《快速诊断布鲁氏菌病胶体金免疫层析法的建立.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《快速诊断布鲁氏菌病胶体金免疫层析法的建立.pdf（2页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、1 3 4 4 中国卫生检验杂志2 0 0 8 年7 月第1 8 卷第7 期C h i n e s eJ o u r n a lo fH e a l t hL a b o r a t o r yT e c h n o l o g y ，J u l2 0 0 8 ；V o l1 8 N o7 【微生物检测方法】 快速诊断布鲁氏菌病胶体金免疫层析法的建立 朱明东，杨蓉，洪林娣，钟春梅，赵文宇 ( 浙江省医学科学院，杭州3 1 0 0 1 3 ) 摘要】目的：研发一种布鲁氏菌病快速诊断试剂。方法：应用胶体金免疫层析法( G I C A ) ，经布鲁氏菌病病人和健康人 不同血清用量的测试，选择最佳血清
2、用量，建立快速检测诊断布鲁氏菌病的新方法。结果：胶体金免疫层析法快速检测 布鲁氏菌病最佳血清用量为1 0 山，检测布鲁氏菌病敏感性和特异性分别达到9 3 6 和9 4 9 ，y o u d e n 指数为0 8 8 5 ，检 测结果与D I G F A 及S A T 比较三者无统计学意义( P 0 0 5 ) 。结论：应用胶体金免疫层析法( G I C A ) 快速诊断布鲁氏菌 病，不仅具有试剂敏感、特异的优点，且血清用量更少( 1 0 一) ，操作更为简便，更适合于布鲁氏菌病的诊断、流行病学调 查及现场应用。 关键词布鲁氏茵病；免疫层析法；快速诊断 中图分类号】R 3 7 8 5 文献标识码
3、】A 文章编号】1 0 0 4 8 6 8 5 ( 2 0 0 8 ) 0 7 1 3 4 4 0 2 An e wm e t h o do fr a p i dd i a g n o s i sf o rb r u c e l l o s i sb yc o l l o i d a lg o l d - i m m u n o c h r o m a t o - g r a p h i ca s s a y Z h uM i n g - d o n g ，Y a n gR o n g ，舶，l gL i n d i ，Z h o n gC h u n m e i ，Z h a oW e n
4、y u ( Z h e j i a n gA c a d e m yo fM e d i c a lS c i e n c e s ，H a n g z h o u3 1 0 0 1 3 ，C h i n a ) A b s t r a c t O b j e c t i v e ：T oe s t a b l i s han e wm e t h o df o rr a p i dd i a g n o s i sf o rh u m a nb r u c e l l o s i s M e t h o d s ：而eC o l l o i d a lG o l d I m - m a n
5、o c h r o m a t o g r a p h i cA s s a yw a sd e v e l o p e dt h r o u s t , d e t e c t i n go nt h ep o s i t i v es e r u mo fh u m a nb r u c e l l o s i sa n dh e a l t h yp e o p l er e - s p e c t i v e l y 卟en e wm e t h o dW a sb a s e do nt h eo p t i m a lc o n d i t i o nw h i c hW a ss
6、 e l e c t e da f t e ra n a J ) r z i n gt h ed i f f e r e n tv o l u m es e r u l l lf o r d e t e c t i o n R e s u l t s ：1 0 山i st h eo p t i m a lv o l u m ef o rd e t e c t i o n T h es e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yo fC o l l o i d a lG o l d I m m u n o c h r o m a t o - g r
7、 a p h i cA s s a yf o rd e t e c t i n gh u m a nb m c e l l o s i s i si s9 3 6 a n d9 4 9 r e s p e c t i v e l y ，t h ey o u d e ni n d e xw a s0 8 8 5 ，a n dt h e r ew e r e n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gC o l l o i d a lG o l d I m m u n o c h r o m a t o g r a p h i cA s
8、 s a y 。S A Ta n dD I G F A ( P 0 0 5 ) C o n c l u s i o n ：W e - t a b l i s h e da r a p i dm e t h o df o rb r u e e l i o s i s i sd i a g n o s i s ，w h i c hi sG o l d I m m u n o c h r o n m t o g r a p h i cA s s a y ，a n di ti sn o to n l ys e n s i t i v i t y a n ds p e c i f i c i t y ，
9、b u ta l s ol e s sd e t e c t e ds a m p l en e e d e d ( 1 0 一) n i sH e wm e t h o di sas i m p l ew a y ，a n dm o r es u i t a b l ef o rt h ed i a g n o - s i s ，e p i d e m i o l o g yi n v e s t i g a t i o na n df i e l da p p l i c a t i o no fb r u c e l l o s i s i s K e yw o r d s B r u
10、c e l l o s i s ；C o l l o i d a lg o l d i m m u n o c h r o m a t o g r a p h i ca s s a y ；R a p i dd i a g n o s i s 布鲁氏菌病( B r u c e l l o s i s 简称布病) 是由布鲁氏菌属的细 菌侵入机体，引起传染变态反应性的人畜共患传染病。近年 来，世界布鲁氏菌病疫情回升；我国自1 9 9 4 年开始出现布鲁氏 菌病疫情回升的势头，近l O 年来疫情回升严重，呈逐年上升 趋势。2 0 0 6 年全国布鲁氏菌病疫区已达1 8 个省( 市、自治 区) ，以往无
11、疫情的南方省份也出现了病例；根据国家布鲁氏 菌病监测点统计，发病率为1 4 1 0 万【L2 。目前人畜布鲁氏 菌病免疫学检测方法主要采用试管凝集试验( S A T ) 、虎红平板 凝集试验( R P S T ) 和补体结合试验( C F I “ ) ，3 种方法均存在血 清用量大，操作步骤复杂，检测速度慢等缺点4 1 。为适应当 前布病防治工作的需要，我们已应用斑点金免疫渗滤法( D I G - F A ) 研发了布鲁氏菌病诊断试剂”o ；为进一步提高人畜布鲁氏 菌病检测的水平和检测效果，本研究应用胶体金免疫层析法 ( G I C A ) 研制快速诊断布鲁氏菌病诊断试剂。现将初步研究结 果报
12、告如下。 基金项目浙江省科学技术厅基金资助( 2 0 0 6 F 1 3 0 2 2 ) 作者简介 朱明东( 1 9 5 4 一) ，男，高级实验师主要从事血吸虫 病免疫诊断研究。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 实验试剂氯金酸( A u C I ，H C I 4 H 2 0 ) 为上海试剂一 厂产品；硝酸纤维素膜( N C ) 为上海医药工业研究院产品；牛 血清白蛋白为S i n o A m e r i c a nB i o t e c h n o l o g yC o 产品；金萄菌A 蛋白( S P A ) 为中国生物技术集团公司产品；正常人I s G 为上海 申索试剂有限公司产
13、品。 1 1 2 布鲁氏菌菡体抗原采用实验室培养的牛种布鲁氏菌 菌体抗原。 1 1 3D I G F A 诊断试剂 由浙江省医学科学院研制。 1 1 4S A T 诊断试剂 由中国预防医学科学院流行病学微生 物学研究所提供。 1 1 5 血清样本布鲁氏菌病病人血清由内蒙古自治区乌兰 察布市地方病防治站和浙江省布病中心提供( 根据卫生部、农 业部颁发标准确诊) ；健康人血清来自浙江省龙游县非布鲁 氏菌病流行区。 1 2 方法 1 2 1 布鲁氏菌抗原的制备取实验室培养的牛种布鲁氏菌 菌体约l 万亿个，加入生理盐水1 0m l ，经超声粉碎、冰冻、冷 万方数据 中国卫生检验杂志2 0 0 8 年7
14、 月第1 8 卷第7 期 C h i I I e 娓J o u r n a l0 fH e a l 山L 丑b o m I o r yk h n o 蛔，J u l2 0 0 8 ；V o l1 8 N o71 3 4 5 浸及高速离心后取上清液，测定蛋白浓度为2 0 0 嵋l l 。 1 2 2 胶体金的制备及胶体金蛋白的标记按F r e n s 柠檬酸 钠还原法制备胶体金【“。按H 谢s b e g e r 方法标记胶体金蛋 白引。 1 2 3 胶体金免疫层析法( G I C A ) 试纸条的制备将喷有质 控线、检测线的硝酸纤维素膜切成0 4 6 伽长条，在其上端 贴上吸水垫，下端贴上金标
15、垫及样品吸收垫，置于塑料卡中， 加干燥剂密封后室温保存。 1 2 4 肢体金免疫层析法( G I C A ) 操作方法在加样孔内加 入待检血清，待渗入后，加入生理盐水1 0 0 山3I n i n 后观察结 果。检测线和质控线均出现红色为阳性；检测线无色，质控线 出现红色为阴性。 1 2 5 最佳血清量的选择分别取布鲁氏菌病病人和健康人 血清5 、1 0 和2 0m 进行测试，根据y o n d e n 指数确定最佳血清 用量。 1 2 6D I C F A 操作方法按浙江省医学科学院朱明东等报 道引。 1 2 7S A T 操作方法按中国预防医学科学院流行病学和微 生物学研究所提供的使用说明
16、书操作。 1 2 8 统计学方法G I C A 、D I C F A 及s A T 检测结果数据应用 S P S S 软件进行统计学分析。 2 结果 2 1 胶体金免疫层析法( G I C A ) 不同血清用量检测布鲁氏茼 病敏感性及特异性 胶体金免疫层析法( G I C A ) 分别用5 、1 0 和出病人血清 和健康人血清量进行测试，当检测血清用量为5 山时，敏感性 和特异性分别为8 1 8 和9 9 O ；检测血清用量为1 0 一时，敏 感性和特异性分别为9 3 6 和9 4 9 ；检测血清用量为加一 时，敏感性和特异性分别为9 8 2 和8 4 7 ；y o n d e n 指数分别
17、为o 8 0 8 、o 8 8 5 和0 8 2 9 ，结果表明最佳检测血清用量为l O 山。 胶体金免霞层析法不同血清用检测布鲁氏菌病敏感性、特异性结果 2 2G I C A 、D I G F A 及S A T 检测布鲁氏茵抗体结果比较 G I c A 、D I G F A 及S A T 检测结果比较。3 种检测方法其敏 感性和特异性分别为( 1 0 3 1 1 0 ) 9 3 6 和( 5 9 8 ) 9 4 9 、 ( 1 0 6 1 l O ) 9 6 4 和( 2 9 8 ) 9 8 0 、( 1 0 1 1 1 0 ) 9 1 8 和( 3 9 8 ) 9 7 9 。经r 检验3
18、种方法间无统计学意义( 一= 2 0 2 3 ， ，= 1 4 4 9 ，P o 0 5 ) 。 3 讨论 在我国，目前布鲁氏菌病的检测最经典的方法是试管凝 集试验( S A T ) ，但该方法操作复杂，检测速度慢。近年来，对布 鲁氏菌病的检测方法研究较多，E u s A 方法虽具有敏感性高、 特异性强等优点，但操作繁琐、耗时多，需要一定的仪器，在基 层推广受到一定限制【9 1 ；P C R 技术用于布鲁氏菌病的诊断，因 敏感性差。未能应用。金标记技术是近年发展起来的新标 记技术。已广泛用于病毒、细菌及寄生虫病的免疫诊断方 面i n , 1 2 。 本研究应用胶体金免疫层析法研制快速诊断布鲁氏
19、菌病 诊断试剂，胶体金免疫层析法不同血清用量检测布鲁氏菌病 敏感性、特异性结果显示：当血清用量为5 、1 0 和2 0 山时，其 y o u d e n 指数分别为0 8 0 8 、0 8 8 5 和0 8 2 9 ，由此可见，布鲁氏菌 病检测中血清用量在l O 一时，其y o u d e n 指数为0 8 8 5 ，高于 其他组，且敏感性、特异性均大于9 3 。表明胶体金免疫层析 法检测人布鲁氏菌病最佳血清用量为1 0 山。 本研究结果表明：胶体金免疫层析法检测血清用量为 1 0 一组的检测结果与D I G F A 和S A T 检测结果比较：3 种方法 检测病人血清和健康人血清，其敏感性和
20、特异性无统计学意 义( P O 0 5 ) 。S A T 虽是一种经典人畜布鲁氏菌病免疫诊断 方法，具有较高的敏感性和特异性，但其操作步骤比较复杂， 使用器械多，血清用量大( 2 0 0 山) ，检测时间长( 2 4h ) 。需花费 较多的人力和物力；D I G F A 具有敏感性强，特异性高优点，且 操作简便，不需任何仪器。血清用量少( 2 5 一) ，检测速度快 ( 2I I l i n ) ；胶体金免疫层析法除具有试剂敏感、特异的优点外， 血清用量更少( 1 0 山) ，操作更为简便，更适合于布鲁氏菌病的 诊断、流行病学凋查及现场应用，为布鲁氏菌病的防治提供一 种新的手段。 【参考文献
21、1 】尚德秋布鲁氏菌病研究进展 J 中国地方病防治杂志，2 0 0 4 ， 1 9 ( 4 ) ：2 0 4 2 1 2 2 徐卫民，施世锋，杨洋，等浙江省首例布鲁氏菌病调查 J 中国 地方病防治杂志，2 0 0 5 ，2 0 ( 3 ) ：1 7 0 一1 7 I 【3 姜顺求布鲁氏菌病防治手册 M 北京：人民卫生出版社。 1 9 8 6 4 尚德秋布鲁氏菌病实验诊断与非特异性反应及其鉴剐 M 北 京：海洋出版社，1 9 9 5 5 朱明东徐卫民，洪林娣，等斑点金免疫渗滤法快速诊断布鲁氏 菌病的研究 J 中国地方病学杂志，2 0 0 6 1 5 ( 3 ) ：3 2 6 3 2 7 6 G
22、B l 5 9 8 8 一1 9 9 5 布鲁氏菌病诊断标准及处理原则 s 7 F 他mGC 蚰t r o e dn u c l e a f i o nf o rt l I e 卅；山t i o fp a r t i c l es i 狮啪n o - d i s p e 嘴伊i o n J 】N 咖m 1 9 r 7 3 ，2 4 ：2 9 5 8 】H o f i s b e g e rM ，d 以c o u o i d a l 鲥d ，au s 商u li n a r k e rl b rt 瑚砌鹪i o n 曲d8 咖i ge l 咖nm i c 咖p y 【】 JH i s t o c
23、 h e mC 灿h e m ，1 9 7 7 ，2 5 ： 2 9 5 9 齐景文布鲁氏菌病概述 J 中国兽医杂志，2 0 0 4 ，4 0 ( 9 ) ：5 0 5 3 1 0 王丽，马国柱P c R 技术用于布鲁氏菌病的诊断研究 J 中国 地方病防治杂志，2 0 0 4 ，1 9 ( 2 ) ：6 5 6 7 1 1 1 3 W , g sM ，N o v 咖yM ，S a m p c a r os A 神l f 一雕砌n ge l I r o m a r o - g r a p h i ch m n o a 哪yf o f 山eq u a l i t a l i V ed e t 删枷如0 f h u m a nc 埘一 o I I i c 胖1 8 d o t r 叩I l i ( H c G ) i nu r i n e 一螂吣 J C I I i nc h e m ，1 9 9 0 。 3 6 ：1 0 8 4 一1 0 8 5 1 2 沈丽英，干小仙，丁建祖，等金标免疫渗滤法快速检测血吸虫循 环抗原的研究 J 】中国人兽共患病杂志，2 0 0 0 ，1 6 ( I ) ：1 2 一1 6 ( 收稿日期：2 0 0 8 0 2 2 7 ) 万方数据