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1、作者单位： 210029 南京医科大学附属南京脑科医院研究所 （刘 阳、 张石宁） ， 神经内科 （张颖冬） 基础实验诊断研究 毛细管区带电泳测定血浆中丙戊酸钠浓度 刘阳 张石宁 张颖冬 【摘要】 目的 建立毛细管区带电泳测定血浆中丙戊酸钠的方法。方法 血浆标本经 HCl 酸 化， 正己烷萃取， 再以 NaOH 溶液反提取丙戊酸钠。采用 75 m （id）37 cm 石英毛细管柱分离。电 泳缓冲液为 15 mmol/ L pH 5. 7 水杨酸钠溶液 （含 0. 5 mmol/ L CTAB， 15% 乙醇） ， 分离电压 20 kV， 电 泳时间 6 min， 温度 20， 阴极压力进样 5
2、 s， 阳极检测， 波长 214 nm。结果 血药浓度线性范围 25 200 g/ ml， r =0. 999，最低检测浓度0. 35 g/ ml （S/ N =3） ， 萃取回收率87. 4%， 方法回收率100. 1%， 日内、 日间变异系数 （CV） 分别小于 4%、 6%。结论 本方法可以简便、 快速、 灵敏地测定血浆中丙戊 酸钠浓度。 【关键词】 丙戊酸钠； 血药浓度； 电泳， 毛细管 Determination of sodium valprate in plasma by capillary zone electrophoresis LIU Yang，ZHANG Shi-ning
3、，ZHANG Ying-dong. Nanjing Brain Hospital， Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China 【Abstract】 Objective To establish a rapid determination of sodium valprate in plasma by capillary zone electrophoresis. Method Plasma was acidized by 1 mol/ L HCl，VPA was extracted into organic phase （n-Hexane）
4、 ，then re-extracted into aqueous phase（0. 05 mmol/ L NaOH solution including 15% Ethanol） . Capillary clone was 75 m （id）37 cm. Electrolyte consisted of 15 mmol/ L sodium salicylate， 0. 5 mmol/ L CTAB and 15% Ethanol（pH 5. 7） . Separating voltage was 20 kV，detection wave was 214 nm，temperature was 2
5、0， injection time was 5 s by press in negative. Result The linear ranger of concentration for standard drug was between 25 200 g/ ml （ r = 0. 999 ） ，the limit of detection was 0. 35 g/ ml， the average recovery of VPA was 87. 4%， the average inter-day and intar-day CV were less than 4% and 6%. Conclu
6、sion This method is simple，rapid，reliable and correct，for determination of VPA in plasma. 【Key words】 Sodium valprate； Plasma concentration； Electrophoresis， capillary 丙戊酸钠 （VPA） 是临床常用抗癫痫药物， 临床 常监测其血浆浓度。目前的检测方法有： 气相色谱 法 1、 薄层色谱法2、 散射免疫比浊法3、 荧光偏振 免疫法 4、 高效液相色谱法5。这些方法存在需要 特殊设备、 特定试剂盒、 柱前衍生化、 操作时间长、 成
7、本高的缺点； 本研究建立了毛细管电泳测定血浆中 丙戊酸钠的方法， 具有简便、 快速、 灵敏、 经济的特 点， 可以作为血浆中丙戊酸钠浓度测定的常规方法 之一。 材料和方法 1. 仪器：P/ ACE5010 毛细管电泳仪、 UV 检测 器 （美国 Beckman 公司） ， 石英毛细管 （河北永年光 导纤维厂） 。 2. 试剂：电泳缓冲液： 15 mmol/ L pH 5. 7 水杨 酸钠溶液 （含 0. 5 mmol/ L CTAB， 15% 乙醇溶解） 。 丙戊酸钠标准液： 6 000 g/ ml 的标准液 （ 美国 Sigma 公司，15% 乙醇溶解） 。丙戊酸钠反相萃取 液： 0. 05
8、 mmol/ L NaOH 溶液 （含 15% 乙醇） 。空白 血浆 （上海生物制品研究所） 。正己烷。 3. 电泳条件： 石英毛细管 75 m （id）37 cm， 分离电压20 kV， 电泳时间6 min， 阴极压力加样5 s， 阳极检测， 波长 214 nm， 实验温度 20， 电泳前分别 用 0. 1 mol/ L NaOH、 电泳缓冲液各冲洗 10 min， 每 个样品间以电泳缓冲液冲洗 2 min。 4. 标本处理： 在 1 ml 血浆中加入 0. 2 ml 1 mol/ L HCl 混匀酸化， 加入 2 ml 正己烷混匀 2 min， 6 000 r/ min 离心 5 min，
9、 将上层正己烷吸入一个尖 底试管中， 水相中再加 2 ml 正己烷； 同法操作， 合并 正己烷， 其中再加入 0. 5 ml 反相萃取液充分混匀后 3 000 r/ min离心 5 min， 取下层水溶液进样分析。 5. 标准品血浆标准曲线： 将 6 000 g/ ml 丙戊 461中华检验医学杂志 2006 年 2 月第 29 卷第 2 期 Chin J Lab Med， February 2006，Vol 29，No. 2 酸钠标准液用空白血浆稀释成 25、 50、 75、 100、 150、 200 g/ ml 浓度系列溶液。按 “4. 标本处理” 方法 处理后， 进行分析， 以峰面积
10、Y 对浓度 X 作线性回 归， 得标准曲线 Y =593. 5 X +1 030. 3， r =0. 999 。 结果 1. 色谱图： 口服丙戊酸钠 1. 0 g/ d 剂量治疗的 患者， 早晨 8： 00 抽取当日服药前静脉血 3 ml， 肝素 抗凝， 离心分离 1 ml 血浆， 按上述方法处理、 检测， 丙戊酸钠峰迁移时间 3. 790 min， 峰形尖锐对称， 无 杂峰干扰， 本方法具有良好专属性， 结果见图 1。 丙戊酸钠峰迁移时间 3. 790 min 图 1 毛细管电泳测定血浆中丙戊酸钠电泳图 2. 线性范围、 最低检测限： 在 25 200 g/ ml 血浆浓度范围内 r = 0
11、. 999， 以信噪比 （S/ N）= 3 计 血浆中丙戊酸钠最低检测浓度为 0. 35 g/ ml， 本方 法具有良好的线性和灵敏度。 3. 回收率试验： 用含丙戊酸钠 25、 50、 150 g/ ml 3 个浓度的血浆样品按上述方法进行处理测 定， 得峰面积。将该峰面积与相应浓度的标准品峰 面积比， 计算萃取回收率； 将该峰面积代入标准品血 浆标准曲线计算浓度与实际浓度比， 计算方法回收 率， 结果见表 1。 4. 精密度试验： 用含丙戊酸钠浓度为 25、 50、 150 g/ ml 的 3 份血浆， 1 d 内每份标本分别测定 5 次， 计算日内变异系数； 每个标本连续5 d， 计算日
12、间 变异系数， 结果见表 1。 表 1 回收率与精密度试验结果 （n =5） 加入浓度 （g/ ml） 萃取回收率 （%） 方法回收率 （%） 日内变异 （%） 日间变异 （%） 2588. 6100. 43. 65. 3 5087. 3101. 23. 25. 0 150 87. 298. 83. 56. 0 5. 干扰试验： 在含有丙戊酸钠 75 g/ ml 的血 浆中， 加入临床可能与之合用的药物苯妥英钠、 苯巴 比妥、 卡马西平各 10 g/ ml， 氯硝安定 20 ng/ ml， 按 上述方法检测均未见吸收峰， 另外血浆中内源性物 质蛋白质、 氨基酸未见明显干扰。 讨论 丙戊酸钠 （
13、pka 4. 6） 在 pH 5. 7 溶液中丙戊酸钠 解离呈离子状态， 其本身无紫外吸收， 不能以 UV 检 测器直接检测， Jin 等 6以 LIF 检测器检测成本高、 操作繁琐， 所以我们选择毛细管区带电泳分离， 间接 紫外检测法测定。 水杨酸钠缓冲液常用于有机酸根检测 7， 阴性 丙戊酸根离子向阳极泳动， 在缓冲液中加入 0. 5 mmol/ L CTAB （CMC =9 10 -4mol/ L） 使电泳与电渗 方向一致， 阴极加样阳极检测。 直接以 pH 5. 7 溶液进行电泳出峰略快， 但是电 流大基线不稳， 分离效果差， 在缓冲液中加入 25% 甲醇或 15%乙醇可以对降低电渗流
14、、 减小电流、 稳 定基线、 提高分离效果起到同样作用， 但加入乙醇后 分离的丙戊酸钠峰形尖锐对称， 明显好于加入甲醇， 所以选择加入 15%乙醇。 其他条件不变， 在 214 nm 波长下， 比较 5、 10、 15、 20、 25 mmol/ L 4 种水杨酸钠溶液对相同浓度丙 戊酸钠的峰面积影响， 发现 15 mmol/ L 时峰面积最 大， 所以选择 15 mmol/ L 水杨酸钠溶液。 缓冲溶液在 16 24 kV 之间电流随电压升高而 增大， 符合欧姆定律。在不影响分离效果的前提下 逐渐增加进样量以提高检测灵敏度， 最后选择压力 进样 5 s， 分离电压 20 kV。 Pucci
15、等 8以 pH 6. 0 苯甲酸溶液作为电泳缓冲 溶液， 我们将两种电泳缓冲溶液进行比较， 发现丙戊 酸钠在 pH 6. 0 苯甲酸溶液中迁移时间略快于在 pH 5. 7 水杨酸钠缓冲液中， 在分离效果、 线性范围、 灵 敏度方面二者差异无统计学意义， 但 pH 5. 7 水杨酸 钠缓冲液配制方便， pH 稳定无需调节， 各批缓冲液 间 pH 变异小， 所以选择水杨酸钠缓冲液。 Pucci 等 8用先甲醇沉淀、 再过滤的方法去除血 浆中蛋白， 滤液直接进样分析， 由于丙戊酸钠的蛋白 结合率 85%， 该方法使大量药物随蛋白质沉淀， 绝 对回收率较低， 并且因滤液中含甲醇浓度太高而影 响电泳分离
16、。 用 HCl 将血浆酸化后， 先以正己烷抽提丙戊 酸， 再用反相萃取方法将正己烷中的丙戊酸溶入碱 性水相中， 解决了挥发有机溶剂过程中丙戊酸损失 561中华检验医学杂志 2006 年 2 月第 29 卷第 2 期 Chin J Lab Med， February 2006，Vol 29，No. 2 多， 萃取回收率低的问题 （约为 21%） ， 萃取回收率 明显提高 （约为 87%） ， 另外反相萃取的方法不仅提 高了萃取回收率， 而且克服了直接吹干复溶后样品 中脂溶性杂质多的缺点， 所以选择先正己烷抽提再 反相萃取的方法提取。 分别以 0. 15、 0. 10、 0. 05 mol/ L
17、的 NaOH 溶液 （含 15%乙醇） 进行萃取， 比较发现以高浓度 NaOH 溶液萃取后， 电泳时丙戊酸钠峰扩散有拖尾现象， 而 以 0. 05 mol/ L 萃取后峰形尖锐对称， 峰高对浓度回 归 r =0. 993， 所以选择 0. 05 mol/ L 的 NaOH 进行萃 取。 参考文献 1郑惠良， 祁元明， 杨莹， 等. 血清丙戊酸钠浓度测定方法研究. 河 南医科大学学报， 1997， 32： 78-79. 2郭郁， 封宇飞， 姜文清， 等. 薄层色谱衍生测定丙戊酸钠血药浓 度. 中国医院药学杂志， 2001， 21： 475-476. 3金燕. 散射免疫比浊抑制法检测卡马西平、 丙
18、戊酸浓度. 中国医 院药学杂志， 2001， 21： 519-520. 4石磊， 钱军， 唐镜波， 等. 丙戊酸钠治疗癫痫的血药浓度监测. 中 国医院药学杂志， 2001， 21： 346-347. 5郝润喜， 闫彩萍. 高效液相色-柱前衍生法测定丙戊酸镁血药浓 度. 药物分析杂志， 1997， 17： 172-174. 6Jin LJ， Wang T， Li SF. Indirect laser-induced fluorescence detection of valproic acid in human capillary electrophoresis. Electrophoresis
19、， 1999， 20： 1856-1861. 7邓延倬，何金兰. 高效毛细管电泳. 北京：科学技术出版社， 1998. 256-276. 8Pucci V，Mandrioli R，Raggi MA. Determination of valproic acid （ 2-propylpentanoicacid ） inhumanplasmabycapillary electrophoresis with indirect UV detection. Electrophoresis，2003， 24： 2076-2083. （收稿日期： 2005-06-20） （本文编辑： 张莉） 作者单位： 5
20、18020 广东深圳市人民医院呼吸科 （陈升汶、 穆雪 !） ， 检验科 （卢月梅、 何林） ， 中心实验室 （张阮章、 王沙燕） 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌超广谱 内酰胺酶基因分型研究 陈升汶 卢月梅 张阮章 王沙燕 何林 穆雪! 产超广谱 内酰胺酶（ESBLs） 是临床肠杆菌科细菌对 内酰胺类抗生素耐药的重要机制。近年来国内外 ESBLs 在临床分离菌中的检出率快速上升， 其种类也不断增多。国 内报道以 CTX-M 和 SHV 型 ESBLs 最为常见 1， 2。为了较全 面了解本院大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株 ESBLs 的基因分型， 经本研究应用聚合酶链反应 （PCR） 及 DNA
21、 测 序方法， 对215 株产 ESBLs 临床分离株的 TEM、 SHV 和 CTX- M 基因进行分析。 一、 材料和方法 1. 菌株来源： 收集 2000 年 6 月至 2003 年 8 月我院临床 分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌无重复菌株共 535 株， 所 有菌株均经 VITEK-AMS 60 全自动微生物分析仪鉴定。采 用美国国家临床实验室标准化委员会 （NCCLS） 推荐的纸片 扩散表型确证方法 3， 筛选出 215 株产 ESBLs 菌株。 2. 细菌质粒 DNA 的提取： 所有产酶菌株采用传统碱裂 解法提取细菌质粒 DNA。方法参照 分子克隆实验指南 （第 2 版） 4。 3
22、. PCR 扩增： 采用的 PCR 引物及 PCR 条件反应按卢月 梅等 5报道。 4. PCR 产物的测序： 应用美国应用生物系统公司 ABI 377 自动 DNA 测序仪对 PCR 产物进行直接测序。DNA 序列 结果采用 BLASTN 软件网上与 GenBank 数据库进行比较查 询， 并分析氨基酸序列的改变。新型的变异基因序列经美国 Lahey 临床医学中心 George A. Jacoby 和 Karen Bush 教授确 认和命名， 并收录在网站 www. Lahey. org/ studies/ webt. htm， 新变异的基因序列在 NCBI GenBank 数据库进行注册。
23、 5. 统计学分析： WHONET 5. 1 软件。 二、 结果 1. ESBLs 检测： 共检出产 ESBLs 菌株 215 株， 阳性率 40. 2%， 其中大肠埃希菌 151 株， 肺炎克雷伯菌 64 株。 2. PCR 结果： 215 株产 ESBLs 菌株中， TEM 的阳性率为 40% （86/215） 。SHV 的阳性率为 26. 0% （56/215） ， 其中 2 株肺炎克雷伯菌 SHV PCR 扩增产物经测序后分别定型为 LEN-5 和 OKP-B-10。CTX-M1 组 PCR 扩 增 阳 性 22 株 （10. 2%） 。CTX-M2 组 PCR 反应未检出阳性株。CT
24、X-M3 组 PCR 阳性 163 株 （75. 8%） 。其中 5 株产 ESBLs 菌两组 CTX-M 基因 （CTX-M1 和 CTX-M3） 均为阳性， 显示同时携带 两种 CTX-M 型基因。 3. DNA 序列分析结果： 86 株产 TEM 酶菌大多数为大肠 埃希菌， 除 1 株为 TEM-19 型外， 其余 85 株均为 TEM-1 型。 56 株 SHV 基因阳性的产酶株中， 35 株为 SHV-12 型 （占 64. 9%） ， 7 株为 SHV-11 型， 6 株为 SHV-2a 型， 其他型的 SHV 酶较少见。同时， 在 1 株 SHV 基因阳性株中发现了 1 种新型的酶 SHV-59 （GenBank 注册号为 AY790341） ， 相关报 道见文献 6 。另外， 有 2 个 SHV 基因 PCR 产物经 DNA 测 序后发现为新基因亚型， 经 George A. Jacoby 教授确认后分 别命名为 LEN-5 （GenBank 注册号 AY633109） 7和 OKP-B- 661中华检验医学杂志 2006 年 2 月第 29 卷第 2 期 Chin J Lab Med， February 2006，Vol 29，No. 2