新城疫病毒山东分离株SHD506 F和HN基因序列分析.pdf

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1、动物医学进展。2 0 0 8 ，2 9 ( 8 ) ：5 9 P r o g r e s si nV e t e r i n a r yM e d i c i n e 新城疫病毒山东分离株S h D 一5 一0 6F 和H N 基因序列分析 岳楚昕，莫贞峰1 ，李 颖1 ，刘栋1 ，朱剑英1 ( 1 济南市畜牧办公室，山东济南2 5 0 0 0 2 1 2 山东农业大学动物科技学院山东泰安2 7 1 0 1 8 ) 摘要：从山东济南某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒株( S h n 5 一0 6 ) ，研究其生物学特 性表明，该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。从该分离株扩增出其F 和

2、H N 基因，并与标准株进行同源 性比较，为探讨N D V 是否发生变异提供理论依据。本试验通过R T P C R 法特异性地扩增出F 和H N 基因 全基因序列，并对其与已经发表的序列进行核苷酸序列测定和分析。结果表明，S h 口5 一0 6 株的F 和H N 基 因开放性阅读框架( O R F ) 为16 6 2b p 和17 1 6b p ，分别编码4 8 9 个和5 7 1 个氨基酸。与国外发表的部分新 城瘦病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较，F 基因核苷酸序列的同源性在8 4 1 8 8 7 之间，氨 基酸同源性在8 8 1 9 3 3 之间I H N 基因核苷酸序列的同源性在8

3、 2 1 8 7 4 之间，氨基酸同源性 在8 8 6 9 0 9 之间I F 蛋白裂解位点区( 1 1 2 1 1 7 ) 氨基酸组成与强毒株一致，说明N D V 山东分离株 ( S h D 5 0 6 ) 为新城疫强毒株。 关键词：新城疫病毒；生物学特性；F 基因；H N 基因I 序列分析 中图分类号：S 8 5 2 6 5 9 5文献标识码：A文章编号：l 0 0 7 5 0 3 8 ( 2 0 0 8 ) 0 8 一o 0 0 5 0 5 新城疫( N e w c a s t l ed i s e a s e ，N D ) 是由新城疫病 毒( N e w c a s t l ed i

4、s e a s ev i r u s ，N D V ) 引起的禽的传染 病。N D V 属于副黏病毒科、副黏病毒亚科、腮腺炎 病毒属，该病毒编码的6 种蛋白( 37 一N P P M F H N L 一5 ，n u c l e o p r o t e i n ，p h o s p h o r p r o t e i n ，m a t r i xp r o t e i n ，f u s i o np r o t e i n ， h e m a g g l u t i n i n - n e u r a m i n i d a s e a n d1 a r g ep r o t e i n ) 中

5、，F 和H N 两种糖蛋白与N D V 致病性密切相关。所以，F 和H N 基因的克隆与序 列分析一直是分子生物学研究的热点。 随着免疫水平的提高，我国对鸡新城疫的防控 水平有了很大的提高。但近几年N D 的流行又出现 新的特点，不表现特异性症状的N D 病例日益增多， 甚至高抗体鸡群也发生该病，人们认为这些流行特 点表明很可能是由变异或超强毒株引起。再加上以 往感染N D V 不表现明显临床症状的鹅，近年来出 现了一种类似鸡N D 症状的传染病n 吒 ，分离的鹅源 病毒可诱发鸡出现较典型的N D 症状，且鹅副黏病 毒对鸡具有强致病性，这一变异株的出现更引起人 们对于非典型N D 发病原因的兴

6、趣。本研究在对山 东济南某鸡场不表现典型N D 症状的一株新城疫野 毒株进行生物学特性研究的基础上，扩增出其F 和 H N 基因，并与标准株进行同源性比较，为探讨 N D V 是否发生变异提供理论依据。 1 材料与方法 1 1 病毒株、茼种和克隆栽体 N D V 毒株为山东农业大学动物科技学院实验 室保存，系2 0 0 6 年从山东济南某鸡场不表现典型 N D 症状的高抗体蛋鸡中分离；菌种为大肠埃希菌 D H 5 a ，由山东农业大学动物科技学院实验室保存l P G E M T 载体连接试剂盒购自P r o m e g a 公司。 1 2 主要酶和试剂 各种限制性内切酶、T 4D N A 连接

7、酶、T 口口D N A 聚合酶、禽源反转录酶( A M V ) 、R N A 酶抑制剂、 d N T P 、I P T G 、X g a l 等均购自宝生物工程( 大连) 有 限公司或P r o m e g a 公司，琼脂糖、o RI 、D N A M a r k e r 和2 5 0b pD N AM a r k e rp l u s 购自上海 S a n g o n 生物工程技术服务有限公司，D N A 快速回 收试剂盒和质粒微量快速提取试剂盒均购自宝生物 工程( 大连) 有限公司l 其余试剂均为进口或国产分 析纯试剂。 1 3N D V 的纯化增殖、浓缩及总R N A 的提取 分离毒种经

8、鸡胚成纤维细胞( C E F ) 蚀斑纯化3 代。将纯化后种毒，t1o o o 倍稀释，接种于9 日龄 S P F 鸡胚3 7 宦孵育至9 6h ，收取尿囊液，尿囊液反 收稿日期：2 0 0 8 一0 5 一0 4 基金项目：山东省自然基金项目( Y 2 0 0 7 D 4 7 ) 作者简介：岳楚昕( 1 9 8 0 一) 女山东济南人主要从事善药监督监察工作。- 通讯作者 万方数据 6动物医学进展2 0 0 8 年第2 9 卷第8 期( 总第1 8 0 期) 复冻融3 次，8o o Or m i n 离心4 5m i n 上清于4 以2 70 0 0r m i n 离心2h ，收集沉淀，1

9、：1 0 0 倍P B S 悬浮沉淀。取病毒浓缩液按T r i z o l 试剂说明书操作 提取总R N A 。 1 4N D VF 和H N 基因的R T P C R 扩增及测序 1 4 1 引物的设计与合成根据国外已发表的 N D VF 和H N 基因序列，利用O l i g o5 OD e m e r 软 件自行设计了R T 及P C R 引物序列。该特异性的 R T 引物在N D V 基因组中位于F 和H N 基因前端 的保守区，用于扩增F 和H N 全序列，其序列为5 ，_ A C G G G T A G A A 一3 ；P C R 引物序列F 基因引物： F 1 ：5 一A T G

10、 G G C T C C A A A C C T T C T A ( - 3 ；F 2 ：5 一 T T G T A G T G G C T C T C A T C 一37 ；H N l ：5 一T C C g T T C T A C C A C A T C A C C A 一37 ；H N 2 ：5 一C g T C T T C C C A A C C A T C C T A T 一3 。设计引物由上海S a n g o n 生物工程技术服务有限公司合成。 1 4 2R T - P C R用设计的特异R T 专用引物序 列，按照P r o m e g a 公司禽源反转录酶( A M V )

11、的使用 说明书进行反转录。反应体系为2 0 弘L 。取5 肛L 反 转录产物作模板，加入l O P C Rb u f f e r5 弘L ， 1 0m m o l Ld N T P 混合物3 弘L ，上下游引物各 l 弘L ，T 口qD N A 聚合酶l 弘L ，加d d H 2O 至总体积 5 0 弘L 。瞬时离心混匀后进行P C R 扩增。F 基因 P C R 循环条件为：9 4 3m i n ；9 4 1m i n ，5 4 1m i n ，7 2 2m i n ，3 0 个循环，最后7 2 延伸 1 0m i n ；H N 基因P C R 循环条件为：9 4 3m i n ； 9 4

12、1m i n ，5 2 1m i n ，7 2 2m i n ，3 0 循环；最后 7 2 延伸1 0m i n 。P C R 扩增结束后，取2 0 弘L 反应 液于1 0g L 琼脂糖凝胶上进行电泳分析。 1 5P C R 产物的克隆和转化 用宝生物工程( 大连) 有限公司的D N A 快速回 收试剂盒回收目的条带。参照P G E M T 载体连接 试剂盒建立以下1 0 肛L 总体积连接体系，回收D N A 5 肛L ，P G E M TE a s yv e c t o rl “L ，T 4D N AL i g a s e 1p L ，1 0 L i g a s eb u f f e r5

13、弘L ，无菌d d H 2 02 肛L 。 4 连接过夜。取5 肛L 连接反应物，转化D H 5 a 感 受态细胞，涂布于预先涂好I P T G 、X g a l 的含A M P 的L B 平板上，3 7 温箱中倒置培养过夜。次日挑 取白色菌落，用质粒微量快速提取试剂盒提取质粒 D N A ，经1 0g L 琼脂糖凝胶电泳初步筛选出阳性克 隆。 1 6 阳性克隆的鉴定 1 6 1 重组质粒的P C R 鉴定将初步筛选出的重 组质粒稀释1 0 0 倍，取lp L 作为P C R 模板，反应体 系和循环条件与1 4 2 相同。反应结束后，取2 0 弘L 反应液于l Og L 琼脂糖凝胶上进行电泳分

14、析。 1 6 2 重组质粒的酶切鉴定将重组质粒用o R I 单酶切，同时切空质粒作对照。酶切结束后，取部分 酶切产物于1 0g L 琼脂糖凝胶电泳，以鉴定外源片 断的大小。 1 7 核苷酸全序列的测定及分析 将阳性重组质粒送交上海博亚生物技术公司 ( 即英骏生物技术有限公司) 完成测序。利用D N A S t a r 和D N AM a n 软件进行序列分析。 2 结果 2 1蚀斑纯化 N D V 山东分离株( S h 肛5 一0 6 ) 经C E F 培养后， 显微镜下可见清晰的病毒蚀斑( 图1 ) 。 图1N D V 在鸡胚成纤维细胞上形成的空斑 F i g 1N D V f o m 5b

15、 l a n ks p o t 8 i n C E F 2 2F 基因和H N 基因的R T P C R 扩增结果 以N D V ( S h 肛5 一0 6 ) 病毒基因组R N A 为模板， 特异性R T 引物以及F 和H N 的引物经R T P C R 均扩增出两条约17 0 0b p 左右的特异性条带，这与 预期设计相吻合( 图2 ) 。 1 H N 基因目的条带I2 2 5 0b pD N A 标准1 3 F 基因目的条带 1 H Ng e n ep r o d u c t 3o fP C R - 2 2 5 0b pD N AM a r k e rp l u s l 3 Fg e n

16、 e p r o d u c t so fP C R 图2D N V 山东分离株F 基因和H N 基因R T - P C R 产物 F i g 2 R T P C Rp r o d u c t 3o fFa n dH Ng eo fN D VS h D - 5 0 6 万方数据 岳楚听等：新城疫病毒山东分离株S h 胁5 一0 6F 和H N 基因序列分析 7 2 3 F 和H N 基因的克隆及鉴定 电泳结果显示，重组质粒分子质量( 约47 0 0b p 左右) 明显大于空质粒载体( 约3o o Ob p ) ；以重组质 粒为模板进行P C R ，结果也扩增出约17 0 0b p 左右 的目的

17、片断，初步证明了我们得到了阳性克隆，后将 初步筛选的阳性克隆进行蜃o RI 单酶切，酶切电泳 结果见图3 。 1 F 基因阳性重组质粒1 2 H N 基因阳性重组质粒1 3 F 基因重组质粒 酶切1 4 H N 基因重组质粒酶切5 空质粒载体I6 D N A 标准 1 P t i v er e 矗b i n a n tp I a s m i do fFg e n e 2 P o s t i v er e c o m b i n a n t p l a s m i do fH Ng c n c l3 J 至o RId i g e 6 t i o no fp 0 5 t i v er e m b

18、i n a n t p l a 8 m i do fFg e n e I4 1 士o RId i B e s to fp o s t i v er e c o m b i n a n tp l a 8 m i d o fH Ng e n e 5 V h n tp I a s m 试I6 D N AM a r k e r 图3N D V 山东分离株F 基因和H N 基因阳性质粒的鉴定 F i g 3 l d e n t i f i c a t i o no fp o s i t i v cr e c o m b i n a n tp l a s m i do fFa n dH N g e n e

19、 5o fN D VS h n 5 0 6 以内切酶o RI 进行单酶切重组质粒及空质 粒，由于P G E M TE a s yv e c t o r 的4 9 位上有o RI 位点，而F 基因和H N 基因的开放性阅读框架 ( O R F ) 的l3 1 6 位和16 6 4 位亦含有该酶的惟一酶 切点，故阳性质粒酶切后F 基因应出现约l6 0 0b p 及30 0 0b p 两条带。H N 基因应出现约17 0 0b p 及 3o o ob p 的两条带，而空质粒酶切后仅有约3o o ob p 的一条带( 图3 ) ，电泳显示，酶切结果与预期的一 致，说明F 和H N 基因克隆进入P G

20、E M TE a s y v e c t o r 中。 2 4 F 基因和H N 基因的克隆测序及序列分析比较 挑选出的阳性克隆进行序列测定，经拼接后得 到N D VS h 胁5 一0 6F 基因和H N 基因的O R F 全核 苷酸序列，F 基因O R F 全长16 6 2b p ，编码4 8 9 个氨 基酸；H N 基因O R F 全长17 1 6b p ，编码5 7 1 个氨 基酸。 将N D VS h 胁5 一0 6 与国内外标准强毒株和弱毒 株进行F 基因核苷酸及氨基酸序列同源性比较，F 基因核苷酸序列的同源性在8 4 1 8 8 7 之间， 氨基酸同源性在8 8 1 9 3 3 之

21、间。 将N D VS h 口5 一0 6 与国内外标准强毒株和弱毒 株进行H N 基因核苷酸及氨基酸序列同源性比较， H N 基因核苷酸序列的同源性在8 2 1 8 7 4 之 间，氨基酸同源性在8 8 6 9 0 9 之间。 对D N VS h 肛5 一0 6F 蛋白裂解位点区( 1 1 2 1 1 7 ) 的研究，决定N D V 毒力强弱与F 蛋白裂解位 点区1 1 2 位1 1 7 位氨基酸序列的组成有关 朝，强 毒株区的氨基酸序列为A r g A r g G l n A r g L y S - A r g P h e ；弱毒株区的氨基酸序列为G 1 y - A r g L y S -

22、G l n G I y S e r A r g L e u ；N D VS h 肛5 一0 6 株F 基因在 区氨基酸序列为A r g - A r g G l n A r g A r g _ P h e ( 表1 ) ， 这在分子水平上证明了N D VS h 胁5 一0 6 为N D V 强 毒株。 根据本研究毒株与近期国内外发表的一些有代 表性的参考毒株的F 基因所构建的进化树见图4 。 裹l 本研究中应用的主要毒株的来源_ 及其F 蛋白裂解位点( 1 1 2 1 1 7 ) 的氨基酸组成 T a b l e1 0 r i g i no fN D V3 t m i n 3u s e di n

23、p h y l o g 曲e t i c sa n a I y 8 i 3a n dt h ea m i n oa c 试s e q u e n c e so fc I e a v B g e5 i t er e i o n ( 1 1 2 - 1 1 7 ) o fFp t d n 万方数据 8动物医学进展 2 0 0 8 年第2 9 卷第8 期( 总第1 8 0 期) I5 3 广T _ 1 T 一_ T - T 一- r 1 41 2l O86 42O Z J IS E O Z J l 0 0 G o S E Q J S 5 0 I G o S E O Y N - P A 01 S E

24、O C h9 8 3 S E Q C h9 9 S E O C h2 0 0 0 S E Q Y N - C 2 S E 0 S h D - 5 - 0 6 S E Q Y 9 8 S E O T W 2 0 0 0 S E Q y u n a n S E Q G o o s c d r i v e d S E Q C H - A 79 6 S E Q L Z S E O M K l 3 7 S S E Q T a i w a n 9 5 S E Q G b l l 6 88 4 S E Q P i g c o nA r g c n t i n aT i g r c6 9 9 S E Q P

25、i g e o nA r g e n t i n aC a p i t a l3 9 7 S E Q C h9 8 - I S E Q A F 2 2 4 0 S E O T r c n q u cL a u q u c n S E Q M DS E 0 N D v - J L 2 S E Q H c r t s3 3 S E Q L t a l i c n S E Q F O ( N D F F ) S E Q 8 8 T O O S E O Z J2 0 0 0 S E Q L aS o t a S E O F M l 0 3 S E O P N D V l S E O c l o n c

26、3 0 S E Q D B 5 S E O B I S E O T c x a sG B S E Q D B 3 S E O F 4 8 E 9 S E Q L u o Y S E Q A u s t r a I i a V i c t o r i a S E Q I - 2 S E O I 2p r o g c n i t o r S E Q H e b 0 2 S E 0 3 2 C T 9 8 S E Q I2 6 C O O S E Q 图4N D V 不同毒株F 基因全序列遗传进化树图谮 F i g 4P h y l o g e n e t i ct r e co ft h ec o

27、 m p I e t eFg e n eo fd ；f f e 陀n tN D Vs t r a i n 5 3 讨论同源性在8 8 6 9 0 9 之间。根据H N 的氨基 F 基因和H N 基因是N D V 主要的致病性基因酸同源性，N D V 可分为A 、B 、C3 群，分别含有6 1 6 、 和免疫保护性抗原，本研究成功扩增出了F 基因和5 7 7 、5 7 1 个氨基酸。一般A 群为弱毒，C 群为强毒， H N 基因全部的核苷酸序列通过对F 和H N 基因B 群弱毒株、中毒株、强毒株皆有阻5 1 。本研究中的 的研究，可以区分出N D V 的毒力强弱以及研究分离毒株S h 肛5 一0

28、 6H N 基因O R F 全长17 1 6b p ， N D V 的变异。经测定S h 肛5 一0 6 株的F 和H N 基因H N 基因编码5 7 1 个氨基酸，属于强毒的C 群。特 开放性阅读框( O R F ) 为l6 6 2b p 和17 1 6b p ，分别别是从该病的F 蛋白裂解位点区( 1 1 2 1 1 7 ) 的研究 编码4 8 9 个和5 7 1 个氨基酸。与国外发表的部分新表明，该毒株这一序列符合C o l l i n sM 等报道 6 的常 城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较，F规鸡新城疫强毒的普遍规律，从而从分子水平更加 基因核苷酸序列的同源性在8 4 1

29、8 8 7 之间， 说明N D VS h 胁5 一0 6 为新城疫强毒株，也确定该毒 氨基酸同源性在8 8 1 9 3 3 之间；H N 基因核株不是变异株。对于非典型症状的产生，抗体的压 苷酸序列的同源性在8 2 1 8 7 4 之间，氨基酸力可能是主要原因。并非一定是由毒株 万方数据 岳楚昕等：新城疫病毒山东分离株S h 肛5 一0 6F 和H N 基因序列分析 9 变异引起。 通过对N D V 山东分离株( S h 胁5 一0 6 ) 的F 基因 氨基酸序列的分析，根据N D V 基因分型的方法【7 ， 发现S h D 5 一0 6 株病毒具有型基因型N D V 的典型 特征，在1 0

30、1 位和1 2 1 位分别为K ( 赖氨酸) 、I ( 异 亮氨酸) 两种特征氨基酸，与严维巍等 8 所报道的从 高免的鸡群中分离到的一株鸡副黏病毒的基因型相 同。通过与近期国内外发表睁1 1 的一些有代表性的 参考毒株的F 基因所构建的进化树( 图4 ) 分析可以 看出S h 肛5 一0 6 株与从江苏一带分离所得流行株同 源性较近，据已发表的部分文献 。引，江苏一带分离 的鹅源N D V 病毒也属于型。对于N D VS h 胁5 一 0 6 是否还兼有这些鹅源N D V 分离株的另外一些特 点，这些深层次的研究正在进行中。 参考文献： 1 任涛陈金顶，廖明一株鹅源禽副粘病毒的感染 c 全国

31、 禽病研究进展研讨会论文集广东广州- 中国家禽病理学会， 1 9 9 7 t 2 8 1 2 L i u XF w a nHQ ，N i x X e ta 1 P a t h o t y p i la n dg e n o t y p i c a lc h a r a c t e r i 船t i o no fs t r 8 i n 3o fN e 、c a 3 t I ed i s 曲5 ev i n l si s o l a t e df r o mo u t b r e a k si nc h i c k e n 且n dg o o s en o c k 8i ns o m er e g

32、 i o n s o fC K n a d u n g1 9 8 5 2 0 0 1 J A r c hv j r 0 1 2 0 0 3 ，1 4 8 l1 3 8 7 - 1 4 0 3 3 A l d o u 5Ew A I e x a n d e rDJ D e t e c t i o na n dd i f f e r e n t i t a t i o no f N e w s t l ed i 8 e a s ev i r u s5 t r a i n 5 ( a v i a np a r a m y x o v i r o u st y p eI ) J A y i a nP

33、a t h o J 。2 0 0 l ，3 0 1 1 1 7 1 2 8 4 肖肖，郑增忍，王树双新城疫病毒分子生物学毒力水平研究 进展 刀中国动物检疫，1 9 9 8 ，1 5 ( 1 ) 一4 6 4 9 5 田兴华陈燕军，郝侵宗等新城疫病毒B 5 株H N 基因的克隆 及序列分析 J 中国兽医杂志，2 0 0 3 t3 9 ( 1 0 ) t 7 1 0 6 c o I I i n sMS ，B a s h i r u d d i nJBD e d u c e da m j n oa c i d8 e q u e n c eo f N e w c a s t l ed i s e a

34、s e “r u ss h o w i n gv a r i a t i o ni na n t i g e n i c i t ya n d p a t h o g e n i c i t y J A f c hV i r 0 1 1 9 9 3 ，1 2 8 1 3 6 3 3 7 0 7 Y A N GCY S h iHK 。L i nYL N e w s t l cd i s e a 5 ev i r u si s o l a t e d f r o mr e c e n to u t b r 髓k 8i nT a i w a np h y l o g e n e t i c a j

35、l yr e l B t e dg c n o t y p e f r o mr e c e n to y t b r e a k si nw e s t e f nE u r o p e J A n i a n D i s 乱s c s 1 9 9 9 。4 3t1 2 5 一1 3 0 8 严维巍，王永坤，田慧芳等一株鸡副粘病毒的分子生物学特 性研究口 扬州大学学报t 自然科学版t 2 o ，3 ( 1 ) ，2 7 3 1 9 黄勇，万洪全刘红旗等鹅源新城疫病毒z J l 株全基因组 的序列测定 J 病毒学报，2 0 0 3 1 9 ( 4 ) l3 4 8 - 3 5 4 1 0 刘华

36、雷，王永坤，严维巍，等鹅副粘病毒F 蛋白基因的克隆和 序列分析口 中国预防兽医学报2 0 0 0 ，2 2 ( 6 ) l1 0 4 4 0 7 1 1 沈志强管字刘吉山等株N D V 分离株F 基因的克隆 与序列分析口 动物医学进展，2 0 0 5 。2 6 ( 4 ) 1 7 8 8 3 S e qu e n c ea n dA n a ly s e so nt h eFa n dH NG e n e o fN e w c a s t I ed i s e a s ev i r u sS h D 一5 一0 6I s o I a t e di nS h a n d o n g Y U EC

37、 h u x i n l ，M OZ h e n - f e n 9 1 ，L IY i n 9 1 ，L I UD o n 9 1 ，Z H UJ i a n y i n 9 1 ( 1 0 厂，k f 口，i n 4 疗A 打i ，蝈ZH 口j 6 4 玎d r ，。，i 玎口n ，S 口订d o 力量2 5 0 0 0 Z ( 打4 l 2 c D Z Z f g cD ，A 柏M ZS c i 阴c f & n I f r i 开口_ 胁d i c i 玎f ，S 明d 鲫耳A g c “Z “队f w “ 吣，亿f 4 刀。S 口一d o 行g - 2 7 1 0 1 8 ，c I

38、l i 椰) A b s t r a c t ：As t r a i no fa t y p i c alN e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s ( N D V ) w a si s o l a t e df r o mc h i c k e n sw i t h o u tt y p i c a l s y m p t o mi nJ i n a n T h eFg e n ea n dH Ng e n eo fN D VS h D 5 0 6w e r ec l o n e da n dc o m p a r e dw i t ht h ep u b

39、 l i s h e dv i r u l e n ts t r a i n sa n da v i r u l e n to n e so fN D Vt oi n d i c a t ew h e t h e rb e l o n gt on e wg e n o t y p e F u s i o n ( F ) g e n ea n dh e m a g g l u t i n n i n - n e u r i m i n i d a s e ( H N ) g e n eo fi tw e r ea m p l i f i e db yR T P C R Fg e n ea n d

40、H Ng e n e w e r es e q u e n c e da f t e rt h ep r o d u c t so fa m p l i f i c a t i o nb e i n gc l o n e da n dc o m p a r e dw i t ht h ep u b l i s h e dv i r u l e n t s t r a i n sa n da v i r u l e n to n e so fN D V B a s e do nt h ee x p e r i m e n t s ，t h eFg e n ea n dH Ng e n eo fN

41、 D VS h D 5 一0 6 h a da1 6 6 2 b p 一1 7 1 6 b po p e nr e a d i n gf r a g m e n t ( O R F ) a n de n c o d e d4 8 9a n d5 7 1a m i n oa c i d s C o m p a r e dw i t h t h ep u b l i s h e dv i r u l e n ts t r a i n sa n da V i r u l e n to n e so fN D V ，t h eh o m o l o g yo ft h en u c l e o t i

42、 d eo fFg e n ei s 8 4 1 一8 8 7 a n dt h eh o m o l o g yo ft h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e so fFg e n ei s8 8 1 一9 3 3 It h eh o m o l o g yo ft h en u c l e o t i d eo fH Ng e n ei s8 2 1 一8 7 4 a n dt h eh o m o l o g yo ft h ed e d u c e da m i n o8 c i d ss e q u e n c e so fH

43、 Ng e n ei s8 8 6 一9 0 9 T h ea m i n oa c i ds e q u e n c e so fc l e a v a g es i t er e g e i o n ( 1 1 2 一1 1 7 ) o fF g e n ew e r es i m i l a rt ot h a to fa l lo t h e rv i r u l e n ts t r a i n s T h er e s u l t sa l s os h o w e dt h a tt h eS h a n d o n gi s o l a t e ( S h D 一5 一0 6 ) w a sav i r u l e n ts t r a i no fN D V K e yw o r d s ：N e w c a s t l ed i s e a s eV i r u s ；b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i t i c s ；Fg e n e ；H Ng e n e ；s e q u e n c ea n a l y s i s 万方数据