带J链的α防御素1基因转染COS7细胞后的表达检测.pdf

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1、论著 带 J 链的 防御素 1基因转染C OS 7细胞后的表达检测 刘贤华白晓东仝青英张韶峰 【摘要】 目的将防御素 1 ( HNP1 ) 基因与J链基因重组为一种新的杀菌肽分子J HNP 1 , 观察J HNP 1在细胞内的表达及分泌情况。方法采用聚合酶链反应( P C R)方法分别从p C H J质粒和 p B a b e Ne o HNP 1质粒中扩增出J链和HNP 1 ;进行重组P C R ,获取J HNP 1D NA片段,并插入哺乳 动物细胞表达载体p c D NA3 . 1 () / My c Hi s C中;用脂质体转染法将此重组真核表达载体导入C OS 7细 胞,然后应用蛋白质

2、免疫印迹法( We s t e r nb l o t )检测Hi s t a g标签基因。结果用抗Hi s抗体检测到细胞可溶 性蛋白及培养上清在约2 4k u处均有强反应条带显示,其大小与预测相符;对照组未见相应条带显示。结论 采用We s t e r nb l o t检测到新的杀菌肽分子J HNP 1在细胞内得到表达并分泌到细胞外,为进一步研究 J HNP 1杀菌肽的抗菌活性奠定了基础。 【关键词】 重组聚合酶链反应;杀菌肽; J链; 防御素 1 ; 转染 E x p r e s s i o no f d e f e n s i n 1w i t hJc h a i ni nt h et r

3、 a n s f e c t e dC O S 7c e l l sL I U Xi a n h u a ,B AIXi a o d o n g ,T O NGQ i n q y i n g ,Z HANGS h a o f e n g .C e n t r a l L a b o r a t o r y ,G e n e r a l Ho s p i t a l o fC h i n e s eP e o p l e s Ar me dP o l i c eF o r c e ,B e i j i n g1 1 1 1 2 3 ,C h i n a 【 4 5 s t r a c t 】 O

4、 5 6 e c t i 7 e 8 or e c o 9b i n et : e ; e e s t i g a t ei t s e ? p r e s s i o ni nt : et r a n s e l y ,t : e nt : eJ HNP1D NA i t yo i t r o g e n公司; p C HJ质粒由 挪威奥斯陆大学J o : a n s e n教授赠送;人防御素真核 表达质粒p B a b e Ne o HNP 1由华西医科大学赠 送;金黄色葡萄球菌标准菌株P K 3 Q由北京军事医学 科学院九所提供;细胞株C OS 7细胞由北京军事 医学科学院二所赠送。限制

5、性内切酶B a 9HRI兔抗 多聚组氨酸抗体(即Hi s抗体)购自北京华美生物公 司;聚合酶链反应( P C R)产物克隆试剂盒购自北京 天象邦定生物科技有限公司;脂质体转染试剂购自 北京天为时代公司。 1 . S 方法 1 . S . 1 引物设计F TJ链上游引物P 1 F K g g at c ca t g a a ga a cc a t t t gc t t 3 ;下游引物P 2 F K a c ca c ca c c a c cg t c a g ga t ag c ag g c a t c 3 。 UHNP 1上游引物 P 3 F K g g t g g t g g t g g t

6、 a t ga g ga c cc t cg c ca t c 3 ; 下 游 引 物 P 4 FK g g at c cg c ag c ag a at g cc c a g a g 3 。 V根据预测J HNP1c D NA序列设计 P C R引 物F P K F K a t ga a ga a cc a tt t gc t tt t ct g g 17 中国危重病急救医学2 G G P年2月第1 Q卷第2期 C : i nC r i t C a r eMe ; , W e b r u a r y2 G G P , Xo l . 1 Q , No . 2 g 3 ;P 6 :5 g c a

7、g c ag a at g cc c ag a g t c 3 。 测序引物:正 向 引 物 为T7 : 5 T AAT AC G AC - T C AC T AT AG G G3 ;反 向 引 物 为B G Hr e v : 5 T AG AAG G C AC AG T C G AG G3 。 以上引物均 由北京军事医学科学院合成。 1 . 2 . 2 p I g R配体样杀菌肽分子J HNP 1的构 建:用P C R方法以P 1 、 P 2为引物从原质粒p C H J 中扩增出J链片段。用P C R方法以P 3 、 P 4为引物从 原质粒p B a b e Ne o HNP 1中扩增出HN

8、P1片 段。用重组P C R技术,以J链扩增产物和HNP 1 扩增产物的混合物为模板,以P 1 、 P 4为引物扩增获 取 J HNP1基因。将此杂合基因J HNP1 D NA片段先利用P C R产物克隆试剂盒与p G MT E a s y载体相连接, 再用限制性内切酶B a mH进行 酶切以获取J HNP 1D NA片段。将J HNP 1 D NA片段插入真核表达质粒p c D NA3 . 1 () / My c Hi s C的多克隆位点, 并紧邻报告基因My c表位和 6 Hi s 的上游,从而构建成为重组真核表达载体 r p c D NA3 . 1 () / My c Hi s C /

9、J HNP 1 。用该重组 质粒转化大肠杆菌T OP 1 0 ,并接种于含1 0 0mg / L 氨苄青霉素的琼脂糖( L B )培养基,过夜培养后挑取 阳性克隆,提取质粒D NA,随机挑取8个阳性克隆 提取质粒D NA,用限制性内切酶B a mH进行酶切 鉴定,并对阳性克隆质粒进行D NA测序。 1 . 2 . 3 基因转染: C OS 7细胞培养于含体积分数 为 1 0 %胎 牛 血 清 的D u l b e c c o改 良E a g l e培 养 基 ( D ME M)中。转染前1d ,将细胞转移至6孔板,使 细胞达9 0 %9 5 %。用脂质体转染试剂将r p c D NA 3 .

10、1 () / My c Hi s C / J HNP1导入C OS7细 胞。同时设置转染空质粒 r p c D NA3 . 1 () / My c Hi s C的C OS 7细胞作为阴性对照。 1 . 2 . 4 蛋白质免疫印迹法( We s t e r nb l o t )检测:于 转染后3 6h收集各组细胞及培养上清(无胎牛血清 和抗生素) 。用蛋白质提取试剂提取细胞可溶性蛋 白 3 。培养上清先用蒸馏水透析后经冷冻干燥机浓 缩,将以上各组样品经质量分数为1 2 %的聚丙烯酰 胺凝胶电泳( P AG E )后转染聚偏氟乙烯( P VD F )膜。 将P VD F膜放入封闭液用磷酸盐缓冲液(

11、 P B S )配 置的体积分数为1 %牛血清白蛋白( B S A) 中4 封闭过夜,以去除非特异结合部分。加1 :15 0 0稀 释的抗Hi s抗体(一抗) , 3 7孵育1h ;加入辣根过 氧化物酶标记的抗兔抗体 I g G(二抗) , 3 7孵育 1h ;室温暗处于3 , 3 二氨基联苯胺( D AB )显色液 (含质量分数为0 . 0 5 %D AB 、体积分数为0 . 0 3 %H2O2 的P B S )中显色,条带出现后立即用P B S洗净。 2 结果 2 . 1 J HNP 1基因的构建:从p C HJ质粒中扩 增出J链,产物大小为4 8 9b p (图1 ) ;从p B a b

12、 e Ne o HNP 1质粒中扩增出HNP 1 ,产物大小为2 9 7b p (图2 ) 。然后以其自身产物为模板,进行重组P C R , 产生了包含J链和HNP 1这两个不同基因的杂合 基因。将此杂合基因与p G M TE a s y载体通过连 接与转化,产生阳性克隆菌落。挑菌、培养、提取质 粒, B a mH酶切质粒p G M TE a s y / J HNP 1 , 获取J HNP 1片段,再次克隆入哺乳动物细胞表 达载体p c D NA3 . 1 () / My c Hi s C 。 1 : D NAMa r k e r D L 20 0 0 ; 2 、 3 : J链P C R产物;

13、 图1 J链P C R产物电泳图 F i g u r e1 P C Rp r o d u c t o f Jc h a i n 1 : D NAMa r k e r D L 20 0 0 ; 2 、 3 : HNP 1P C R产物 图2 HN P 1P C R产物电泳图 F i g u r e2 P C Rp r o d u c t o f HN P 1 2 . 2 重组哺乳动物细胞表达载体r p c D NA3 . 1 () / My c Hi s C / J HNP1的筛选与鉴定: 用随机方 法挑取8个阳性克隆提取质粒D NA,用限制性内切 酶B a mH进行酶切鉴定,对6个阳性克隆质粒

14、进 行D NA测序。测序结果显示:使用正向引物T7和 反向引物B G H r e v对重组质粒r p c D NA3 . 1 () / My c Hi s C / J HNP 1进行D NA序列测定,插入 27 中国危重病急救医学2 0 0 6年2月第1 8卷第2期 C h i nC r i t C a r eMe d , F e b r u a r y2 0 0 6 , Vo l . 1 8 , No . 2 片断为7 8 6b p ,而且有4个为正向插入。在2个不同 基因之间顺利插入了4个甘氨酸分子,双重标签基 因My c和6个多聚组氨酸( Hi s )位于杀菌肽分子 J HNP 1 的下

15、游。 2 . 3 We s t e r nb l o t检测J HNP 1的表达( 图3 ) : We s t e r nb l o t检 测 结 果 表 明:经r p c D NA3 . 1 () / My c Hi s C / J HNP 1转染的C OS 7细胞可溶 性蛋白在约2 4k u处有强反应条带显示,经r p c D NA 3 . 1 () / My c Hi s C / J HNP 1转染的C OS 7细 胞的培养上清在约2 4k u处也有一强反应条带显 示。对照组转染空质粒p c D NA3 . 1 () / My c Hi s C 的C OS 7细胞和培养上清均未见相应条带

16、显示。 1 、 2 : r p c D NA3 . 1 () / My c Hi s C / J HNP 1转染的C OS 7 细胞可溶性蛋白; 3 、 4 : r p c D NA3 . 1 () / My c Hi s C / J HNP 1 转染的C OS 7细胞培养上清; 5 :蛋白Ma r k e r ; 6 、 7 : p c D NA3 . 1 () / My c Hi s C (即空质粒)转染的C OS 7细胞可溶性蛋白; 8 、 9 : p c D NA3 . 1 () / My c Hi s C转染的C OS 7细胞培养上清 图3 We s t e r nb l o t分析

17、转染r p c D N A 3 . 1 () / My c Hi s C / J HN P 1的C O S 7细胞J HN P 1的表达 F i g u r e3 A n a l y s i s o f J HN P 1i nC O S 7c e l l s t r a n s f e c t e d b yr p c D N A3 . 1 () / My c Hi s C / J HN P 1b yWe s t e r nb l o t 3 讨论 抗生素在抗感染领域中一直发挥着巨大作用。 但由于各种原因,如细菌的变异、抗生素的滥用等等 造成细菌对传统抗生素的耐药却一直困扰着整个医 学界。人们

18、一直尝试着各种途径去解决这一难题,目 前抗菌肽的研究成为热点之一。抗菌肽的种类很多, 防御素是其中最引人关注的,目前国内对防御素的 研究主要集中在基因重组阶段 4 , 5 。防御素主要存在 于肠道、女性生殖道黏膜系统中,而黏膜上皮细胞又 有一个共同的特点,即在细胞膜上具备p I g R 。连有 J链的I g A分子通过J链与p I g R结合后 6 , 将I g A 分子转入黏膜细胞中。本实验成功地将HNP 1进 行了分子改建,使其带上J链而成为J HNP 1杀 菌肽。 J HNP 1分子的一端为J链,另一端为防御 素,称之为多聚I g A受体( p I g A)配体样杀菌肽。这 种外源性防御

19、素借助于J链的作用被送入黏膜上皮 细胞内,使黏膜上皮获得象中性粒细胞一样的杀菌 功能,从而杀灭细胞内移位菌。 为了解J HNP 1基因被转录后是否能被翻 译表达成蛋白质,我们利用抗报告基因6 Hi s表达 产物的特异性抗体(抗Hi s抗体) ,用We s t e r nb l o t 法检测J HNP 1的表达。采用We s t e r nb l o t能否 检测到表达蛋白,关键是蛋白质的成功转移,而影响 蛋白质成功转移的因素主要有以下几点: 十二烷 基硫酸钠( S D S )的存在。尽管S D S对于蛋白分离是 必要的,但它对有效转印极为不利。因为首先S D S 会使蛋白质分子带很多的负电荷

20、,引起蛋白质分子 快速穿透膜,降低孔结构上的截留量,使分子相互作 用的机会降至最低。其次, S D S可能将蛋白质分子 包被起来,从而限制了蛋白质分子与P VD F接触, 因此凝胶在转印之前需先用甲醇进行平衡。电流 和转移时间。适当的电流和转移时间是成功印迹的 关键。电流太低或时间不足会导致不完全性转移; 反之,电流太高,蛋白质分子在膜中迁移太快将导致 无法有效吸附。转移缓冲液的p H。平衡时间。 S D S P AG E系统中在电泳缓冲液中加有S D S , 从 阴极出来的S D S会浓缩并进入凝胶,跑在溴酚蓝示 踪染料的后面。因多数凝胶在示踪染料跑到凝胶底 部时停止,所有过量S D S都截

21、留在凝胶中并被带到 印迹操作中,如果在转移之前不让它扩散出来,将干 扰蛋白质吸附。平衡时间可延长到3 0mi n ,并使用 足量的缓冲液以使S D S降到最低水平。本实验中 用We s t e r nb l o t检测J HNP 1的表达结果提示: 经r p c D NA3 . 1 () / My c Hi s C / J HNP 1转染的 C OS7细 胞 可 溶 性 蛋 白 和 细 胞 培 养 上 清 在 约 2 4k u 处均有强反应条带显示。此结果说明带J链的 杀菌肽分子J HNP 1已在C OS 7细胞内表达, 其表达的产物蛋白同时被分泌到细胞外,为进一步 研究J HNP 1杀菌肽的

22、抗菌活性奠定了基础。 参考文献: 1F e l l e r ma n nK, S t a n g eEF . D e f e n s i n s i n n a t ei mmu n i t ya tt h e e p i t h e l i a lf r o n t i e r J . E u rJG a s t r o e n t e r o lHe p a t o l , 2 0 0 1 , 1 3 : 7 7 1 7 7 6 . 2S e l aB . D e f e n s i n so fi n n a t ei mmu n i t ys e r v i n ga sf u r s

23、 tl i n e a n t i mi c r o b i a l d e f e n s e J . Ha r e f u a h , 2 0 0 2 , 1 3 9 : 1 1 2 1 1 6 . 3 金冬雁,黎孟枫,侯云德,等译.分子克隆实验指南 M .第2版. 北京:北京科学出版社, 1 9 9 6 : 8 7 0 8 7 3 . 4 陈姗,董燕麟,何凤田,等.人防御素3的c D NA克隆和表达载 体的构建 J .第三军医大学学报, 2 0 0 3 , 2 5 : 6 1 7 6 1 9 . 5 蔡绍晖,杜军,陈新年,等. C端带My c和多聚组氨酸双重标记的 重组人防御素 2在C

24、OS 7细胞的转染表达 J .生物医学 工程学杂志, 2 0 0 3 , 2 0 : 2 5 5 2 5 9 . 6J o h a n s e nF E , No r d e r h a u gIN,R e eM,e ta l .R e c o mb i n a n t e x p r e s s i o no fp o l y me r i cI g A: i n c o r p r a t i o no fJc h a i na n ds e c r e - t o r yc o mp o n e n to fh u ma no r i g i n J . E u rJI mmu n o l , 1 9 9 9 , 2 9 : 1 7 0 1 1 7 0 8 . (收稿日期: 2 0 0 5 0 7 2 4 修回日期: 2 0 0 6 0 1 1 6 ) (本文编辑:李银平) 37 中国危重病急救医学2 0 0 6年2月第1 8卷第2期 C h i nC r i t C a r eMe d , F e b r u a r y2 0 0 6 , Vo l . 1 8 , No . 2