汉坦病毒S基因毕赤酵母表达系统的构建.pdf

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1、文章编号： 1 0 0 2 - 2 6 9 4 （2 0 0 6） 0 1 - 1 1 - 0 4 汉坦病毒S基因毕赤酵母表达系统的构建* 魏骏飞1， 徐昭1， 李力2， 王志锐2， 杨东靖2， 陈锦英1 摘要： 目的构建汉坦病毒H T N型和S E O型S基因毕赤酵母表达系统。方法应用R T - P C R法扩增汉坦病毒Z 1 0株 和L 9 9株编码核蛋白的S基因， 将扩增产物分别与p G E M - T - E a s y载体连接， 经序列分析后双酶切， 分别定向克隆入载体 p P I C Z A和p P I C Z C， 继而将重组质粒以S a c线性化并电转化入毕赤酵母X 3 3感受

2、态细胞， 用Z e o c i n筛选高拷贝转化子进 行鉴定。结果 P C R扩增产物约为1 2 9 0 b p， 与T载体相连测序结果与G e n b a n k相应序列比较， 核苷酸序列同源性分别为 9 9 . 8 4 %和9 9 . 9 2 %， 其编码蛋白质二级结构均无改变。定向克隆获得p P I C Z A - Z 1 0 S和p P I C Z - L 9 9 S， 分别电转化得到巴氏毕 赤酵母重组菌株P p X 3 3 - Z 1 0 S和P p X 3 3 - L 9 9 S， 提取其基因组D N A经P C R鉴定与预期相符。结论成功构建汉坦病毒H I N 型和S E O型S

3、基因毕赤酵母表达系统， 为进一步研究奠定基础。 关键词： 汉坦病毒； S基因； 毕赤酵母 中图分类号： R 3 7 3 文献标识码： A C o n s t r u c t i o no f t h eSg e n e o fH a n t a v i r u s i nP i c h i a p a s t o r i se x p r e s s i o ns y s t e L WE I J u n - f e i，X UZ h a o，L IL i，WA N GZ h i - r u i，Y A N GD o n g - j i n g，C H E NJ i n - y i n g （

4、D e p a r t m e n t o fM i c r o b i o l o g y， T i a n j i nM e d i c a lU n i v e r s i t y，T i a n j i n3 0 0 0 7 0，C h i n a） A B S T R A C T：T o c o n s t r u c t t h e S - s e g m e n t o fH a n t a v i r u s a n dS e o u l v i r u s i nP i c h i ap a s t o r i se x p r e s s i o n s y s t e m

5、，t h e S - g e n e s o f t h e Z 1 0a n dL 9 9s t r a i n s o fH a n t a a nv i r u s e n c o d i n g f o rn u c l e o p r o t e i nw e r e a m p l i f i e db yR T - P C R，a n d t h e nt h eR T - P C Rp r o d u c t sw e r e c l o n e d i n t o t h e p G E M - T - E a s yv e c t o r . A f t e r i d e

6、 n t i f y i n gb y s e q u e n c i n g a n a l y s i s，t h e f o r e i g ng e n e i n t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i dw a s c u t b y r e s t r i c t i o ne n z y m e s a n d i n s e r t e d i n t op l a s m i d s p P I C Z Aa n dp P I C Z Cr e s p e c t i v e l y . M e a n w h i l e，a f t

7、 e r l i n e r i z e db yS a ce n z y m e， t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i dw a s t r a n s f o r m e d t o t h e c o m p e t e n tP i c h i a p a s t o r i sX 3 3 c e l l s，a n d t h em u l t i - c o p y t r a n s f o r m a n t sw e r e s c r e e n e d w i t hZ e o c i n . I tw a s f o u n

8、d t h a t t h e s i z e o f t h eR T - P C R - p r o d u c tw a s a b o u t 1 2 9 0b p . T h e s i m i l a r i t i e s i nn u c l e o t i d e s e q u e n c e s o f t h i s g e n e i nc o m p a r i s o nw i t h t h e s e q u e n c e o f t h e S - s e g m e n t o f g e n e i n s e r t e d i n t o t h

9、e p G E M - T - E a s y v e c t o rw i t h t h e c o r r e s p o n d i n g s e q u e n c e r e - p o r t e d i nG e n b a n kw e r e 9 9 . 8 4 %a n d9 9 . 9 2 %r e s p e c t i v e l y . I na d d i t i o n，t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e s o f p r o t e i ne n c o d e d s h o w e dn o a n y

10、 c h a n g e . W h e n t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i dp P I C Z A - Z 1 0 Sa n dp P I C Z C - L 9 9 Sw e r e t r a n s f o r m e d i n t oP i c h i ap a s t o r i s，t h e r e c o m b i n a n t s t r a i n s o fP p X 3 3 - Z 1 0 Sa n dP p X 3 3 - L 9 9 Sw e r e o b t a i n e d，a n d t h e i

11、 r g e n o m i cD N Aw a s p r o v e d t ob e c o r r e c t e da f t e r i d e n t i f i c a t i o nw i t h P C R. I t i s e v i d e n t t h a t t h e e x p r e s s i o n s y s t e mi nP i c h i ap a s t o r i sw a s s u c c e s s f u l l y c o n s t r c t e d a s r e p o r t e d i n t h e p r e s e

12、 n t s t u d y，t h u s p r o - v i d i n g au s e f u lm o d e l o f f u r t h e r s t u d i e s . K E YWO R D S：h a n t a v i r u s；Sg e n e；P i c h i ap a s t o r i s 汉坦病毒 （h a n t a v i r u s， H V） 是布尼亚病毒科的 成员之一， 可引起导肾综合征出血热 （H F R S） 和肺 综合征出血热 （H P S） 两种疾病。我国是受H V危害 较严重的国家， 临床以H F R S为主， 流行的优势型

13、为汉滩型 （H T N） 和汉城型 （S E O） 1 。H V是分节段 的负链R N A病毒， 其基因组由L、 M、S三个片段组 成， 分别编码依赖R N A的R N A多聚酶、 包膜糖蛋 白 （G 1和G2） 和核衣壳蛋白 （n u c l e o c a p s i dp r o t e i n， N P） 。N P蛋白是该病毒的主要结构蛋白， 相对保 守， 具有很强的抗原性和免疫原性， 是作为诊断试剂 或疫苗研究的理想候选抗原 2 。在杆状病毒和大 肠杆菌表达体系中获取N P蛋白的研究已有报 道 3 - 5 ， 本文以汉坦病毒H T N型Z 1 0株和S E O型 L 9 9株为代表分

14、别构建S基因毕赤酵母 （P i c h i a p a s t o r i s， P p ） 表达系统。 1 材料与方法 1 , 1 材料 *天津市自然科学基金资助项目 （N o . 0 3 3 6 0 5 3 1 1） ， 天津市科技发展 计划项目 （N o . 0 4 3 1 1 3 5 1 1） 通讯作者： 陈锦英 作者单位： 1 .天津医科大学微生物学教研室， 天津3 0 0 0 7 0； 2 .天津市卫生防病中心 11 2 0 0 6，2 2（1） 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 1

15、“ 1 “ 1 病毒、 细胞、 质粒和菌株： 汉坦病毒Z 1 0株、 L 9 9株及 病毒传代增殖所用V e r o - E 6细胞由本室保存。p P I C Z A、 p P I C Z C、 巴氏毕赤酵母X 3 3（I n v i t r - o g e n） ， E.c o l iT O P 1 0为 本室保存。 1 “ 1 “ # 工具酶和主要试剂：R N e a s yM i n iK i t（Q I A G E N） ； W i z a r d纯化试剂盒 （P r o m e g a） ；T a K a R a R N A K i t （AMV） 试剂 盒、 L AT a q酶、T

16、4D N A连接酶、 Z e o c i n、 限制性内切酶K p n 、X b a、C l a、E c o R及H i n d（T a k a R a公司） ； 羊抗人 I g G荧光抗体 （上海生物制品研究所） 。 1 “ # 方法 1 “ # “ 1 病毒的培养及R N A提取： H VZ 1 0、L 1 9 9株按常规 接种V e r o - E 6细胞 （T 2 5培养瓶） ， 间接免疫荧光法检查细胞 感染程度。在7 5 %1 0 0 %（即+） 细胞已 感染时， 采用胰酶- V e r s e n消化感染细胞， P B S洗2 3次后， 吹下细胞离心， 细胞沉淀用于R N A提取。

17、细胞总R N A的提 取使用R N e a s yM i n iK i t， 按说明书的步骤提取， 提取的R N A 溶于3 0 l无R N A酶 （D E P C） 水中， 用紫外分光光度计测量 R N A含量为2 9 5 n g l 。 1 “ # “ # 引物的设计与合成： 参照G e n B a n k相应序列， 采用 D N AS t a r 5 . 0 1软件设计引物 （表1） ， 由上海生物工程有限 公司合成。 表1构建汉坦病毒S基因毕赤表达系统使用的引物 T a b l e . 1 P r i L e r s o f h a n t a v i r u s Sg e n e i

18、 nP i c h i ap a s t o r i se x p r e s s i o n s y s t e L 引物序列备注 P 1 4：5-T A G T A G T A G A C T C C - 3 逆转录合成c D N A的引物 P 1：5-G G G G T A C C G C A A T C T A T G G A G G A A C T A C - 3 P 2：5-C G C T C T A G A A G T T T T A A A G G C T C T T G G- 3 参考Z 1 0株序列 （A F 1 8 4 9 8 7） 设计扩增其S基因， 下线划处分别为K

19、p n和X b a的识别位点 P 3：5-C G C A T C G A T G G C A A C T A T G G A A G A A A T C - 3 P 4：5-T C G G G T A C C A A T T T C A T A G G T T C C T G G- 3 参考L 9 9株序列 （A F 2 8 8 2 9 9） 设计扩增其S基因， 下划线处分别为C l a和K p n的识别位点 P 5 （5 A O X 1） ：5-G A C T G G T T C C A A T T G A C A A G C - 3 P 6 （3 A O X 1） ：5-G C A A A

20、 T G G C A T T C T G A C A T C C - 3 I n v i t r o g e n公司提供序列供重组质粒鉴定使用 1 “ # “ $ R T - P C R扩增S基因： 将提取感染细胞的总R N A作 为逆转录的模板合成c D N A， 使用T a K a R aR N AK i t（AMV） 试剂盒按说明操作。逆转录产物直接用于P C R扩增， 反应 条件为： 9 4 2m i n预变性：9 4 0 5s e v，6 0 （Z 1 0株） 5 5 （L 9 9株） 5 0s e c，7 2 5 . 1 m i n共3 5个循环：7 2 延伸1 0 m i n。P

21、 C R产物经1 . 0 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1 “ # “ % P C R产物的T A克隆及鉴定 6 ： P C R产物经W i z a r d 纯化试剂盒纯化后， 与p G E M - T - E a s y载体连接， 转化处于感 受态的E. c o l iT O P 1 0， 涂布于含有氨苄青霉素、I P T G和X - g a l的L B平板， 选取白色转化菌落。以小量碱裂解法快速提 取重组质粒， 分别经相应的酶切和P C R鉴定， 挑选正确的重 组质粒测序 （上海博亚工程有限公司完成） 。使用D N AS t a r 5 . 0 1软件进行序列比对分析，3 D - P s s m

22、S e r v e r （3 d p s s m i m - p e r i a l . a c . u k） 分析目的蛋白质的二级结构。 1 “ # “ & S基因毕赤酵母分泌表达系统的构建： 分别将上述 T A克隆获得的Z 1 0株和L 9 9株S基因重组质粒经相应的 限制性内切酶处理后， 经D N A回 收试剂盒回收目的片段， 与各自同样内切酶处理的毕赤酵母分泌型表达载体p P I C Z （为保证读码框架的正确性， 前者采用p P I C Z A， 后者采用 p P I C Z C） 连接， 转化入E.c o l iT O P 1 0， 涂布于含Z e o c i n （2 5 g m

23、 l） 的L B平板， 选择重组菌落提取其质粒D N A经酶 切和P C R鉴定后， 选取正确重组子， 提取其质粒D N A经 S a c酶切后线性化， 用电转化方法转入毕赤酵母X 3 3感受 态细胞， 用含Z e o c i n的Y P D平板筛选。获取外源S基因同 源整合插入毕赤酵母X 3 3染色体的重组株， 并进一步鉴定。 # 结果 # “ 1 H VS基因R T - P C R： 经一步法R T - P C R扩增 汉坦病毒Z 1 0株、 L 9 9株的S基因， 经1 . 0 %琼脂糖 凝胶电泳鉴定均为12 9 0b p， 与预期片段大小一致。 # “ # H VS基因T A克隆鉴定：

24、 汉坦病毒Z 1 0株和 L 9 9株R T - P C R扩增的S基因分别与p G E M - T - E a s y连接的重组子， 以P1、 P2和P3、P4为引物经 P C R扩增均获得约12 9 0b p片段。前者经K p n、 X h a双酶切获得D N A大片段为30 1 5b p （T载 体） ， 小片段为12 8 7b p（S片段） ： 后者经E c o R酶 切获得D N A大片段为30 0 0b p（部分T载体） ， 大片 段为13 2 0b p（12 9 0b p的S片段+ 3 0b p的T载体 部分片段） ， 以上结果均与预期相一致， 表明目的片 段已正确插入T载体中，

25、 分别命名p G E M - T - Z 1 0 S 和p G E M - T - L 9 9 S。 # “ $ S基因的序列分析：H VS基因仅有一个开放 读码框架， 大小约为12 9 0b p， 鉴于使用p P I C Z 载 体构建毕赤酵母表达系统的需要， 引物设计使5 端 从起始密码子A T G开始， 而3 端弃掉终止密码子 T A A， 重组质粒均为12 8 7b p。p G E M - T - Z 1 0 S核苷 酸序列与G e n B a n k登 陆 的Z 1 0株S基 因 序 列 （A F 1 8 4 9 8 7 A F 1 5 9 3 7 0）相 比 较 其 同 源 性 为

26、 9 9 . 8 4 %， 推导氨基酸序列同源性为9 9 . 7 6 %； 其中 第1 0 0 5位C被T替代， 第1 0 5 2位C被T替代， 前 者为同义突变， 后者为错义突变， 即第3 5 1位编码氨 基酸为S e r残基P h e残基 （T C TT T T）（图1） 。 p G E M - T - L 9 9 S序列与G e n B a n k登陆的L 9 9株S基 21 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 2 0 0 6，2 2（1） 因核苷酸序列 （A F 2 8 8 2 9 9） 相

27、比较其 同 源 性 为 9 9 . 9 2 %， 推导氨基酸序列同源性为9 9 . 7 6 %； 其中 第8 4 5位A被G替代， 相应第2 8 1位氨基酸G I n残 基A r g残基 （C A AC G A）（图2） 。经3 D - P S S M S e r v e r分析，p G E M - T - Z 1 0 S、p G E M - T - L 9 9 S中S基 因编码的蛋白质二级结构均无改变。 2 “ # S基因毕赤酵母表达系统的构建 2 “ # “ $ 基因的定向克隆的鉴定： 以p G E M - T - Z 1 0 S 的S基因与载体p P I C Z A所构建的重组质粒为模

28、板， 用P 1、P2为引物的P C R扩增片段为1 2 8 7 b p ， 以 载体p P I C Z AA O X 1特异性引物P 5、P6为引物的 P C R扩增片段为18 5 0b p （12 8 7b p插入片段+ 5 8 9 b p载体序列- 2 6 b p构建时被切去的多克隆位点 区序列） ； 以p P I C Z A为模板用P 5、P6扩增产物为 5 8 9 b p； 重组质粒D N A经K p n、 X b a双酶切获 得载体片段为35 7 4 b p， 外源插入片段为12 8 7b p； P C R法及酶切法鉴定结果均表明S基因已正确插 入p P I C Z A载体中， 择其

29、一命名为p P I C Z A - Z 1 0 S。 以p G E M - T - L 9 9 S的S基因与载体p P I C Z C所 构建的重组质粒为模板， 用P 3、 P4为引物的P C R扩 增片段为1 2 8 7 b p； 以载体p P I C Z C的A O X I特异性 引物P 5、P6 为引物的P C R扩增片段为1 8 3 4 b p （1 2 8 7 b p插入片段+ 5 8 9 b p载体序列- 4 2 b p构建时 被切去的多克隆位点区序列） ： 以p P I C Z C为模板 用P 5、P6 扩增产物为5 8 9 b p； 重组质粒D N A经 C a l l、K p

30、 n双酶切后获得载体片段为3 5 5 8 b p， 外 源插入片段为1 2 8 7 b p， P C R法及酶切法鉴定结果均 表明S基因已正确插入p P I C Z C载体中， 择其一命 名为p P I C Z C - L 9 9 S。 2 “ # “ 2 S基因毕赤酵母重组菌株的鉴定：p P I C Z A - Z 1 0 S和p P I C Z C - L 9 9 S的D N A经线性化后通过3 A O X 1位点同源性重组插入巴氏毕赤酵母X 3 3株染 色体， 分别构建重组菌株P p X 3 3 - Z 1 0 S和P p X 3 3 - L 9 9 S。以P p X 3 3 - Z 1

31、 0 S的基因组D N A为模板， 用 P1、P2为引物的P C R扩增片段为12 8 7b p； 以酵母 A O X 1特异性引物P5、P6为引物的P C R扩增片段 为1 8 5 0 b p。 以P p X 3 3 - L 9 9 S的基因组D N A为模板， 用P 3、 P4为引物的P C R扩增片段为1 2 8 7 b p； 以 酵 母 A O X 1特异性引物P5、P6为引物的P C R扩增片段 为1 8 3 4 b p均与预期一致， 表明重组菌株构建成功。 % 讨论 H F R S （过去称为流行性出血热） 为备受关注的 人兽共患病， 啮齿动物是汉坦病毒的主要宿主和传 染源， 它们

32、无症状终生带毒， 经多种途径传染给人或 在动物间传播， 这种自然疫源性疾病的特点给该病 图1 p G E M - T - Z 1 0 S序列与G e n B a n k登陆的Z 1 0株S基因 序列 （A F 1 8 4 9 8 7， A F 1 5 9 8 3 7 0） 比对结果 A F 1 8 4 9 8 7为c D N A序列，A F 1 5 9 3 7 0为R N A序列。 p G E M - T - Z 1 0 s弃掉起始密码子A T G F i g . 1 T h e c o L p a r i s o no f t h e s e q u e n c eo fp G E M -

33、T - Z 1 0 Sa n d t h e o n e s r e p o r t e d i nG e n B a n k （A F 1 8 4 9 8 7、 A F 1 5 9 3 7 0） 31 2 0 0 6，2 2（1） 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 图2 p G E M - T - L 9 9 S序列与G e n B a n K登陆的L 9 9株S基因 序列 （A F 2 8 8 2 9 9） 比对结果 A F 2 8 8 2 9 9为c D A N序列、p G E M - T

34、- L 9 9 s保留起始 密码子A T G F i g . 2 T h e c o L p a r i s o no f t h e s c q u e n c e o fp G E M - T - L 9 9 Sa n d t h e o n e s r e p o r t e d i nG e n B a n k （A F 2 8 8 2 9 9） 的控制带来极大的困难。在我国H F R S不仅发病 率高， 而且曾成为死亡数居前五位的传染病之一， 2 0 0 2年卫生部制定了 “全国流行性出血热防治规 划” 。天津是汉坦病毒感染的新疫区， 除S E O型外 已有H T N型汉坦病毒的报告

35、 7 ， 列为国家级监测 点， 加强对该病的监测和研究具有重要的意义。 汉坦病毒S基因编码核蛋白， 可诱导机体在感染 早期产生很强的体液免疫和细胞免疫， 故S基因的工 作有利于诊断试剂的开发和防治的研究。我们选用 疫苗株Z 1 0和L 9 9作为初发毒株获取S基因， 首先应 保证其序列的正确性， 本文结果与已知序列相比较， 其同源性分别为9 9 . 8 4 %和9 9 . 9 2 %。值得说明的是 已在G e n B a n K登陆的Z 1 0株S基因一个为R N A序 列 （A F 1 5 9 3 7 0） ， 一个为c D N A序列 （A F 1 8 4 9 8 7） ， 两者 之间有1

36、 1处不同。汉坦病毒是分节段的R N A病毒， 较容易发生变异， Z 1 0株的差异归于实验室传代的结 果抑或P C R的误差尚难确定。我们曾用高保真 T a q 酶经P C R扩增所得S基因序列与原扩增产物比较并 无不同， 为此， 将本文所得Z 1 0株S基因序列与上述 两个登陆序列相比较， 与其一相同即为同源， 并经 3 D - P S S MS e r v e r分析表明其蛋白质二级结构无改变， 使本研究得以顺利进行。 近年来毕赤酵母表达系统应用较多， 它具有高 表达、 高稳定、 高分泌的特点， 且具有易于高密度培 养和产物纯化、 操作简便和成本较低等优点。重组 质粒线性D N A通过置

37、换或插入式整合到毕赤酵母 的染色体， 并有1 %1 0 %几率获得多拷贝重组转 化子， 有利于提高蛋白表达量， 不过也有人认为高拷 贝不一定就能高表达 8 。本文已成功获得汉坦病 毒S基因的毕赤酵母重组株， 证实以基因插入方式 整合， 为单拷贝重组， 有关基因表达工作仍在进行 中。 参考文献： 1 宋干， 杭长寿， 俞永新， 等.流行性出血热防治手册 M.北京： 人 民卫生出版社， 1 9 9 8，1 - 3 . 2 金奇， 主编.医学分子病毒学 M.北京： 科学出版社， 2 0 0 1，5 1 4 - 5 1 6 . 3 耿志洲， 张莉， 刘翠英， 等. S E O型汉坦病毒全N P蛋白及N

38、 P蛋 白型特异区编码基因的克隆、 表达 J.现代预防医学， 2 0 0 2，2 9 （4） ： 5 0 0 - 5 0 3 . 4 王长军， 唐家琪， 潘秀珍， 等.汉滩病毒截短核蛋白在大肠杆菌中 表达及其抗原分析 J.中国人兽共患病杂志， 1 9 9 9，1 5 （6） ： 6 7- 7 0 . 5M a y u k om o r i i，K u m i k oy o s h i m a t s u， e t a l . A n t i g e n i cC h a r a c t e r i z a t i o n o fH a n t a a na n dS e o u lV i r

39、u sN u c l e o c a p s i dP r o t e i n sE x p r e s s e db yR e - c o m b i n a n tB a c u l o v i r u s：A p p l i c a t i o no f aT r u n c a t e dP r o t e i n，L a c k i n g a n dA n t i g e n i cR e g i o nC o m m o n t o t h eT w oV i r u s e s，a s aS e r o t y p i n g A n t i g e n J. J o u r

40、n a l o fC l i n i c a lM i c r o b i o l o g y， 1 9 9 8，3 6 （9） ： 2 5 1 4- 2 5 2 1 . 6 J .萨姆布鲁克，DW拉塞尔， 等.分子克隆实验指南 M.北京： 科学出版社， 2 0 0 2，6 2 7 - 6 2 8 . 7 李力， 杨东靖， 陈锦英， 等.天津地区汉坦病毒分离株T J J 1 6S基 因片段克隆和序列分析 J.中华微生物和免疫学杂志， 2 0 0 5，2 5 （8） ： 6 5 2 - 6 5 5 . 8 章如安， 陈晟， 邱荣德， 等.巴斯德毕赤酵母表达体系研究及进展 J.微生物学通报， 2 0 0 0，2 7 （5） ： 3 7 1 - 3 7 3 . 收稿日期： 2 0 0 5 - 1 0 - 2 2； 修回日期：2 0 0 5 - 1 1 - 1 6 41 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s 2 0 0 6，2 2（1）