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1、文章编号： 1 0 0 2 - 2 6 9 4 （2 0 0 5） 0 5 - 0 4 1 0 - 0 4 弓形虫S A G 1单基因疫苗与S A G 1 - R O P 2复合基因 疫苗的免疫效果观察* 杨婷婷， 何深一*， 张加勤， 周怀瑜， 丛华， 古钦民， 李瑛， 赵群力 摘要： 目的构建弓形虫主要表面抗原S A G 1单价基因疫苗及其与棒状体蛋白R O P 2的复合基因疫苗， 接种B A L B c 小鼠， 观察疫苗的免疫保护性。方法构建重组质粒p c D N A 3 . 1 - S A G 1及p c D N A 3 . 1 - S A G 1 - R O P 2。将两核酸疫苗分别
2、免疫小 鼠，E L I S A法检测血清I g G抗体、 I F N - 、I L - 4； 流式细胞仪测定T细胞亚群； 弓形虫速殖子腹腔攻击感染观察小鼠生存时间。 结果获得p c D N A 3 . 1 - S A G 1、 p c D N A 3 . 1 - S A G 1 - R O P 2重组质粒；p c D N A 3 . 1 - S A G 1 - R O P 2组小鼠I g G抗体 （P 0 . 0 5）（图3） 。 2 . 4 血清细胞因子测定按试剂盒提供的I F N - 标准品所测O D值绘制标准曲线， 将所测得的小鼠 血清O D值换算成I F N - 浓度 （p gm l）
3、 ， 结果显示 p c D N A 3 . 1组、p c D N A 3 . 1 - S A G 1组、p c D N A 3 . 1 - S A G 1 - R O P 2组均能诱导T细胞分泌I F N - ， 与同期 P B S组相比均有统计学意义 （P 0 . 0 5）（图4） 。 图4小鼠接受感染后生存曲线 F i g . 4 S u r v i v a l c u r v e so fB A L BcL i c ec h a l l e n g e dw i t h1 0 5 t a c h y z o i t e f o r L s o fR HT.g o n d i is t r
4、 a i n 4w e e k s a f t e r t h e t h i r d i n j e c t i o n 3 讨论 研究表明针对生活史某阶段的单价基因疫苗往 往不能提供对其他阶段弓形虫感染的保护性。虽然 S A G 1抗原具有较强的免疫原性和免疫保护性， 可 刺激机体产生I g G、 I g M、I g A抗体以及细胞因子 I F N - 6 等杀死虫体， 但弓形虫S A G 1蛋白是速殖子 期特异性蛋白， 动物实验表明S A G 1单价基因疫苗 只能使实验动物产生部分保护性 2 。R O P 2在弓形 虫生活史的三个阶段均有表达， 具有高度的保守性 和免疫原性， 但是， 含
5、R O P 2编码片断的D N A疫苗 却未能在敏感小鼠诱导出保护性 7 - 8 ； 另一研究 9 表明， 低剂量 （2 5 g 鼠） 的S A G 1与R O P 2混合基因 疫苗即能使小鼠抵御R H株弓形虫致死性攻击感 染， 而S A G 1或R O P 2单 基 因 低 （2 5 g 鼠） 、 高 （5 0 g 鼠） 剂量组小鼠均在8天内死亡， 表明S A G 1 与R O P 2基因联用确能增强D N A疫苗的免疫效果。 本实验首次将S A G 1与R O P 2基因顺序连接于 p c D N A 3 . 1真核表达载体上构建了弓形虫复合基因 疫苗， 并通过动物实验验证了该疫苗较之S
6、A G 1单 基因疫苗的免疫效果。弓形虫感染免疫中C D 8 +T 细胞的细胞毒作用以及T h l型细胞因子I F N - 的作 用占重要地位。后者可以活化巨噬细胞产生T N F - ， 诱生N O效应并消耗速殖子赖以存活的细胞内色 氨酸而杀灭速殖子。而D N A免疫的一个主要优势 即在于可通过胞内合成抗原经MH C - I类途径提呈 激活C D+ 8T细胞， 并且质粒D N A中的C p G基序可 引发T h l型的细胞免疫应答， 产生包括I F N - 、 I L - 1 2在内的多种促炎因子。 我们的试验结果显示S A G 1及S A G 1 - R O P 2免 疫能诱导分泌高水平的I
7、 F N - 以及特异性I g G， 而 T h 2型细胞因子I L - 4则未检测到， 这与其它几项研 究的结果相符 7 - 9 ； 空质粒免疫也可诱生I F N - ； 同 时， 免疫组动物C D+ 4C D + 8 比值降低。证明接种 S A G 1或S A G 1 - R O P 2基因疫苗可以模拟弓形虫感 染， 激活机体C D+ 8T细胞以及T h 1型细胞免疫； 分 泌的特异性抗虫抗体也能发挥抗感染免疫作用。复 合基因免疫组的各项指标均优于单基因免疫组。本 实验接受攻击的小鼠均未能存活， 可能与鼠系以及 载体的选择有关 2 ， 同时， 实验攻击量 （1 0 5 鼠） 远远 高于自然
8、感染量， 因此有必要在今后的研究中优化 选择实验条件， 进行更多的接种及感染攻击的重复 实验， 进一步观察该复合基因疫苗抗弓形虫感染的 保护作用； 下一步工作还需明确自然或实验感染弓 形虫后机体具体的防御及免疫应答机制， 针对性采 用合理策略增强D N A疫苗的免疫效果， 用以研制 适合人类的安全高效的弓形虫疫苗。 参考文献： 1W o n gS Y，R e m i n g t o nJ S .T o x o p l a s m o s i si np r e g n a n c yJ.C l i n I n f e c tD i s，1 9 9 4，1 8 （6） ：8 5 3 - 8 6
9、2 . 2A n g u sCW，K l i v i n g t o n - E v a n sD，D u b e yJ P，e ta l . I m m u n i z a t i o n w i t haD N Ap l a s m i de n c o d i n g t h eS A G 1（S A G 1）p r o t e i no fT o x o - p l a s m ag o n d i ii s i m m u n o g e n i ca n dp r o t e c t i v e i nr o d e n t sJ. I n f e c t D i s，2 0 0
10、0，1 8 1：3 1 7 - 3 2 4 . 3 S a a v e d r aR，B e c e r r i lMA，D u b e a u xC，e t a l . E p i t o p e s r e c o g n i z e d b y h u m a nTl y m p h o c y t e s i nt h eR O P 2p r o t e i na n t i g e no fT o x o p l a s m a g o n d i i J. I n f e c t I m m u n，1 9 9 6，6 4：3 8 5 8 - 3 8 6 2 . 4 B e c k
11、 e r sC J，D u b r e m e t z J F，M e r c e r e a uP O，e t a l . T h eT o x o p l a s m a g o n d i i r h o p t r y p r o t e i nR O P 2 i s i n s e r t e d i n t o t h e p a r a s i t o p h o r o u s v a c - u o l em e m b r a n e s u r r o u n d i n gt h e i n t r a c e l l u l a rp a r a s i t ea n
12、 d i se x p o s e d t o t h e h o s t c e l l c y t o p l a s mJ. C e l l B i o l，1 9 9 4，1 2 7 （4） ：9 4 7 - 9 6 1 . 5 卢圣栋.现代分子生物学实验技术 M.北京：中国协和医科大 学出版社，1 9 9 9 . 1 1 5 - 1 1 6 . 6 G a z z i n e l l iR T，W y s o c k aM，H a y a s h i S，e t a l . P a r a s i t e - i n d u c e dI L - 1 2s t i m u l a t
13、 e s e a r l y I F N - s y n t h e s i s a n d r e s i s t a n c e d u r i n g a c u t e i n - f e c t i o nw i t hT. g o n d i i J. I m m u n o l，1 9 9 4，1 5 3： 2 5 3 3 - 2 5 4 3 . 7 L e y v aR，H e r i o nP，S a a v e d r aR，e t a l . G e n e t i c i m m u n i z a t i o nw i t h p l a s m i dD N Ac
14、o d i n g f o r t h eR O P 2p r o t e i no fT.g o n d i i J. P a r a - s i t o lR e s，2 0 0 1，8 7：7 0 - 7 9 . 8 V e r c a m m e nM，S c o r z aT，H e e y g e nK，e t a l . D N Av a c c i n a t i o nw i t h g e n e s e n c o d i n gT.g o n d i ia n t i g e n sG R A 1，G R A 7a n dR O P 2i n - d u c e s p
15、 a r t i a l l yp r o t e c t i v e i m m u n i t ya g a i n s t l e t h a l c h a l l e n g e i nm i c e J. I n f e c t I m m u n，2 0 0 0， 6 8：3 8 - 4 5 . 9A l b e r t oF，A l e x a n d r oR，S e r g i oO，e ta l .P r o t e c t i v ee f f e c to fa n a k e dD N Av a c c i n e c o c k t a i l a g a i n s t l e t h a l t o x o p l a s m o s i s i nm i c e J. V a c c i n e，2 0 0 3，2 1：1 3 2 7 - 1 3 3 5 . 收稿日期： 2 0 0 4 - 1 1 - 1 2 314 2 0 0 5，2 1（5） 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s