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1、堑堕匡堂堕堂堡! 壁壁璺圭蔓塑堂蔓垒塑垒! 堡垒! 竺生! 竺! 竺丝! 生型! 竺! 竺竺曼型! 竺壁璺：竺! 塑：型竺垒 微囊化兔坐骨神经组织细胞移植对 大鼠损伤脊髓后I K B 仅表达的影响及意义 王小莲8 ，刘德明6 ( 南昌大学a 研究生院医学部2 0 0 6 级；b 医学院人体解剖学教研室，南昌3 3 0 0 0 6 ) 1 摘要：目的探讨微囊化兔坐骨神经组织细胞移植于大鼠损伤脊髓后对其I x 的表达及活性的影响。方法 家 兔l o 只用于制备兔坐骨神经组织的胞悬液。成年S D 大鼠1 2 0 只随机分为4 组：微囊组( 微囊化兔坐骨神经组织 细胞移植组，刀一3 6 ) 、细胞组(
2、 坐骨神经组织细胞移植组，疗一3 6 ) 、单损组( 单纯损伤组，以一3 6 ) 、假手术组( 柙= 1 2 ) 。 微囊组、细胞组和单损组大鼠在脊髓半横断伤后，立即于损伤处分别植入明胶海绵吸附的1 0 弘L 微囊化坐骨神经 组织细胞、明胶海绵吸附的1 0 弘L 坐骨神经组织细胞以及明胶海绵吸附的1 0p L 生理盐水。分别于术后6h 、1 2h 、 2 4h 、3 d 、7d 、1 4d ( 每个时相取6 只大鼠) 取出损伤部位脊髓标本，假手术组( 每个时相取2 只大鼠) 则取相应节段 脊髓。石蜡包埋后切片，行免疫组织化学染色观I K B a 的表达变化。结果I K 阳性细胞主要见于神经元细
3、胞及 胶质细胞的胞浆内。大鼠脊髓损伤后上述细胞I K B a 表达降低，2 4h 降到最低点，3d 后表达开始回升，7d 逐步恢 复正常水平。微囊组与单损组、细胞组比较差异有显著性( P 9 5 。 2 3 坐骨神经组织细胞的微囊化 将制备好的坐骨神经组织细胞分为2 份，1 份 保存于4 中待移植，另1 份与1 5 海藻酸钠溶 液( 过滤除菌) 混合，经自制双腔喷头喷入 2 0m m o l L 的氯化钡溶液( 过滤除菌) 中，4 保存 待移植。 2 4 建立大鼠脊髓半横断伤模型 按胥少汀等L 3 1 的背部造模法完成脊髓左半切模 型。假手术组仅在相应部位打开椎管暴露脊髓，但 不损伤直接缝合切
4、口。伤处填充移植物后逐层缝合 切口。 2 5 神经组织细胞移植 S D 大鼠在脊髓半横断伤后，微囊组、细胞组、单 损组立即于损伤处分别植入明胶海绵吸附的1 0 “L 微囊化坐骨神经组织细胞、1 0 “L 坐骨神经组织细 胞、1 0 肚L 生理盐水。移植前后均不使用免疫抑制 剂。 2 6 病理学检查 各组动物分别于术后6h 、1 2h 、2 4h 、3d 、7d 、 1 4d ( 每个时相假手术组取2 只、其他组则取6 只) 在麻醉下剖胸，心脏插管，先灌注生理盐水，再用 4 多聚甲醛左心插管灌注固定，剥除脊髓被膜。取 万方数据 塑亘匿学院学报2 0 0 8 年第4 8 卷第! 塑9 c 绰A c
5、 n d P m f 口PM P 出c 抽口P ，i g “2 0 0 8 ，V o I4 8 ，N o6 3 出以损伤平面为中心的脊髓组织( 包括损伤头、尾侧 各约4m m 脊髓) ，假手术组大鼠则灌注后即刻取 相应部位脊髓。常规石蜡包埋，连续切片，切片厚度 4 肚m ，所有部位切片均进行H E 染色。 2 7 免疫组织化学染色 染色按S P 染色试剂盒说明操作，一抗的工作 浓度为1 ：3 0 0 ，最后用二氨基联苯胺( D A B ) 显色， 苏木精复染，封片。以P B S 代替一抗作阴性对照， 阳性细胞胞浆棕黄色染色。 2 8 主要观察指标 每张I K B a 染色的切片随机选取5 个脊
6、髓灰质 视野，通过目镜方格测试系统，在光镜( 4 0 0 ) 下分 别测量I K B a 阳性神经元胞体的测试点数、交点数和 截面数，根据体视学方法得出三维结构参数：体积 密度、数密度和表面积密度。 2 9 统计学分析 用S P S S1 1 5 f o rw i n d o w s 统计软件对I J c B a 染 色结果行非参数K r u s k a l w a l l i s 检验；体视学结果 采用其特有公式进行检验。以P o 0 5 ) 。各组体视学参数见表1 3 。 A ：微囊组；B ：细胞组；C ：单损组；D ：假手术组 图2 脊髓损伤后2 4hk 的表达( 免疫组织化学染色) 万
7、方数据 4 江西医学院学报2 0 0 8 年第4 8 卷第6 期A c 地A c n d e m f 口PM e d f c i 舢P ，f 口n g 耐2 0 0 8 ，v o I4 8 ，N o6 表1 脊雕损伤后3 组各时相点I K B a 阳性细胞的体积密度( i 士s ，1 0 。) 4 讨论 脊髓是中枢神经系统易受损部位，因受伤造成 的劳动力丧失、生活不能自理、并发症等严重问题日 益困扰着整个社会。脊髓损伤的病理生理过程分为 两个阶段，首先是原发性损伤，然后是由原发性损伤 引发的继发性损伤。原发性损伤被认为是不可逆转 的，但其后的继发性损伤却是可逆转的。在去除原 发致伤因素的同时，
8、有效地控制脊髓损伤后早期炎 症免疫反应，尽可能使继发性损伤的程度降到最低、 最小，是保存脊髓功能、改善预后的关键【4 。 转录因子N F K B 和I K B a 在脊髓损伤后的细胞 死亡与保护机制中起着重要作用。非激活状态下， N F K B 与I K B a 以无活性的状态结合存在于胞浆中， I K B a 中含有锚蛋白重复区，与抑制N F _ K B 有关， N F K B 的位置由I K B a 控制，它与N F 一出结合并掩 盖细胞核位置肽序列信号，进而阻止细胞核摄取。 脊髓损伤后则引起I K 快速磷酸化、泛素化，暴露 核位置肽序列信号，最终I K B a 被降解，释放游离的 N F
9、 - K B 向细胞核内移位，调节一系列下游靶基因转 录和表达，引起细胞坏死和凋亡，进而决定细胞的存 活与死亡引。 本实验所用的兔坐骨神经组织细胞主要成分是 雪旺细胞。雪旺细胞是周围神经所特有的胶质细 胞，在外周神经再生中的作用已明确，它具有分泌多 种支持促进中枢神经轴突生长因子的功能。目前， 将雪旺细胞或者是富含雪旺细胞的外周神经组织移 植于损伤脊髓处，促进轴突和髓鞘的再生也得到了 广泛的证实痔。微囊技术是将具有生物活性的物 质包裹于一个多聚复合体中。这个多聚复合体是一 个半通透性的膜性结构，它允许双向性的物质交换， 比如营养物质、氧气和代谢产物进行交换，但能有效 阻挡免疫炎性介质和抗体的进
10、入，因此微囊就使得 移植物可以长期发挥效应而不被“攻击”。正是因为 微囊的这种功能，在脊髓损伤的急性炎症反应期它 才可以抑制I K B a 磷酸化降解环节，抑制N F 一c B 的 活化，进而抑制炎症递质的产生和释放，从而有效地 控制炎症，显著降低继发性损伤的程度L B 。而且微 囊还可以使得囊内的雪旺细胞不受体内免疫排斥反 应的影响，长期存活发挥其多种功能。 本实验结果表明，微囊组与其它组比较，脊髓内 的炎症反应、神经细胞坏死及变性均有所改善，恢复 情况较好。作者认为这可能与微囊化坐骨神经组织 细胞在脊髓损伤后改善微环境、抑制炎症后的继发 性损伤以及保护生物膜等作用有关。本实验还发现 脊髓损
11、伤后I K B a 快速磷酸化、泛素化，暴露核位置 肽序列信号，最终I K B a 被降解，所以损伤后I K B a 的 表达逐渐下降，2 4h 达最低点，3d 后开始回升，7d 后基本恢复正常，而微囊组I ，c B a 的表达量明显比其 它组要多，故急性脊髓损伤时，微囊可以抑制I K B a 快速磷酸化降解，对于抑制急性脊髓损伤后的继发 性损害、减轻N F K B 介导的炎症反应起到有益的作 用。 本研究通过观察脊髓损伤及移植微囊化神经组 织细胞对急性脊髓损伤后继发性损伤的影响，探讨 了微囊化神经组织细胞对脊髓损伤的保护作用机 理，有望为临床治疗脊髓继发性损伤提供进一步的 理论依据及新的思路
12、和途径。 参考文献： 1 丛斌，凌亦凌，谷振勇等八肽胆囊收缩紊对脂多糖诱导大鼠 肺组织N F _ x B 活性增高的抑制作用 J 中国病理生理杂志， 2 0 0 0 。1 6 ( 1 0 ) ：9 9 1 ( 下转第7 页) 万方数据 扛西医学院学报2 0 0 8 年第4 8 卷第6 期 A c f nA c n d P m f q PM P d l c 伽口PJ f 口n g “2 0 0 8 ，V o I4 8 ，N o67 内皮细胞胞膜呈棕褐色，平滑肌细胞胞浆内有棕黄 色颗粒( 封三图3 D ) ；第2 周管腔收缩，内皮细胞与 平滑肌细胞生长良好( 封三图3 E ) ；第3 周P L G
13、 A 材料大部分被吸收，只剩下少量材料和大量纤维组 织( 封三图3 F ) 。 3 讨论 目前，血管组织工程的热点主要是制备管径 6m m 的小血管。以往小血管移植失败的主要原因 是在急性期血栓形成，在慢性期主要为移植物管腔 内膜增生和吻合处的血管瘤形成导致管腔堵塞。经 过长期的探索，研究人员认识到内皮细胞是保持血 管稳定性的天然调节物。在血管损伤后，血管内皮 细胞单层具有抗血栓和抑制血管平滑肌增生的作 用；并有研究表明，内皮细胞有提高血管通畅率的作 用 7 。因此，内皮细胞是血管组织工程中最重要的 种子细胞之一。1 9 7 8 年H e r r i n gM 等 7 3 首先报道 使用内皮细
14、胞种植技术，对人工血管内皮化指明了 生物人工生物聚合小口径血管的研究方向。 血管组织工程最常使用的种子细胞是内皮细 胞，是自体的浅表静脉内皮细胞；人脐静脉内皮细胞 也是人工血管内皮化的种子细胞来源，但是数量有 限，不能满足未来大规模的构建人工组织工程小血 管的需求。而在胚胎发育的早期动物囊胚中存在一 群尚未分化的原始细胞，称为内细胞团；这些细胞 经体外培养就成为胚胎干细胞( E S ) 8 。有研究表 明，E s 细胞长期培养传代而无明确的限制 ，一直 保持全能性达2 5 0 代以上，证明E S 细胞有无限增 殖能力，可作为种子细胞来源，不仅能够满足数量上 的需求，而且经过人工诱导后能够分化为
15、组织工程 所需要的特定细胞L 9 。本实验所用的支架材料的主 要成分是P L G A ，其降解产物为B 。羟基丁酸，为人 体血液内的成分，不会引起生理反应，最终经酮酵解 为C 0 。和H 。0 ，因其为微生物发酵产生，所以不同 于其他高分子化合物，优点是生物相容性良好、降解 速度可调、降解产物易于代谢和排除以及材料易于 消毒等。 本实验利用胚胎干细胞定向诱导出的内皮细 胞、平滑肌细胞与P L G A 成功构建出生物相容性良 好的组织工程小口径血管。通过该实验可使血管组 织工程种子细胞的来源更为广泛，但是构建出的组 织工程血管是否具有血管生物活性、对温度、血流变 化是否有相应舒缩反应、是否具有合
16、适的机械性能、 能否拥有近似于生理状态的顺应性( 维持移植物长 期经受住血流动力形成的压力) 、并且不容易发生移 位( 避免吻合口处形成血管翳) 及胚胎干细胞的安全 性等还有待进一步研究。 参考文献： 1 F e r r i sA ，R o b e r t s o nRM ，F a b u n m iR ，e ta 1 A m e r i c a nH e a r t A s s o c i a t i o na n dA m e “c a nS t r 。k eA s s o c i a t i o nN a t i o n a lS u r v e y o fs t r o k eR i
17、s kA w a r e n e s sa m o n gw o m e n J c i r c u l a t i o n ， 2 0 0 5 ，1 1 1 ( 1 0 ) ：1 3 2 1 一1 3 2 6 2 c o n t eMs T h eI d e a ls m a l lA r t er i a ls u b s t i t u t e ；As e a r c hf o r t h eH o l y G r a i l ? J F A s E BJ ，1 9 9 8 ，1 2 ( 1 ) ：4 3 4 5 3 c l a y s o nKR ，E d w a r d swH ，A
18、 l l e nTR ，e ta 1 A r mV e i n sf o r P e “p h e r a lA r t e r i a lR e c o n s t r u c t i o n J A r c hs u r g 。1 9 7 6 。1 1 1 ( 1 1 ) ：1 2 7 6 一1 2 8 0 4 w e b bK ，H l a d yV ，T r e s c oPA R e l a t i v el m p o r t a n c eo fs u r f a c e W e t t a b i l i t ya n dC h a r g e dF u n c t i o n
19、 a lG r o u p so nN I H3 T 3F i b r o b l a s tA t t a c h m e n t ， S p r e a d i n g ，a n dC y t o s k e l e t a lO r g a n i z a t i o n J JB i o m e dM a t e rR e s ，1 9 9 8 ，4 l ( 3 ) ：4 2 2 4 3 0 5 熊吉信，刘兆轩，杨春江，等体外定向诱导小鼠胚胎于细胞向 内皮分化的研究 J 中国重建外科杂志，2 0 0 7 ，2 1 ( 9 ) ：9 9 4 9 9 8 6 刘兆轩熊吉信，杨春江，等小鼠胚
20、胎干细胞体外向血管平滑 肌细胞的定向分化 J 中国组织工程研究与临床康复，2 0 0 8 ， 1 2 ( 1 2 ) ：2 2 7 2 2 2 7 6 7 H e r r i n gM ，G a r d n e rA ，G 1 0 v e rJ As i n g l e - s t a g e dT e c h n i q u e f o rS e e d i n gV a s c u l a rG r a f t sw i t hA u t o g e n o u sE n d o l t h e l i u m J s u r g e r y ，1 9 7 8 ，8 4 ( 4 ) ：4
21、9 8 5 0 4 8 E v a n sMJ ，K a u f m a nMH E s t a b l i s h m e n ti nc u l t u r eo fP l u r i p o t e n t i a lc e l l sf r o mM o u s eE m b r y o s J N a t u r e ，1 9 8 1 ，2 9 2 ( 5 8 1 9 ) ：1 5 4 一1 5 6 9 曹谊林组织工程学理论与实践 M 上海：上海科学技术出版 社，2 0 0 1 ：5 8 5 9 ( 责任编辑：胡炜华) ( 上接第4 页) 2 1 w a iK ，L e eBR H
22、a s h i g u c h iM ，e ta 1 I K B - a l p h a s p e c i f i cT r a n s c “p tR e g u l a t i o n b yt h ec t e r m i n a le n do fc R e l J F E B S L e t t ，2 0 0 5 ，5 7 9 ( 1 ) ：1 4 1 1 4 4 3 胥少汀，郭世俊脊髓损伤的基础和临床 M 2 版北京：人民 卫生出版社，2 0 0 2 ：6 5 1 6 5 2 4 廖维宏，张光铂进一步加强脊髓损伤修复研究 J 中国脊柱 脊髓杂志，2 0 0 3 ，1 3 ( 9
23、) ：5 17 5 1 9 5 S u nz ，A n d e r s s o nR N F K a p p a BA c t i v a t i 。na n dI n h i b i t i o n ：a R e v i e w J s h o c k ，2 0 0 2 ，1 8 ( 2 ) ：9 9 1 0 6 6 O u d e a g aM 。M o o nLD 。d eA l m e i d aL e m eRJ S c h w a n nc e l l s f o rs p i n a lC 。r dR 印a i r J JM e dB i l lR e s ，2 0 0 5 ，3
24、 8 ：8 2 5 8 3 5 7 刘德明，刘德伍，刘曾旭，等微囊化施万细胞异种移植对大鼠 脊髓损伤修复的影响 J 解剖学报，2 0 0 3 ，3 4 ( 6 ) ：5 7 7 5 7 7 L 8 JQ uJF ，H a oL ，C h e n gTM S t e mC e l l sa n dC u t a e n o u sW o u n d H e a l i n g 口 Jc h i n e s eJ 0 u r n a 】o fC l i n i c a lR e h a b i l i t a t i o n ，2 0 0 1 ， 5 ( 1 2 ) ：7 4 7 5 ( 责任编辑：罗芳) 万方数据