常见呼吸道病毒分子鉴别诊断技术的建立.pdf

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1、中华实验和临床病毒学杂志2 0 0 6 年6 月第2 0 卷第2 期C h i n e s e J E x v C l i n V ir o l , J u n e 2 0 0 6 , V o l 2 0 , N o . 2 1 7 论 著 常见呼吸道病毒分子鉴别诊断技术的建立 邹淑梅韩健温乐英K a s s i C r o n i n 舒跃龙 【 摘要】 目的建立一种常见呼吸道感染病毒的快速检测方法， 为尽早诊断、 减少疾病的传播以 及为临床提供良好的治疗依据。方法采用液体芯片检测技术结合靶向多重 R T - P C R技术建立可以 同时检测 1 3 种呼吸道病原的检测技术。结果该方法特异性

2、方面检测 1 3 种常见呼吸道病毒没有交 叉， 标本的检出率为1 0 0 %; 灵敏度方面达到l O e 2 - l 0 e l ( p f u / m l ) 。结论该分子鉴别诊断可应用常见 呼吸道病毒的检测， 协助诊断病毒引起的病毒性呼吸道感染。 【 主题词】 分子鉴别诊断; 一 呼吸道病毒 E s t a b l i s h m e n t o f m o l e c u l a r d i f f e r e n t i a l d i a g n o s t i c ( M D D ) t e c h n o l o g y f o r d e t e c t i o n o f c

3、 o m m o n r e s p i r a t o ry v i r u s e s Z O U S h u - m e i “ ， H A N j i a n ， W E N L - y i n g ， K a s s i C r o n i n ， S H U Y u e - l o n g . S t a te K e y L a b o r a t o r y f o r I n f e c t io u s D is e a s e P r e v e n t i o n a n d C o n t r o l ， I n s t i t u t e f o r V i r a

4、 l D is e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n ， C h i n e s e C e n t e r f o r D is e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n ， B e ij i n g 1 0 0 0 5 2 , C h i n a C o r r e sp o n d i n g a u t h o r : S H U Y u e- l o n g ， E - m a i l : y s h u 呻 . s i n a . c o m. T e l : 0 1 0

5、 - 6 3 5 7 7 4 9 9 A b s t r a c t O b j e c t i v e T o p ro v id e r a p i d l a b o r a t o ry e v i d e n c e fo r d ia g n o s i s o f r e s p ir a to ry in f e c t io n a n d h e l p d i a g n o s e a c c u r a t e l y a n d r e d u c e t h e s p r e a d o f d i s e a s e , s o t h a t t h e p

6、 a t i e n t s c a n b e d i a g n o s e d a n d t r e a t e d e a r l y . Me t h o d s T h i rt e e n k i n d s o f r e s p i r a t o ry v i r u s e s w e r e d e t e c t e d b y u s i n g t h e G e n a c o s M D D t e c h n o l o g y . R e s u l t s A ll t h e s p e c i m e n s w e r e d e t e c t

7、 e d , t h e t o t a l p o s i t i v e r a t e w a s 1 0 0 %; t h e s e n s i t i v i t y o f t h e m e t h o d w a s l O e 2 ( p f u / m l ) . C o n c l u s i o n T h e M D D s y s t e m c a n d i s t i n g u i s h t h e 1 3 r e s p i r a t o ry v i r u s e s , w h i c h h e l p s d i a g n o s i s

8、 o f re s p i r a t o ry v i r a l i n f e c t i o n . K e y w o r d s M o le c u l a r d iff e r e n ti a l d i a g n o s t ic ; R e s p ir a to ry v i r u s 目 前已证明， 急性呼吸道感染 9 0 %以上是由病 毒引起的， 其中以 呼吸道病毒最常见 。 如甲1 型、 甲3 型、 乙型流感病毒; 副流感病毒 1 型、 3型以及 呼吸道合胞病毒( R S V ) A型、 B 型等。呼吸道病毒感 染常可导致较高的发病率和死亡率， 尤其受到环境

9、 变化和生态平衡破坏的影响， 病毒发生各种变异， 常 突然暴发， 病情凶险， 病死率高， 给临床诊断和治疗 及疾病的监控带来很大困难， 如 1 9 9 7 年在香港肆虐 的禽流感以及2 0 0 3 年S A R S 的暴发。这些都提示我 们即时与准确的鉴别诊断， 快速识别病原体， 对预防 疾病的传播和患者的诊断治疗至关重要。同时， 鉴 别诊断对于制定策略与计划来应对像 S A R S 暴发一 样的公共卫生危机也有非常重大的意义。 本研究采用 M D D检测方法， 即急性呼吸道感染 的多重分析系统， 该方法将靶序列富集多重 P C R ( T a r g e t e n r i c h e d

10、m u l t i p l e x P C R , T e m - P C R ) 和 M u l t i p l e A n a ly t e s P r o f ilin g ( x M A P ) 2 技术有机结合， 克服了 病 毒分离培养、 血清学诊断及单一 P C R的缺点， 可以 在一次反应中同时检测出多种病毒引起的呼吸道感 染。 1 材料和方法 基金项 目 作者单位 : 国家自然科学基金资助( 3 0 5 9 9 4 3 3 ) : 1 0 0 0 5 2 北京， 中国疾病预防控制中心病毒病所， 传 染病预防控制国家重点实验室( 邹淑梅、 温乐英、 舒跃龙) ; G e n a

11、c B i o m e d i c a l P r o d u c t s , I N C ( 韩健、 K a s a i C ro n i n ) 通讯作者: 舒跃龙， 电 话: 0 1 0 - 6 3 5 7 7 4 9 9 , E - m a il : y s h u v i p . s i n a . c o m 1 . 1 标本的来源S A R S - C o V由美国C D C提供; A 3 / 闽防/ 4 1 1 / 2 0 0 2 ( H 3 N 2 ) ; B / 沪防/ 3 6 1 / 2 0 0 2由国家流感 中心提供， 且均经鸡胚传代， 细菌培养阴性; 其他标 本来自美

12、国A T C C公司产品。 1 . 2 病毒R N A / D N A的提取 采用美国O m e g a B io - T e k 公司的 R N A / D N A I s o l a t i o n K i t ， 按试剂盒说明书 提取病毒R N A / D N A o 1 . 3 T e m - P C R反应按德国Q i a g e n 公司O n e s t e p R T - P C R K i t 进行。反应体系为: D E P E 处理的双蒸水 2 4 . 7 5 t i l , 5 x b u f f e r 1 0川， d N T P m i x 2 A l , R N a

13、 s e I n h i b i t o r 1 8中华实验和临床病毒学杂志2 0 0 6 年6 月第2 0 卷第2 期C h i n e s e J E x p C l i n V i ro l , J u n e 2 0 0 6 , V o l 2 0 , N o . 2 ( P ro m e g a ) 0 . 2 5 t d ， E n z y m e m ix 2 p d ， S u p e r p r i m e r m i x ( G e n a c o , U S A ) 6 l tl , R N A 5 p i ， 总体积5 0 t d 。反应条 件为: 5 0 c C 3

14、0 m i n , 9 5 c C 1 5 m i n ， 进行逆转录; 然后 9 4 9 0 3 0 s , 5 2 9 C 1 m i n , 7 2 T 1 m i n , 1 5 个循环; 9 4 O C 1 5 s , 7 0 9 C 1 m i n , 6 个循环; 9 4 9 C 1 5 s , 5 2 9 C 1 5 s , 7 2 9 C 1 5 s , 3 0 个循环; 7 2 延伸3 m i n ， 再置4 9 C o 1 . 4 P C R产物杂交按美国G e n a c 。 公司特定物质 检测试剂( A S R ) 操作说明进行。 1 . 5 杂交产物检测用 L u

15、m i n e x 1 0 0 ( 深圳捷纳生物 技术有限公司) x M A P 技术分析样品。 取标本1 0 0 t d ， 分别提取病毒R N A / D N A ， 经T e m - P C R和杂交后， L u m i n e x 1 0 0检测杂交信号， 并报告 平均荧光强度值 ( M F I , M e a n fl u o r e s c e n c e in t e n s it y ) , 显示特定病原体的有无， 检测结果均出现很好的阳 性结果， 见表 t o 2 . 2 ADD方法检测混合病毒 R N A / D N A的特异性 结果均出现很好的特异性， 结果见表2 0 2

16、 . 3 MD D方法检测不同病毒的敏感性病毒按不 同滴度提取 R N A / D N A , T e m - P C R产物杂交后检测， 结果见表3 0 2 结果 2 . 1 MD D方法检测单一病毒 R N A / D N A的特异性 表1 M D D 方法检测呼吸道病毒的特异性 T a b . 1 S p e c i f i c i t y o f t h e m u l t ip l e x e d a s s a y s y s t e m 病毒标本 S a m p l e s 平均荧光强度值M e a n fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t

17、 y ADVCP NMP N I NF AI NF B P I V- 1 P I V- 3 R S V S A R S 1 S A R S 2 S A R S 3 E N T Mo n 1 飞Rl )1 5 t o i n 2 7 4 6 1 0 8 9R b l a n k1 31 2 1 1 1 01 0 1 3 Jn石 n内 22 1 3 7 3 2 0 61 1 4 1 7 1 2 8 1 1 1 31 2 1 81 3 0110衬、 200口6 1 一、，了 ，且22 加8148D921 产nU760 勺1山.1.1 178173241 1 7 0 51 11 01 2 1 3 1

18、8 0 21 91 51 4 2 0 1 3 4八、900022 IJ.1.1.工J.1 1 7 8 2 1 6 2 2 叨23 2 3 7 41 9 3 44 3 7 孟U4 ，J，声 1 71 91 01 72 8 3 3 1 51 41 61 83 2 5 4 1 21 3 2 9 0114 巧只1 21272813 2435183731388 12252127 9 1 4 304l 9 1 6 3436 253020 1 1 3 4 5 3 0 9 6 8 2 5 1 9 2 4 2 6 1 7 2 6 1 5 5 8 1 2 1 7 1 7 ，JO了n， 4内J山.1 1 5 9 E

19、 V 6 1 4 1 4 1 7 9 1 2 3 1 8 2 4 1 0 6 A v - B g k 2 0. 71 1. 81 9. 62 3. 8 1 9. 95 6. 81 1. 51 0. 91 0. 8 1 0. 7 1 2. 83. 86. 01 7. 68. 62 8. 4 5. 25. 84. 74. 9 : 了2 2且 Cu t - o ff8 5. 3 8 9. 13 0. 84 9. 6 1 1 1 . 86 2 . 9 2 0 0 . 6 3 7 . 5 3 9. 93 3. 5 1 1. 1 4. 6 3 4. 13 5. 2 注( N o t e ) : A D V

20、 4 : A d e n o v ir u s 4 ( V R - 1 0 8 1 ) ; A D V 7 ( V R - 8 4 8 ) ; A D V 2 1 ( V R - 1 0 9 8 ) ; I N F A : A / W S / 3 3( H I N 1 ) ; I N F B : B / L e e / 4 0 ; P I V I 二 p a r a i n fl u e n z a v i r u s t y p e 1 ( V R - 9 4 ) ; ( V R - 1 1 1 9 ) ; E V P I V 3 ( V R - 9 3 ) ; R S V : r e s

21、p i r a t o r y s y n c y t i a l vu7 ust y p e B ( V R - 1 4 0 1 ) ; C V A : C o x s a c k ie v i r u s A 2 1 ( V R - 8 5 0 ) ; C V B B 4 ( V R - 1 8 4 ) ; R h v : R h i n o v i r u s 9 : E c h o v ir u s I I ( V R - 1 0 5 2 ) ; E N T : e n t e r o v i r u s e s ( i n c l u d i n g C V A , C V B ,

22、R h V , E V ) ; C P N : C h l a m y d ia p n e u m o n i a e ; M P N A v - B g k : t h e a v e r a g e b a c k g ro u n d s i g n a l s o f t h e n e g a t i v e r e s u l t s ; s : T h e s t a n d a r d d e v i a t i o n o f t h e s e n e g a t i v e r e s u l t s ; C u t - o f f : A v - B g k d e

23、v i a t i o n. M y c o p l a s m a p n e u m o n i a e ; p l u s 5 t i m e s t h e s t a n d a r d 中华实验和临床病毒学杂志2 0 0 6 年6 月第2 0 卷第 2 期C h iJ E x p C l i n V i ro l , J u n e 2 0 0 6 , V o l 2 0 , N o . 2 1 9 表 2 Ta b. 2 病毒标本 S a m p l e s M D D 方法检测混合呼吸道病毒的特异性 S p e c i f i c i t y o f m u l t i p l

24、 e p a t h o g e n s i n o n e s a m p l e 平均荧光强度值M e a n fl u o r e s c e n c e i n t e n s i t y ADVCP NMP NI NF AI NF B PI V- 1 P I V- 3RS VS ARS IS ARS 2S AR S 3EN T ，二.卫几 山.1由1.1 02门j，卫 山.J.1 0，1.16 .二11 b l a n k ADV - 7 / R S VB / I NF B 1 81 2 1 8 2 3 1 0 7 1 8 4 5 1 3 9 9 5 8 气乙n 山卫勺1 3 2 1

25、 4 8 2 1 6 6 5 3 2 1 4 5 8 2 7 1 0 7 1 1 1 1. 7 1 8 1 5 1 9 1 71 2 加 1 6 1 1 1 7 6 3. 4 1 7 9 91 5 6 031 6 2429283119 1 2 2 2 1 3 3 5 8 3 0. 6 4 9. 7 1 3 7 3 9. 5 1 6 3 3. 8 353039832618593 A D V- 2 1 / R S VB / I N F B Rh v / P I V- 1 S AR S / I N F B ADV- 7 / P I V- 1 I NF A/ I NF B C u t - o ff 1

26、 6 8 5. 13 3. 83 4. 0 1 9 3 5 . 5 4.1 月.孟月.几 内乙 . 405内j7 ，1.且，.山.3 45615351414970200 O口 25232321巧181788 注( N o t e ) : I N F A : A 3 / 闽防( f u j i a n ) / 4 1 1 / 2 0 0 2 ( H 3 N 2 ) ; I N F B : B / 沪防( s h a n g h a i ) / 3 6 1 / 2 0 0 2 表 3 T日 b. 3 毒株 M D D方法检测各病毒的敏感性 T h e S e n s i t i v i t y o

27、 f t h e a s s a y s y s t e m 平均荧光强度值M e a n fl u o r e s c e n c e i n t e n s i ty ADVCPNMP N I NF AI NF B P I V- 1 PI V- 3RS VS ARS1S ARS 2S ARS 3ENT b l a n k1 3士1 . 8 3 414. 68士2. 62 7士2. 5 3 3士4. 8 1 4士4. 4 7 717. 19士0. 5812. 05士1 . 31 011 . 28士 1 . 8 ADV士1 1 5 4 2士2 . 6 1 3士2. 8 3 1士4. 5 2 1

28、士2. 3 2 3士4. 1 8 5士6. 71 3士31 4士81 4士4. 8 1 215 . 6 2 013 . 6 士6 5 . 2 4 2土0 . 5 1 6土3 . 8 3 4土5. 1 2 8士8 . 4 2 5士2 . 8 7 1 士1 8 . 5 1 6士7 . 6 1 3士2 . 4 1 2土2 . 5土1 0. 9 2 7士3. 3 3 3士5. 5 2 0士4. 4 3 1士6. 5 1 8士9. 5 2 7士0. 9 6 8士1 21 6土7. 2 1 8士3. 0 1 6土2. 5 1 3士5. 1 巧 士7. 7士5. 7 I NF A1 6士4. 6 3 9士6

29、. 0 1 7土2. 6 3 8 0士8 5 4 1士2. 8 2 0士4. 0 9 2士9. 0 1 3士4. 4 1 1士2. 0 1 1士3. 5 1 2土4. 4士4. 0 141617131613 1 5士4. 6 4 4士2. 6 1 1土0_ 9 1 41士5 6 2 4士3. 0 1 3士1. 9 7 5士8. 0 1 7土 1. 27士2. 01 2土3. 6 1 311 . 3 2 615. 57土0. 97 8土2 . 6 1 9士4. 6 1 9士2 . 6 4 4士5 . 1 1 7土4 . 2714. 96士 1. 5 1 1土4. 5 1 5士3. 5 土4. 5

30、 士4. 5 1 7士5. 6 3 0士5. 9 1 3士 1 . 3 3 2士3. 81 7士3. 8 4 3士4. 4 1 3士1. 2 1 3士2. 31 114. 5 1 115. 7土5. 0 0e20e:0el韶0e50e:0e娜oe20e:Del叼oe30e:oel叼0e30e20el0e30e20el I NF B1 2土0. 8 3 0士2. 09土y_ 131土4. 8 1 3士1 0 2 3 9土5 72 0士1 . 3 5 2土3. 8 1 2土2. 6 1 1士3. 5 1 213. 0 1 2土3. 2 1 2土7 _ 5 1 3士3. 0 3 2士2. 6 1 3

31、士2. 1 2 4士4. 4 2 0士0. 8 1 9士3. 0 5 2士9. 0 1 2士2. 5915. 81 2士5. 1 1 3士3. 39士3. 8 1 6士4. 0 3 2士5. 2 1 2士5. 1 2 5士6. 0 2 2土0. 6 1 8士1 . 3 6 1士9. 1 1 3士4. 4 1 2土0. 59士6. 31 4士3. 1 1 5土2. 8 : t 4. 4 3 6士7. 18士4. 32 8土 1 . 03 7士1 01 4土2. 5 8 0 t 1 41 1士2_ 69士8. 35士2. 51 2 t 3. 5 1 2土4. 0 l7l7 P I V- 3士5.

32、5 士3. 1 5 6士6. 9 1 1土7. 8 3 4土7. 2 1 9士3. 1 2 8士6. 4 2 6 4士3 11 6士4. 4 1 2土7. 47土4. 31 4士5. 7f 1 0 6 7士3. 0 1 5士6. 0 3 8士3. 2 1 2士1 . 7 2 2土8. 8 2 6 0士4 4 1 3士2. 59土1 . 51 4土6. 4 1 2 t 2. 0土5. 8 土2. 6 t 4. 0 6 710. 4 5 7 t 2 7. 6 1 1士4. 6 3 0士6. 6813. 82 9士7. 51 8 0士91 6士2. 8 1 7士6. 19士3. 51 4土4. 59

33、士4_ 8 1 4士0. 6 3 3士1 . 3 1 6士2. 1 3 3士2. 5 1 4 7土9 7 1 4士6. 69士4. 69士1 . 31 3士5. 0 1 311 . 8 15112314181 S ARS士1 . 5 士8. 5 2 8士1 . 0 3 3士4. 5 1 4士1 . 5 2 0 t 1 . 5 3 4士2. 0 2 4士5 . 0 3 1士0. 5 1 8土1 . 2 1 7 9 0士2 7 6 1 5 9 0士1 6 t 2. 3 1 5士1 . 0 1 5士1 . 8 2 8士3 . 5 2 9士4. 0 3 2士0. 8 1 9士1 . 51 1 9 2士

34、 3 0 6土3 1 2 1 6 t 3 5. 8 1 21 1 . 0 6668气、U ，1，1立1山.1飞，J 4 7士5. 8 2 6士1 . 5 1 5土2 . 0 1 7土4. 0 1 9士1 . 5 2 7士0. 8 3 0士0. 5 1 6土1 . 0 1 0 8 8 t 1 5 7 3 3 8士 1 41 5 2 2 18 6士3 31 1土 1. 5 11 61 61 1 . 5 士3. 4 7 8 2士5 0 2ll0 Rh v 2 811 8 1 211. 3 1 9士3. 0 1 1土3. 0 2 0士2. 8 1 3士3. 8 2 1士3. 5 3 2士4. 0 1

35、2士2. 84 7士418 6 1 3 01 1 . 78士4. 02 8士3. 6 2 0士4. 7 1 4士4. 1 7 2士9. 0 1 2士2. 3812. 17士2. 8 1 1 士2. 6 3 0士6. 3 1 1土0. 3 1 9土5. 5 1 3士1 . 2 1 8士4. 3 5 8士2 . 09士2. 11 0士3. 88士1 . 06土2. 5 1 1 8士1 4. 6 1 1士5. 1 3 2士3. 8 1 7士5. 5 2 4土3. 5 2 0土2. 8 2 2士0. 6 6 2士6. 1 1 2士 1 . 09土4. 01 011 . 5 1 1土4. 0 2 013

36、. 8 C u t o f f 5 3 . 5 9 9 . 5 3 3 . 6 6 2 . 2 6 5 . 7 5 0 . 9 1 8 0 . 2 3 2 . 9 3 2 . 4 3 0 . 0 3 1 . 5 4 5 . 7 注( N o t e ) : I N F A : A 3 / 闽防( f u j i a n ) / 4 1 1 / 2 0 0 2 ( H 3 N 2 ) ; I N F B : B / 沪防( s h a n g h a i ) / 3 6 1 / 2 0 0 2 中华实验和临床病毒学杂志2 0 0 6 年6 月第 2 0 卷第 2 期J E x p C l i n

37、 V i rol , J u n e 2 0 0 6 , V o l 2 0 , N o . 2 3 讨论 急性呼吸道感染绝大多数是由病毒引起的， 检 测病毒感染的常用方法有如下几种: 病毒分离培养 最为经典， 但不利于病毒的快速诊断; 血清学诊断较 快， 但需要已知的特异的抗原或抗体成分， 而造成呼 吸道感染的病毒有几百种， 目前市场尚不能满足该 抗原抗体需求; R T - P C R方法敏感性强、 特异性高， 在 病毒的核酸检测中具有较高的实用价值1 3 ,4 1 。但是 传统的R T - P C R法通常一次只能从标本中检验出一 种病毒， 对于尚不明确的病毒感染无异于大海捞针! 在本研究

38、中， 我们将一种新型的T e m - P C R扩增技术 和x M A P 技术整合在一起， 整个检测可在4It内完 成。 M D D检测系统具有多重性， 提高了病毒的检出 率， 即在一次检测过程中， 可对多种可能引发急性呼 吸道感染的病原体进行同时检测， 达到快速诊断、 指 导治疗的目的15 1 ， 从而克服常规P C R的局限性， 缩 短工作时间， 减少原料耗损。在传统的多重扩增方 法中， 存在很多的缺陷， 因为每条不同的靶序列都具 有各自的最佳扩赠条件， 很难将其统一。此外， 多重 P C R 扩增总存在非特异性的扩增和( 或) 不平衡扩 增。同时， 大量过剩的引物能抑制 P C R反应

39、和降低 敏感性， 经标记的引物在高浓度时容易产生二聚体， 在扩增中造成高的背景。T e m - P C R方法采用一种新 颖的引物设计方式与扩增途径， 巧妙地绕过了这个 瓶颈。在扩增多重靶序列的过程中只需要使用一对 通用引物( 称超级引物) ， 并且只有反向超级引物进 行了标记， 在保持了特异性与灵敏度的同时也降低 了背景。x M A P 技术平台是一种高效的分子检测手 段， 它的灵敏性、 特异性及可重复性都得到了很好的 验证6 -8 1 。在、 M A P 技术中， 分子在颜色编码的微球 表面进行反应。对于每一种病原体， 靶序列特异的 捕获探针与一组颜色编码的微球之间形成特异的共 价结合。在

40、杂交悬浮体系中， 标记的P C R产物被结 合有微球的探针捕获， 再经过一套微流体系统检测 装置， 红色激光用于微球分类， 识别病原体; 绿色激 光识别每类微球上的绿色荧光信号， 并报告平均荧 光强度值( M F I ) ， 从而显示特定病原体的有无。 本试验分析了M D D系统检测几种常见呼吸道 病毒的特异性和敏感性， 从实验结果分析， 该检测方 法对各病毒标本的检出率为 1 0 0 %。在灵敏度方 面， 绝大多数病原体检出 率为1 0 e 2 ( p f u / m l ) ， 而S A R S 最敏感， 检出率能达到1 0 e 1 ( p f u / m l ) 。本实验证实 了此检测技

41、术的可行性。该 M D D系统可应用于常 见呼吸道病毒的检测， 能准确、 高效地诊断出病原体 种类， 有利于协助诊断病毒引起的病毒性呼吸道感 染。 参考文献 1张梓荆， 主编. 小儿病毒性呼吸道感染与病毒性肺炎. 北京: 中国 医药科技出版社， 1 9 9 0 , 4 . 2 E l n i f ro E M, A s h s h i A M, C o o p e r R J , e t a l . M u l t i p l e x P C R : o p t i m i z a t i o n a n d a p p l i c a t i o n i n d i a g n o s t

42、i c v i r o l o g y . C l i n M i c ro b i o l R e v , 2 0 0 0 , 1 3 : 5 5 9 - 5 7 0 . 3 R o b e rt L , A t m a r , B a r b a r a d D , e t a l . C o m p a r i s o n o f re v e r s e t r a n s c r i p t i o n P C R w i t h t i s s i u e c u l t u re a n d d o t h e r a p i d d i a g n o s t i c a s

43、s a y s f o r d e t e t i o n o f t y p e A i n fl u e n z a v i r u s 9 . J C l i n M i c ro b i o 1 , 1 9 9 6 , 1 0 : 2 6 0 4 - 2 6 1 0 . 4 P o d d a r S K , E s p i n a R , S c h n u r r D P . E v a l u a t i o n o f a s i n g l e s t e p m u l t i p l e x R T - P C R f o r i n f l u e n z a v i

44、r u s t y p e a n d s u b t y p e d e t e c t i o n i n re s p i r a t o ry s a m p l e . J C l i n b 山A n i m a l , 2 0 0 2 , 1 6 : 1 6 3 - 1 6 6 . 5 l a n n o n e M A . M i c r o s p h e r e - b a s e d m o l e c u l a r c y t o m e t ry. C l i nL 山M e d , 2 0 0 1 , 2 1 : 7 3 1 - 7 4 2 . 6 D a s s

45、 o J , L e e J , B a c h H , e t a l . A c o m p a r i s o n o f E L I S A a n d fl o w m i c ro s p h e r e - b a s e d a s s a y s f o r q u a n t i f i c a t i o n o f i m m u n o g l o b u l i n s . J I m m u n o l Me t h o d s , 2 0 0 2 , 2 6 3 : 2 3 - 3 3 . 7 M a n d y F F , N a k a m u r a T

46、, B e r g e ro n M , e t a l . O v e r v ie w a n d a p p l i c a t io n o f s u s p e n s i o n a r r a y t e c h n o l o g y , C i i n L a b M e d , 2 0 0 1 , 2 1 : 7 1 3 - 7 2 9 . 8 S p i ro A , L o w e M . Q u a n t i t a t i o n o f D N A s e q u e n c e s i n e n v i ro n m e n t a l P C R p ro d u c t s b y a m u l t i p l e x e d , b e a d - b a s e d m e t h o d . A p p l E n v i ro n M i c ro b i o l , 2 0 0 2 , 6 8 : 1 0 1 0 - 1 0 1 3 . ( 收稿日 期: 2 0 0 6 - 0 3 - 1 3 )