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1、 （） （） In vitro， （）- - （- ） - Results - ， - - - - ， ， - ， - ，（ ） - in vitro Conclusions - - - ， Key words：； - ； ； ； 氯化两面针碱的抗肝癌活性及对 DNA 拓扑异构酶的影响 刘丽敏，刘华钢 （广西医科大学药学院，广西 南宁 ） 中国图书分类号：- ； 畅 ； 畅 ； 畅 畅 ； 畅 畅 文献标识码： 文章编号： （） 摘要：目的 研究氯化两面针碱对肝癌 裸小鼠移植 瘤的抗肿瘤作用及对 拓扑异构酶（）活性的影响。 方法 建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，观察氯化两面针碱 的肿瘤抑制作用。
2、 以 为底物，采用琼脂糖凝胶 电泳检测氯化两面针碱对 介导的 解旋 反应的影响，以及对 是否具有直接断裂作用。 结果 氯化两面针碱 畅 、 和 剂量对肝癌 的抑制率分别为 畅 、畅 和 畅 ，氯化 两面针碱在 畅 时可完全抑制 的催化活 性，在 时完全抑制 的催化活性。 结论 氯化两面针碱具有较为明显的抗肝癌活性，对 活性的抑制可能是其作用机制之一。 关键词：两面针；氯化两面针碱；肝癌；裸小鼠；抗肿瘤； 拓扑异构酶 收稿日期： ，修回日期： 基金项目：国家自然科学基金资助项目（ ）；广西科学研 究与技术开发计划项目（ 桂科攻 - ） 作者简介：刘丽敏（ ）女，博士，研究方向：抗肿瘤中药药理作
3、用及机制，- ： ； 刘华钢（ ），女，教授，博士生导师，研究方向：中药 新剂型、新制剂及中药药 理作 用机制，通 讯作 者，： - ，- ： 氯化两面针碱（ ，）是从广西 特有药用植物两面针Zanthoxylum nitidum（） 的根中分离到的具有抗肿瘤活性的生物碱，本 课题组前期研究已证实， 在体外对肝癌细胞有很 好的抑制增殖作用，而且 对小鼠 肉瘤有较 强的抑制作用，可以延长腹水型 肝癌模型小鼠 的生存时间 ， 。 拓扑异构酶（）在细胞代 谢过程中起着重要的作用，已被确定是多种抗肿瘤 药物的有效靶点。 为研究 的抗肝癌作用，本实 验采用人肝癌 裸小鼠移植瘤模型，探讨 对肝癌移植瘤生长
4、的影响，并以 为靶点，研究 对 的抑制作用，阐明其可能的抗肿瘤作用 机制。 1 材料与方法 1 1 试剂和仪器 由广西中医药研究院赖茂祥 研究员分离提纯（纯度 ）；阳性对照药环磷酰 胺（）： 江苏恒瑞医药股份有限公司 （批号 ）；羟基喜树碱（）：黄石李时珍药业 有限公司（批号 ）；鬼臼乙叉苷 （- ）： 江苏恒瑞医药股份有限公司（批号 ）；质粒 ： 公司； ： 公司； ：美国 公司；培养箱：美 国 公司；超净工作台：苏州净化 设备厂；倒置相差显微镜：日本 公司；- 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin ；26（）： D 口U “踯q 0了寸e8J O
5、】5I 寸 低压电泳仪：北京六一仪器厂； 凝 胶成像分析系统：美国 - 公司。 1 2 实验用细胞及动物 人肝癌 细胞株购 自中国科学院上海细胞库，由广西医科大学药学院 实验室传代保存。 裸小鼠（ ）为 级， ，体重 ，各半，购至中国科学院上海 实验动物中心斯莱克实验动物有限公司，实验动物 合格证为：（沪）- 。 裸小鼠饲养于广 西医科大学实验动物中心 级条件下， 采 光， 黑暗，恒温，饲料和水经消毒后方能使 用。 实验均严格按照动物实验室有关条例进行。 1 3 肝癌 HepG2 裸小鼠移植瘤模型的建立及检测 指标 参考文献 ，取对数生长期 细胞，胰 酶消化后，用 洗涤两次并混悬，镜下计数，调
6、整 细胞密度为 ，取 畅 接种于裸小鼠 右侧腋窝皮下，共接种 只。 用游标卡尺测定移植 瘤直径，当肿瘤体积达到 时，将动物 随机分组。 于接种后 开始用药，为实验观察的 。 分别设阴性对照组（腹腔注射生理盐水 ） 高、中、低剂量组（分别腹腔注射 、 、畅 ）阳性对照组（腹腔注射 ），每组 只。 以上均每日给药 次，共给 药 。 实验重复 次。 给药期间每隔 测量肿 瘤最长径（）和垂直径长（），计算肿瘤体积（）、 肿瘤相对体积（）、相对肿瘤增殖率 （）， 绘制生长曲线。 给药结束后，次日处死全部动物，剥 离瘤块，生理盐水冲洗，滤纸吸干后称重，计算抑瘤 率，抑瘤率（） （阴性对照组平均瘤重 实验组
7、 平均瘤重） 实验组平均瘤重 ， ， V V， （） ，V为实验结束时肿瘤体积，V为肿瘤初始体 积。 1 4 NC 对DNA Topo催化活性的影响 参考文 献 ，采用质粒 解旋反应。 在 反应 缓冲液（ - ， 畅 ， ， ， ， 畅 ， ）中加入 畅 、 及不同的受试物，包括 阳性对照 及不同浓度的 ，并加灭菌三蒸水 至 ，反应 。 反应后加入 终止液 （含 和 ）终止反应， 继续孵育 。 孵育后加 上样缓冲 液，在 畅 琼脂糖 缓冲液中电泳， 约 。 电泳后用 缓冲液配制的 畅 室温染色 ，凝胶成像系统观察电泳条 带并拍照。 实验重复 次。 1 5 NC 对DNA Topo催化活性的影响
8、 采用质 粒 解旋反应。 在 反应缓冲液（ - 畅 ， ， ， ， ， ， ） 中加入 畅 、 及不同的受 试物，包括阳性对照 - 及不同浓度的 ，并加 缓冲液至 ，反应 。 加入 终 止液（含 和 ）终止反 应，继续孵育 ，电泳、染色及观察过程同 “畅 ”。 实验重复 次。 1 6 统计学处理 所有数据用珋x s 表示，用 畅 行单因素方差分析。 2 结果 2 1 NC 对肝癌裸小鼠移植瘤生长的抑制作用 接种 可见皮下肿瘤生长，出瘤率 ，移植瘤 多呈圆型，实质性，呈局限性膨胀生长，表面凹凸不 平，呈多个结节融合状。 肿瘤组织为淡红色鱼肉状， 瘤块较大的表面可见增粗的血管网分布，解剖后可 见部
9、分肿瘤组织浸润至肌肉和肋骨。 实验中各组无 例死亡。 实验结果表明，给药后 中、高剂量组 肿瘤生长曲线、肿瘤体积、平均瘤重均低于生理盐水 对照组，其中高剂量组 （ ） 对肝癌 裸小鼠移植瘤有较明显的生长抑制作用，与 阳性对照药 （ ）的抑瘤率、相对肿 瘤增殖率（ ）相当（ ）。 Fig 1 The growth curve of HepG2 transplanted of nude mice treated by NC 2 2 NC 对 DNA Topo活性的抑制作用 在体外可使 双链中的单链断裂，使另一单链从 缺口处穿过，从而可催化超螺旋的 松弛解旋。 如 所示，泳道 是负超螺旋 （- 中国
10、药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin ；26（） _ _ _ _ 一一 _ Tab 1 Inhibitory effect of nitidine chloride to the tumor weight of human hepatocellular transplanted tumor in nude mice（珋x s，n ） - - 破 L 晻 3破 L 晻 倡倡B 鼢 破 晻 B 鼢 破 L 晻 倡B 3谮 L 晻 倡倡B 倡P 畅 ，倡倡P 畅 vs Tab 2 Influence of nitidine chloride to the tu
11、mor volume of human hepatocellular transplanted tumor in nude mice（珋x s，n ） - - 破 晻 拻 3破 L 晻 倡倡B 鼢 破 L 晻 B 鼢 破 L 晻 倡B 3破 8 晻 倡倡B 倡P 畅 ，倡倡P 畅 vs ，）；泳道 是加 反应后，负超 螺旋全部消失转化为松弛型 （ ， ）；泳道 为阳性对照药 ，一种典型的 - 抑制剂，在浓度为 时完全抑制了 对 的解旋作用。 泳道 为 对 介导的负超螺旋 解旋作用的影 响， 在畅 时即开始抑制 的 活性，在 畅 时可完全抑制 的催 化活性。 随着 浓度的增加，被 解旋成松 弛型
12、的 逐渐减少，超螺旋 增多。 Fig 2 Effect of NC on Topo ： 畅 （- ） ：畅 ；： 畅 ； ： 畅 畅 ， 畅 ，畅 ，畅 ， （ ） 2 3 NC 对 DNA Topo活性的抑制作用 在 存在的情况下，可以使超螺旋的 转化为 解旋状态（），结果如 所示。 泳道 是负超 螺旋 （）；在泳道 中，仅有 作用时，超螺旋 大部分转化为解旋的 。 当反应体系中加入 抑制剂 后，解旋的 明显减少， 保持超螺旋状态，表明 的活性受到了抑制（泳道 ）。 同样， 也可以抑制 的活性，畅 即开始影响 - 对 的解旋作用，随着 作用浓度的增 高，解旋的 明显减少，当 的作用浓度达到
13、时，完全抑制了 的活性。 Fig 3 Effect of NC on Topo ：畅 ；： 畅 ； ： 畅 畅 ，畅 ，畅 ， （ ）；： 畅 （ ） 3 讨论 本实验中我们采用人肝癌 裸小鼠移植 瘤模型评价 的体内抗肝癌作用。 作为抗肿瘤活 性评价指标，当中药的瘤重抑瘤率 ，连续数次 疗效稳定，或肿瘤增殖率 ，并经统计学 处理差异有显著性时，则评定此药具有体内抗肿瘤 作用 。 我们的研究结果表明 中、高剂量组的 瘤重明显低于生理盐水对照组。 高剂量组的抑 瘤率为 畅 ， 为 畅 ，与 组疗效相 近。 可认为 对人肝癌 裸小鼠移植瘤具有 一定的治疗作用。 中国药理学通报 Chinese Pha
14、rmacological Bulletin ；26（） 拓扑异构酶是一种重要的核酶，包括型 （） 和型（），通过 链断裂和重 接而改变 的拓扑结构，调节其空间构型变化， 在细胞生长过程中起重要作用，该酶被列为筛选抗 肿瘤药物的重要靶酶 。 本研究以从小牛胸腺组 织提取的商品化 、为模型，以 为底物，采用琼脂糖凝胶电泳测定 对 催化活性的影响。 结果显示， 可以明显抑 制 、的催化活性，并呈现出较好的量 效关系， 对 的作用略强于对 的 作用， 可能是其细胞毒活性的靶点之一。 由于肿瘤细胞具有快速增殖的特性， 复制、转 录频繁，其拓扑异构酶的含量及活性远远高于正常 体细胞，尤其是 - 的表达有增
15、殖依赖性 。 因此抑制拓扑异构酶活性能起到阻止肿瘤细胞快速 生长增殖，进而杀死肿瘤细胞的作用。 属于苯骈 菲啶类生物碱，文献报道 可以很好的与小牛 胸腺 结合，是通过经典的非共价插入方式与 碱基对发生作用。 推测其嵌入 后可能与 和 的复合体发生作用，阻断由 介 导的单链断裂修复作用，导致单链断裂的错误修复 或是由于可断裂复合物的形成及稳定存在，进而影 响 的复制，激活了细胞内一系列导致细胞死亡 的过程，细胞发生凋亡或坏死，从而抑制肿瘤生长。 参考文献： 刘丽敏，刘华钢，杨 斌，罗 丹 氯化两面针碱对小鼠腹水型 肝癌的抑制作用及机制研究 中国药理学通报， 24（）： ， ， ， - Chin
16、Pharmacol Bull，24（）： 刘丽敏，刘华钢，罗 丹 氯化两面针碱体内和体外的抗肿瘤 作用 中国药理学与毒理学杂志，23（）： ， ， in vitro in vivo Chin J Pharmacol Toxicol，23（）： 张 锐，徐华丽，于小风，等 （）- 原人参二醇对 - 细胞体内外作用的研究 中国药理学通报，24（）： ， ， ， （）- - in vivo in vitro Chin Pharmacol Bull，24（）： 杨益东，陈业高，吴 慧，等 - 的抗肿瘤效应及对 拓扑异构酶的影响 中国药理学通报，25（）： ， ， ， Chin Pharmacol Bu
17、ll，25（）： 刘建文主编 药理实验方法学 新技术与新方法 ， 北京：化学工业出版社， Pharmaco- empirical method- new technique and method ： ，： ， - - Oncogene，22（）： ， ， ， - Anticancer Res，21（）： ， ， ， - ， Bioorg Med Chem， ，14（）： Anti- hepatoma activity of nitidine chloride and its effect on topoisomerase - ， - （Pharmacy College of Guangxi Medical University，Nanning ，China） Abstract：Aim - （） - Methods - - - - Results - ， 畅 ， ， 畅 ， 畅 畅 - 畅 ， ； ， - Conclusion - ， - - - Key words：Zanthoxylum nitidum（）； ； ； ； - ； 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin ；26（）