吸收或分泌有关的上皮细胞 及可能协同水跨细胞转运的内皮细胞中。ABP1高表 达在K562细胞脱核以及红系分化过程的作用如何, 尚待进一步研究。 参考文献: 1薛社普, 刘友华, 张世馥, 等O 红细胞分化去核因子:哺乳类红细胞 终末分化;肿瘤抑制的调节因子家族及其相关基因的克隆 PO 中国医学科学院学报, 2HHH, 2284:Q 3JS T?, ULMnV =, CW MXO EEYWLEZJ JCECnWJMWJZn CnScXC_ MWJZn McWZEQ M MIJXY Z CEYWLEZJ ECVSXMWZEK ZE IMIIMXJMn
7、CEY_ WLEZJ WCEIJnMX JCECnWJMWJZn;WSIZE KSECKKJZn Mn WLC cXZnJnV Z WLC WLCJE ECXMWC VCnCKPO AcWM AcM NC =Jn, 2HHH, 2284:Q , NMZ RN, CW MXO PEZXJCEMWJZn Mn CnScXCMWJZn Z K562 cCXXK JnScC Y cYWZcLMXMKJn BPO P JEKW NJX NC AnJa;DJ TJ PSn TJ DM RSC RSC BMZ, 2HH2, 22812:Q 1HG, =ZnV TB, CW MXO AnMXYKJK Z VC
8、nC CbECKKJZn MW_ WCEnK Z XCSDCIJM K562 cCXXK MWCE cYWZcLMXMKJn B WECMWICnWPO AJ ULCnV, 2HH3, 2283:Q 23F_43O 5马文丽, 郑文岭, PMICK B, 等O 限制性显示(RD_PCR)Q一种新的 差异显示技术N;孙志贤O 全军生物化学与分子生物学研究进 展O 北京Q 军事医学科学出版社, 1FFGQ 113_4O 6KJECZK Ec, MnCE E, _JnV PP, CW MXO cSX_1 JK ECdSJEC ZE cCXX cY_ cXC CbJW Jn CO CXCVMnK Mn
9、 JCnWJJCK M nZaCX VCnC MIJXYPO CCXX, 1FF6, G586:Q G2F_3FO , KSLMeM P, CW MXO fCnWJJcMWJZn, SEJJcM_ WJZn, Mn cLMEMcWCEJgMWJZn Z M nZaCX IE 2G,HHH JnWCVEMX ICIEMnC EZWCJn EZI CEYWLEZcYWCK Mn ECnMX WSSXCKPO P BJZX CLCI, 1FGG, 268H:Q 1564_42O GPECKWZn GN, AVEC PO fKZXMWJZn Z WLC cDNA ZE CEYWLEZcYWC JnWC
10、VEMX ICIEMnC EZWCJn Z 2G DJXZMXWZnKQ ICICE Z Mn MncJCnW cLMnnCX MIJXYPO PEZc NMWX AcM =cJ A=A, 1FF1, GG824:Q 1111H_4O FAICnJKLJ , =cLEJCE R_O fnScWJZn Z LSIMn MdSMZEJn_1 VCnC Y ECWJnZJc McJ Jn LSIMn CEYWLEZXCSDCIJM ?E cCXXKPO BJZcLCI BJZLYK RCK CZIISn, 2HH2, 2F8:Q F1_=, AVEC PO ABP1 CbECKKJZn Jn CEYWLEZXCSDCIJM cCXXKQ VCnCWJc ECVSXMWJZn Z VXScZcZEWJcZJ Mn cLCIJcMX JnScWJZn PO AI P PLYKJZX, 1FF, 285PW1:Q C1562_HO 危 敏,等O应用限制性显示技术筛选K562细胞脱核前后差异表达基因第2期165