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1、2 0 0 8 年1 2 月 中国实验动物学报December。2008 第1 6 卷第6 期A C T AL A B O R A T O R I U MA N I M A L I SS C I E N T I AS I N I C AV 0 1 1 6N o 6 停q 目0 镕 确 9 i 综述进展每 苎玉! ；穹e ；夸e ； e ；爷亡；、妙 异种移植的病毒安全性研究进展 马玉媛，杨勇贤，章金刚 ( 国家生物医学分析中心病毒安全检测实验室，军事医学科学院野战输血研究所，北京1 0 0 8 5 0 ) 【摘要】 猪人异种移植有望解决人源器官短缺的严重问题。然而，以前病毒( p r o v
2、i r u s ) 形式整合入猪基因组中 的猪内源性反转录病毒( p o r c i n ee n d o g e n o u sr e t r o v i r u s ，P E R V ) 难以去除，P E R V 有可能通过异种移植传播给人类，甚至 产生新的病毒性疾病。本文回顾了P E R V 与异种移植病毒安全性及我国特有小型猪中P E R V 的相关研究。 【关键词】异种移植；猪内源性反转录病毒；中国特有小型猪 【中图分类号】R 3 3 2【文献标识码】A【文章编号】1 0 0 5 4 8 4 7 2 0 0 8 ) 0 6 0 4 6 3 0 7 V i r a lS a f e t
3、 yR i s k sP o s e db yP E R V si nX e n o t r a n s p l a n t a t i o n M AY u y u a n ，Y A N GY o I l g - x i a n ，Z H A N GJ i n g a n g ( L a b o r a t o r yf o rV i r a lS a f e t yo fN a t i o n a lC e n t r eo fB i o m e d i c a lA n a l y s i s ，I n s t i t u t eo fT r a n s f u s i o nM e d
4、 i c i n e ， t h eA c a d e m yo fM i l i t a r yM e d i c a lS c i e n c e s ，B e i j i n g1 0 0 8 5 0 ，C h i n a ) 【A b s t r a c t 】P i gt oh u m a nx e n o t r a n s p l a n t a t i o nc o u l dp o t e n t i a l l ya l l e v i a t et h es h o r t a g eo fh u m a no r g a n s H o w e v e r ，p o r
5、 c i n e e n d o g e n o u sr e t r o v i r u s e s ( P E R V s ) w h i c h 啪p r e s e n ti nt h eg e r m l i n eo fp i g sa sp r o v i r u s e sc o u l dh a r d l yb ee l i m i n a t e d P E R Vw o u l d b et r a n s f e r r e dt ot h eh u m a nr e c i p i e n ta l o n gw i t hx e n o g r a f t s I
6、 naw o r s t - c a s es c e n a r i o t h i sm i tr e s u l ti nt h ee m e r g e n c eo fan e w v i r a ld i s e a s e T h i sr e p o r tr e v i e w e dr e s e a r c ho nv i r a ls a f e t yr i s k sp o s e db yP E R V si nx e n o t r a u s p l a n t a t i o na f tw e l l 鹊r e s e a r c ho n P E R V
7、f r o mC h i n e s em i n i a t u r ep i g s 【K e yw o r d s 】X e n o t r a n s p l a n t a t i o n ；P o r c i n ee n d o g e n o u sr e t r o v i r u s ；C h i n e s em i n i a t u r ep i g s 在医学领域里没有比异种移植更令人振奋的事 件。许多科学家认为异种器官移植将是2 l 世纪器 官移植的主流，猪的器官移植到人体最为顺利。除 了异种移植所带来的免疫排斥问题之外，猪内源性 反转录病毒( p o r c i
8、 n ee n d o g e n o u sr e t r o v i r u s ，P E R V ) 的感 染是当前国际上比较关注的热点问题。 1 猪内源性反转录病毒与异种移植的 病毒安全性 P E R V 感染问题给异种移植的前景蒙上了一层 阴影，使人们为此而感到迷茫。1 9 9 7 年P a t e i n c e 等首次发现P E R V 在体外可以感染人的多种细 胞，这一发现引起了人们对异种移植安全性的广泛 基金项目】国家科技支撑计划( 2 0 0 8 B A I S 4 8 0 6 ) ；国家自然科学 基金( 3 0 6 7 1 5 5 3 ，3 0 7 7 1 6 1 0 ，
9、3 0 8 0 0 8 2 9 ) ；广西壮族自治区应用基础研究 专项基金( 桂科基0 4 4 8 0 4 1 ) 资助项目。 【作者简介】马玉嫒( 1 9 8 1 一) ，女，博士生，研究方向：生物制品及 病毒安全性。 【通讯作者】章金刚，T e l F a x ：0 1 0 6 8 1 6 4 9 7 1 ；E - m a i l ：d u m 萄g n i c b m i c n 关注，人们担心带有P E R V 的猪的细胞或器官一旦 植入高度免疫抑制的人体内会否突破种间屏障造成 人源大流行幢3 17 继P a t i e n c e 等首先发现源自P K 一1 5 细胞猪内源 性反转录
10、病毒具有感染人细胞的能力之后，最近， V a nd e rL a a n 等H 1 又发现了P E R V 感染的新证据，他 们将猪的胰岛细胞移植入N O D S C I D 鼠的肾囊下，8 周后，他们用免疫组织化学的方法检测出P E R V p 3 0 9 a g 蛋白的表达，用定量R T P C R 技术检测到了 P E R V 特异性m R N A 的转录，证实了P E R V 在体内能 感染联合免疫缺陷的小鼠；对猪细胞嵌合体的测定 表明P E R V 也可感染其他不相邻的组织。这一结果 也表明异种移植存在病原安全性问题。尽管在接受 猪源器官或组织细胞移植的人体内，尚未发现 P E R
11、V 感染的证据。但是对于P E R V 潜在的病原安 全性问题却不容忽视。 内源性逆转录病毒( e n d o g e n o u sr e t r o v i m s ，E R V ) 是指以前病毒D N A 形式整合进宿主细胞基因组中， 并随细胞染色体复制而复制的反转录病毒。早在 7 0 年代初，已有不少学者即在体外培养的猪细胞系 万方数据 4 6 4 中国实验动物学报2 0 0 8 年1 2 月第1 6 卷第6 期A c t aL a bA n i m $ c iS i n ，D e c e m b e r ，2 0 0 8 ，V 0 1 1 6 ，N o 6 P K 1 5 、3 8
12、A 1 、P 丌等中发现了自发释放的C 型反转 录病毒粒子并对其进行了鉴定。与其他病毒不同的 是，这类病毒是内源性、以前病毒的形式存在于猪的 基因组中，由猪垂直传递的C 型反转录病毒，称之 为猪内源性反转录病毒J 。 P E R V 在形态学和生化学上具有其他哺乳动物 C 型病毒的典型特征，但核酸杂交试验证实，来源于 P K 1 5 的c 型病毒与小鼠、大鼠、猫、地鼠和灵长类 动物的c 型病毒具有明显不同，P a t i e n c e 和T a c k e 【6 j 分别对来自P K 1 5 的P E R V 进行蔗糖密度梯度离 心，测得其蔗糖浮密度值为1 1 4 1 1 6g c m 。电
13、镜 照片显示病毒粒子的直径约为1 1 0n m 。P E R V 由一 条单链R N A 组成，被包含在糖蛋白的外膜里，所有 的猪都含有的几个拷贝，至少有三个变种在体外培 V 养、感染性和假膜试验中能感染人体细胞“ 1 ，在感染 细胞后R N A 部分被逆转录为D N A ，D N A 再插入到宿 主细胞的基因组中，从而传递给后代，并且可直接指 导一个新病毒粒子的形成。 P E R V s 可分为口逆转录病毒和7 逆转录病毒两 类，具有传播风险的嗜人性P E R V s 属于7 1 家族，包 括P E R V A 、B 和C 。典型的7 逆转录病毒P E R V A ， B 和c 包含三个O
14、R F s 分别编码g a g 、p o l 和e n v ，它们 位于两个L T R s 之间，还包括转录所必需的调节元件 ( 如图1 1 ) 。P E R V A 、B 和C 都具有高度同源的g a g 和p o l 基因，但是e n v 基因序列显著不同。这些区别 反映了不同受体的特异性和对宿主的嗜性。P E R V R N A 在猪的所有组织中均有表达。 s L T R g a gp o l p p t I ，。 I c n v A e n v B e l l V - C 注：P E R V A 、B 和C 型前病毒基因组从5 端到3 端均包含三个大的开放阅读框，依次编码g a g (
15、 种属特异性抗原) ，p o l ( 多聚酶) 和e n v ( 囊膜蛋白) ，三者位于两个长末端重复序列之间。该三种类型的P E R V 的e n v 序列不同，I I 为包装信号，p p t 为聚嘌呤通道。 图1P E R V 前病毒基因组示意图 F r o m5 t o3 P E R V A ，一Ba n d - Cc o n t a i nt h r e el a r g eO R F s ，c o d i n gf o rg a g ( g r o u p - s p e c i f i ca n t i g e n ) ，p o l ( p o l y m e , m e ) a
16、n de n v ( e n v e l o p e ) t h a ta m l o c a t e db e t w e e nt h et w oL T R s T h e ym a i n l yd i f f e ri nt h e i re I l vg e q u e n c e ；I ；f l ，t h ep a c k i n ss i g n a l ；p p t ，t h ep o l y p u r i n et r a c t 瑰1 S c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no faP E R Vp m v i r a l
17、g e n o m e 经分析不同的猪种和细胞株显示有3 0 5 0 个 P E R V 拷贝以前病毒的形式弥散地整合进入猪的基 因组中。大多数前病毒都不完整是由于其编码序列 因突变或缺失而断裂成一个或多个O R F s 。仅少数 完整的全长P E R V s 能产生有感染性的病毒。该拷 贝数可在不同的猪品系之间或同一品系不同的个体 之间发生变化。迄今为止，在所有被检的猪种系中 均鉴定出P E R V A 和P E R V B 的存在。一般而言， P E R V A 前病毒拷贝数高于P E R V B 拷贝数。大部 分猪种系没有或含有低拷贝的P E R V C 。 尽管在所有猪品系中均发现了P
18、 E R V s 的存在， 但是在天然宿主体内没有发现其致病的迹象。因为 在人源细胞中很难存活，所以它们也不大可能产生 病变效应。尽管如此，P E R V s 有可能像相关反转录 病毒一样产生致病性。P E R V s 与长臂猿白血病病毒 ( G A L V ) ，猫白血病病毒( F e L V ) 或鼠白血病病毒 ( M L v ) 具有较高同源性，这些病毒均不可使其天然 宿主致病，但可使新宿主产生肿瘤或导致免疫缺 陷旧J 。G A L V 可能是在种间传播鼠内源性C 型反 转录病毒之后产生的。与此类似，F e L V 可能源于臼 齿类内源性c 型反转录病毒。 假型P E R V 囊膜缺陷型
19、鼠白血病病毒载体进行 体外研究结果表明：P E R V A 和P E R V B 型特异性 受体在人组织中广泛分布。最近发现P E R V A 型人 类受体，鉴定出两个相关的受体编码序列分别为 H u P A R 1 和H u P A R 2 。两个同源性蛋白证实了所 感染的病毒是P E R V A 型而不是P E R V B 或P E R V C 型。其在不同细胞类型中的表达更确切地表明人类 组织提供了一个更为大的可感染宿主范围。至今未 鉴定出P E R V B 型人类受体。P E R V s 可能具有突破 种间屏障而感染同源受体缺陷的异源性细胞引。 有趣的是，当用一种特有小型猪的外周血单核
20、 细胞与人细胞系共培养时，从P B M C 中分离出的嗜 人性重组型P E R V s 具有相当高的病毒滴度3 1 引。 这些P E R V s 病毒由P E R V C 型的基因组和P E R V A 型的受体结合位点组成。是否在猪体内或在原代细 万方数据 中国实验动物学报2 0 0 8 年1 2 月第1 6 卷第6 期A c t aL a bA n i mS c iS i n ，D e c e m b e r ，2 0 0 8 ，V 0 1 1 6 。N o 64 6 5 胞培养的过程中存在或产生了外源性病毒或者产生 了P E R V A C 重组型前病毒基因序列还有待考证。 因此P E
21、R V C 型与嗜人性的P E R V 的重组暗示了种 问传播的风险性。 P E R V s 所带来的另一种风险是P E R V 与人内源 性病毒重组，可能会产生新病毒和新的病原效应。 人基因组中包含H E R V s 相关的7 和8 反转录病毒 序列。理论上，在有效感染导致H E R V 和P E R V 转 录子共包装形成反转录病毒粒子时期，P E R V s 和 H E R V s 可发生重组。无论如何，至今还没有实验证 据证实体外发生这种重组的可能性。因此尽管我们 拥有的体外实验资料有限，P E R V 和H E R V s 的重组 可能预示了新的杂交内源性病毒产生的风险性。另 外，利
22、用基因修饰的方法防止超急性血管排斥同时 也可能增加了受体患者感染P E R V s 的风险性，如病 毒膜上a 1 ，3 半乳糖苷减少的同时也增加了受体患 者感染该病毒的风险，因为P E R V s 将对中和抗体和 补体所介导的溶病毒作用产生抗性，至少在体外实 验研究中，发现机体抗病毒机制效应随之会降低，是 否这样的修饰能为P E R V s 提供更多的机会感染受 体患者一直还不确定引。总之，P E R V s 具有致病的 潜在可能性，至少在体外与其他的7 反转录病毒有 许多共同的特征。 为了降低P E R V 传播的可能性，应该开发采用 多种策略。即使掌握了猪基因组的所有特性，培育 无P E
23、R V 相关基因序列的猪仍是一项相当困难的技 术。众所周知，所有猪中均含有前病毒序列的整合 位点，尽管只有一少部分能产生野生型P E R V s 。是 否可通过基因敲除技术和选择培育的方法消除所有 这样的位点一直还不确定。关于这一点，利用转座 子和重组酶有可能有效的从猪基因组消除这些位 点。体外实验研究已鉴定出某些近亲交配的M S 不 传播P E R V s 。鉴定出所谓的不传播或低病毒负荷的 动物可能会选择育种。无论如何，这些解决方案没 有排除这种可能：两个具有完整开放阅读框的缺陷 型病毒基因组通过重组和互补作用导致产生有感染 性的P E R V s 。理论上，两个缺陷型R N A s 通过
24、重组 和互补作用能被包装成成熟的病毒粒子，但是这种 事实发生的可能性会很低。当前正在探究用R N A 干扰技术和核糖体技术阻止P E R V 位点被激活或者 抑制R N A 的表达。抗病毒疫苗的产生或者在临床 上异种移植某些时期使用抗病毒治疗可有利于降低 P E R V 传播的风险性。叠氮胸苷( A Z T ) 是最具有代 表性的抗P E R V 药物，为了避免耐药性出现，可联合 使用逆转录酶和蛋白酶抑制剂药物。 总之，通过选择合适的猪种系( 特别是小型猪等 优良品种) 利用基因工程技术改造动物、开发新的抗 病毒药物及疫苗和不断完善的检测手段以及寻找合 适的动物模型对P E R V 进行研究探
25、索，可以把P E R V 种间传播的可能性降至最低，为以猪供体的异种移 植开发更好的前景。 在P E R V s 对公众健康造成威胁之前，可能会发 生如下情况。首先，异种移植中，具有感染性的 P E R V s 会复制且得到传播。其次，这些P E R V s 会感 染受体患者且传播。第三，P E R V 会从受体患者传 播给与该受体患者亲密接触的人随之导致更为广泛 的人与人之间的传播。这一系列的事情似乎是不可 能，但是不能排除。由于实验探究的狭隘性且缺乏 有效的动物模型，所以从这些研究方法中对种间传 播的风险性不能获得确定的结论。因此P E R V s 是 否将会带来风险性的问题依赖于精密设计
26、且有效控 制的临床试验。异种移植具有将感染性疾病引入社 会的可能，且具有感染人源细胞的事实，所以需对受 体患者进行长期的P E R V 感染监测试验研究。通过 对猪供体某些基因进行遗传修饰可缓和免疫排斥。 培育无P E R V 的优良小型猪种将为异种移植做出不 可替代的贡献。 2 我国小型猪内源性反转录病毒的相 关研究 我国有着异常丰富的猪种资源，特有小型猪种 更是适合医学实验研究和人类异种移植的首选供 体，我国已经启动和开展了小型猪资源开发利用、异 种移植的基础研究等项目。本文仅就我们近年来有 关P E R V 的研究情况做简要总结，供参考。 2 1 中国特有小型猪内源性反转录病毒存在状况
27、的调查 在全国范围内首次大规模开展了我国小型猪中 内源性反转录病毒存在状况的调查，系统检测分析 P E R V 在我国小型猪中存在与表达情况。 以4 株猪源细胞为模型，建立了检测P E R V 整 合存在和分型检测的P C R 技术以及P E R V 表达的 R T - P C R 技术，并对其特异性、敏感性等进行了研 究副。采集了6 个省市1 0 个单位、5 个品种、1 7 个 猪群3 4 8 份外周血样品，根据通用的e n v 基因分型 方法，用P C R 和R T P C R 方法检测P E R Ve w A 、e n d 万方数据 4 6 6中国实验动物学报2 0 0 8 年1 2 月
28、第1 6 卷第6 期A e t aL a bA n i mS e iS i n ，D e c e m b e r ，2 0 0 8 。V 0 1 1 6 ，N o 6 B 、e n f ) C 在版纳小型猪、五指山猪、巴马小型猪、贵 州小型猪、中国实验小型猪等我国主要小型猪基因 组中的存在与表达情况引。 结果发现：从病毒存在的情况看，我国小型猪 基因组中普遍存在P E R V ，其阳性率达1 0 0 。P E R V 的存在以B 亚型最高( 9 5 4 0 ) ，其次为A 亚型 ( 7 4 4 3 ) 、C 亚型( 3 0 4 6 ) ；从病毒的表达情况看， 五指山猪、巴马小型猪中P E R
29、V A 亚型的表达率高 于B 亚型，但所有的样品均未检测到P E R V C 型的 表达。从病毒主要结构蛋白的存在与表达情况看， 小型猪基因组中不仅存在P E R Vg a g 、p o l 、e n , v 特异 性D N A ，而且都能够转录为R N A 。 上述结果说明，我国小型猪外周血淋巴细胞基 因组中存在P E R V T l 亚群的A 、B 、C 三种亚型，但仅 有A 、B 两种亚型能够表达。P E R V A 、B 、C3 种亚型 的同时存在，预示着小型猪群中存在着不同亚型病 毒重组的可能性。 2 2 小型猪内源性反转录病毒感染H E K 2 9 3 细胞 的研究 通过脂质体转染
30、的方法，将含有n e o 基因的质 粒p l R E S n e o 导人H E K 2 9 3 细胞中，利用C , 4 1 8 的选择 特性，对转染细胞进行压力筛选，并对其进行了P C R 鉴定，培育得到G 4 1 8 抗性H E K 2 9 3 细胞 ( G 4 1 8 R 2 9 3 ) 啪 。 将五指山猪( W Z S ) 、中国实验小型猪( Z G S Y ) 、 巴马香猪( B M X Z ) 、巴马小型猪( B M ) 及贵州香猪 ( G Z ) 外周血淋巴细胞分别与C A l 8 “2 9 3 细胞共培养， 通过G 4 1 8 加压筛选，除去共培养体系中的猪外周血 淋巴细胞，然
31、后应用P C R 及R T P C R 的方法对所制 备的感染细胞模型进行系统鉴定怛。 通过上述方法已成功建立了来自五指山猪、中 国实验小型猪、巴马香猪、巴马小型猪及贵州香猪外 周血淋巴细胞的猪内源性反转录病毒感染H E K 2 9 3 细胞的模型，证实了猪外周血淋巴细胞来源的 P E R V 在体外也能够感染人源细胞系。 以上实验结果，为研究P E R V 的生物学特性及 病原安全性的评价搭建了技术平台，正在尝试应用 上述反转录病毒细胞感染模型进行抗反转录病毒的 药物筛选。 2 3 猪内源性反转录病毒g a g 、e n v 基因的克隆、表 达及抗体的制备 分别设计合成了用于扩增P E R
32、Vg a g 基因和 e l W 基因的引物，成功地克隆并鉴定了中国小型猪来 源的P E R Vg a g 、e n v 全基因。 P E R V 的g a g 基因片段包含一个完整的开放读 码框架，由15 7 5b p 组成，编码5 2 4 个氨基酸。来源 中国实验小型猪的P E R Vg a g 基因序列与其他来源 的同源序列相比较，有三个核苷酸存在变异，其中一 个是位于N 端第1 0 5 4 位的C T 的变异，另一个是 位于N 端第1 1 8 0 位的A G 的变异，最后一个是位 于N 端第1 5 6 0 位的A C 的变异。最终导致G a g 蛋 白的一级结构发生变异。 P E R
33、V 的e i v 基因含有一个完整的O R F ，大小为 1 9 8 3b p ，编码6 6 0 个氨基酸，分型结果表明该克隆基 因为P E R V A 型。序列同源性分析显示，该e r t v 基 因与法系大白猪来源的P E R V A 1 型囊膜基因同源 性为9 7 ，与欧洲小型猪来源的P E R V 囊膜基因同 源性为8 2 。该e 聊基因序列已提交G e n B a n k 注 册，序列号为：A F 5 0 7 9 4 0 。 分别实现了两个基因在大肠杆菌中的表达及初 步纯化，并免疫接种家兔，制备了相应的多克隆抗 体；构建了相应的真核表达载体，采用基因免疫的方 法接种B a l b C
34、 小鼠，筛选获得了特异性的单克隆抗 体杂交瘤细胞株并对单抗进行了系统鉴定。 以上研究，为建立P E R V 的免疫学检测方法奠 定基础，猪内源性反转录病毒的囊膜区在毒株的分 型及病原性上具有一定的意义。 2 4 猪内源性反转录病毒全序列测定与功能分析 利用P C R 及R A C E 技术完成了五指山猪、巴马 小型猪及来源于H E K 2 9 3 细胞感染模型的P E R V 的 全基因组序列测定，3 个毒株的大小分别为8 6 3 9b p 、 8 5 9 5b p 、8 6 8 9b p 。分型检测均为P E R V A 亚型病毒。 通过序列比较及生物信息学分析发现来源于五 指山猪的P E
35、R V ( P E R V W Z S ) 的5 U T R 区中启动子 及增强子的位置分别位于一6 7 一+ 1 及一9 7 一一5 9 之间陋】。E n v 蛋白中有1 8 个可能的抗原表位区，7 个可能的糖基化位点。来源于H E K 2 9 3 细胞的嗜人 2 9 3 一P E R V W Z S 株与亲本病毒P E R V W Z S 同源性为 9 4 6 ，差别主要在5 U T R 及g a g 基因。来源于巴 马小型猪的P E R V ( P E R V B M 株) 的5 U T R 结构与 P E R V W Z S 株明显不同，可能是进化年代相对短的 毒株。 采用D N A
36、s t a r 软件M e g A l i g n 模块C l u s t a l 法构建 进化树，了解来源于我国特有小型猪的P E R V 与世 界不同地区小型猪的P E R V 的进化关系，如图2 。从 进化树分析的结果来看，国内三种小型猪的P E R V 万方数据 中国实验动物学报2 0 0 8 年1 2 月第1 6 卷第6 期A c mL a bA n i t aS e iS i n ，D e c e m b e r ，2 0 0 8 。V 0 1 1 6 。N o 6 4 6 7 e n v 基因的进化与A 、B 、C 三个亚型有关，与宿主、分 布地域关系不大，且P E R V A
37、亚型与C 亚型的亲源 关系更近于B 亚型。 以上研究结果，为开展P E R V 的相关分子生物 学研究、感染性病毒克隆与载体构建奠定了基础。 4 4 1 1 _ - T T r 广1 T r 1 1 4 03 53 02 52 01 5l O50 l F 0 3 日5 0 1a n V 日E a F 13 3 日 7 日n y 日E a i y 0 9 9 3 2 3 m n Y 日E Q D e h 。、 厦皇盆E 0 J 2 9 3 8 5 B e M v 盒E Q p o n 卜删S E 口 日亭r 巾日m8 E Q A F 0 3 8 5 B g g n y 日E Q F 0 3 白B
38、 1 ：1 0 e n v g E o 5 e o ，5 甘n va E a ，7 D 1 3 i 9 n v S E 口 y 0 9 9 3 2 4 a n y 日E a j 一2 口3 8 5 7 口n Y 盆E D M 1 目2 4 7 e n vg E o J 0 1g 马日o r i v 弓E o N C 0 口1 日日5 e n vS E 口 A F 0 5 2 1 2 8 a n y 日E a l 3 1 5 B r t J 宕E 口 D 1 口0 3 2 e n vg E 口 1 口8 ，5 日n Y 日E 口 图2 中国特有小型猪来源的P E R V e n v 基因的系统进
39、化树 F i g 2 P h y l o g e n e t i ct r e eb a s e do nn u c l e o f i d es e q u e n c e so fe n vo fP E R V f r o mC h i n e s em i n i a t u r ep i g s 2 5 猪内源性反转录病毒5 非编码区启动子活性 的分析 根据对57 U T R 区的分析结果，对5 U T R 的不同 功能区进行缺失，构建了含荧光素酶报告基因的系 列5 u 1 R 缺失的载体( 图3 ) ，通过C O S 一7 细胞系来 鉴定5 U T R 的启动子活性部位，萤光素酶报告
40、基因 检测结果表明：缺失R 区的5 U T R 显示出很强的启 动子活性，U 3 重复区序列缺失的57 U T R 启动子活性 显著下降。U T R 显示出较之L T R 强的启动子活性。 缺失整个u 3 区的U T R 比仅缺失U 3 重复区的U T R 启动子活性强( 图4 ) 。 U 31 8 b p3 7 b pRU 5P B S蛐 U T R - I $ 2 l 碲 U 3l B b p3 7 呻U 5P B S L e 。d e r 二二二= = = = K 二D U T 赢- R 2 lb p U 3RU SP B SL e a d e r 二二二= 二= = 卫U T R -
41、U RU S 嗍L e a d e r U T I t 4 图32 9 3 W Z S P - P E R V5 U T R 的组织结构及在萤光素酶检测实验中所构建的U r R 各功能区缺失示意图 F i g 3O r g a n i z a f i o n sa n ds t r u c t u r e so ft h e2 9 3 一W Z S - P E R VU T Ra n dt h ev a r i a n t s w i t h a r t i f i c i a ld e l e t i o n su s e df o rd u a l l u c i f e r a s er
42、 e p o r t e ra s s a y 通过本实验，我们认为转录调控元件不仅存在 于U 3 、R 区，也存在于前导序列中，通过对P E R V5 U T R 转录因子结合位点的分析，我们发现存在于前 导序列中的一些转录因子结合位点，例如：N F k a p p a B 、I R F 与这种积极的影响有关。对于这些假定 的转录因子的结合位点，有待于进一步的突变或缺 失这些位点的序列才能得到验证渤1 。 2 6P E R V 前病毒全长克隆的构建与嗜人性P E R V 感染性和嗜性区域研究 依据G e n B a n k 中P K l 5 P E R V A ( 5 8 ) ( A J 2
43、 9 3 6 5 6 ) 序列和我们的研究结果，设计合成了2 对重叠引物 分别用于扩增5 h a l f 、3 h a l f 两个片段，引物重叠处均 包含唯一的N h e I 酶切位点( 位于4 9 6 8b p 处) 。应用 P C R 技术从五指山猪基因组D N A ( g D N A ) 中扩增出 万方数据 4 6 8中国实验动物学报2 0 0 8 年1 2 月第1 6 卷第6 期A c t aL a bA n i mS C iS i n 。D e c e m b e r ，2 0 0 8 ，V 0 1 1 6 。N o 6 U T R - 3U T R 4 U T R - 1 5 U
44、 T R - RU T R - U p G L 3 S a m p l e U T R 3 ：p G L 3 E n h a n c e r - 5 L T R ；U T R - 4 ：p G l 3 一E n h a n c e r - 缺u 3 区 的5 U T R ；U T R 1 5 ：p G L 3 E n h a n c e r - 完整5 U T R ；u T R - R ：p G l 3 E n h a n c e r - 缺失R 区的5 U T R ；U T R U ：P G l 3 E n h a n c e r - 缺失u 3 区重复盒的5 U T R 图4 转染c 0
45、8 - 7 细胞后系列2 9 3 - W Z S - P E R VU T R s 在萤光素酶表达载体p G L 3 e n h a n c e r 中的活性比较 ( p R L - C M V 为内置转染效率对照) U T R - 3 ：p G l 3 一e n h a n c e r 5 L T R ；U T R - 4 ：p G l 3 一e n h a n c e r - 5 U T R l a c k i n gU 3r e g i o n ；U T R 一1 5 ：p G l 3 - e n h a n c e r - e n t i r e5 U T R ；U T R R ： p
46、 G L 3 - e n h a n c e r - 5 U T Rl a c k i n gRr e g i o n ；U T R - U ：p G L 3 一e n h a n c e r - 5 U T R1 8 c k i l l gt h eU 3r e p o _ M t t 8 F i g 4 A c t i v i t i e so f2 9 3 W Z S - P E R VU T R sc l o n e d l u c f f e r a s er e p o r t e rg e n ev e c t o rp G L 3 - e n h a n c e ri nr e
47、 l a t i o nt o i n t e r n a lc o n t r o lP R L 广C M Vi nC o 7c e H s 其5 h a l f 、3 h a l f 两个片段，将2 个重叠片段通过中间 载体p G E M T ，依次连接并克隆到低拷贝质粒载体 p W S K 2 9 ，获得了五指山猪P E R V 前病毒全长克隆。 用同样的方法得到嗜人性P E R V 前病毒全长克隆 后，则可运用生物信息学方法分析影响嗜人性 P E R V 感染性和嗜性的区域。此外，将进一步运用 P E R V 前病毒全长克隆来构建P E R V 感染性分子克 隆，深入研究P E R V
48、 感染与整合机理等。 2 7 新型猪内源性反转录载体的构建 由于P E R V 是以前病毒的形式存在于猪细胞基 因组中的，根据基因同源重组的原理，在P E R V 清晰 的分子生物学背景的基础上，用其构建新型的反转 录病毒载体，对于转基因猪及P E R V 生物学特性的 研究具有重要的意义。 以W Z S P E R V 基因组全序列为基础，缺失其全 部编码序列，用W Z S P E R V 的5 L T R 与3 L T R 及 W Z S P E R V 的5 U T R 加上g a g 基因的一部分( 以利于 增加病毒滴度，并将起始密码子A T G 突变成T A G 以 降低组装形成野病毒的机率) 与37 L T R 分别替换小 鼠干细胞病毒( M S C V ) 载体的相应区域，构建出新型 的猪内源性反转录病毒载体，将其命名为P M 1 和 P M 2 。目前正在对此载体携带外源基因的能力及 表达水平进行评价。 3结语 我们对我国小型猪中P E R V 的携带、表达情况 以及分子生物学特性进行了相关研究，并通过对 P E R V 全基因克隆，尝试建立P E R V 感染性克隆，定 位影响嗜人性P E R V 感染性和嗜性的区域，这对于 阐明嗜人性P E R V 的生物学特性，评价其在猪一