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1、6 0 4 激活蛋白一2 对H e l a 细胞中s u r v i v i n 的抑制作用 张梦杰杨云龙孙明廖雅成黄力维李风知 【摘要l目的探讨激活蛋白一2 ( A P 一2 ) 对H e h 细胞中s u n r i v i n 基因表达的影响，为靶向抑制s u r v i v i n 基 因表达的肿瘤治疗奠定理论和临床应用基础。方法共转染s u r v i v i n 启动子一荧光素酶报告基因质粒和A P - 2 。双 荧光素酶活性检测A P - 2 对s u r v i v i n 启动子活性的影响；转染A P 一2 到H e l a 细胞中，反转录一聚合酶链反应( R T P c R
2、 ) 和w e s t e m b l o t 检测A P - 2 对H e l a 细胞中明n ，i v i n 基因表达的影响。结果A P _ 2 能抑制s u r v i v i n 核心启动子 活性：并在转录和翻译水平上抑制H e h 细胞中的s u r v i v i n 基因表达。结论A P - 2 可抑制H e l a 细胞中s u n r i v i n 基 因的表达，为有效控制蚰“i v i n 基因表达提供了薪的思路，为靶向s u r v i v i n 的肿瘤基因治疗奠定基础。 【关键词】H e l a 细胞；s u r v i v i n ；A P 一2 ；转录因子 A
3、 砸v a t o rp t e i n _ 2 蛐i b i t s 辄r v i v i I I 寥耻麟p r 哪i o ni nH e I ac e 脚A c 胁，州如， l ，A l ，u n 一肠n g s E ， M 够MDl ，口叼7 地哆H 珊M i 吲e L ，屁，l g - 名舰唧e n 如6 0 r 咖，y 矿肘诎zO ，苫狮厶m 死c 加如彩s c 如o Z 矿扣 s c 曲眦e s d 死c n 0 o 盯，凡威面e 那n y ，鼽佣加瓜2 0 0 0 9 2 ，C h i n a 【A b s t 哺c t 】O b j e c t i v eT 0e l u c
4、i d a t et h ei m p a c t so fa c t i v a t o rp m t e i n 一2 ( A P 一2 ) o n8 u r v i v i ng e n ee x p r e s 8 i o ni n H e l ac e U 8a n dt op r o v i c I e t l e o r e t i c a la I l dc l i n i c a lb a s i s b rt a 船e t e ds u p p r e 鹳i o no fs u r v i v i n # r e n e M e t h o d sT h es u r v
5、i v i np r o m o t e ra n dA P 一2w e r ec o t 啪s f e c t e di n t oH e l ac e U st 0d e t e c tt h ei m p a c t so fA P 一2o na c t i v i t i e so fs u n r i v i np m m o t e r 1 - I l e 吲班l “o ft h es u r v i v i ne x p r e 够i o nb yA P 一2w a sd e t e c t e d 试也R T P C Ra n dW e s t e mb I o t t i 醒
6、a f t e rt r a 璐。 f e c t i o n R 酬t sA P 一2w a ss h o w nt oi n h i b i tt h e 舵t i v i t yo fs u i v i nc o r ep r o m o t e ri nH e l ac e U s I na d d i t i 仰，A P 一2a 1 s oi n h i b i t e dg u r v i v i ne x p 残I s s i o na tm et 瑚m s c I i p t i o n 蛳dt r a n 8 l a t i o nl e v e l si nH e l ac
7、 e l l s C o n c I u s i o nI 州蚯h i t i o no fs u r v i v i ne x p r e 8 s i o ni nH e l ac e u sb yA P 一2m a yo p e nu pan e w 印p m a c hf o re 娲c t i V er e g L I l a t i o no fs u n r i v i ng e n e 种dp m 、i d eap 吐e 以a lb a s ef o r 马u r v i v i n 一_ 【a r g e t e dc a n c e rt h e r a p y 【K e y
8、w o r d s 】 H e l ac e U s ；S u n r i v i n ；A P - 2 ；T r 柚s c r i p t i o n 蠡l c t o r S u r v i v i n 是细胞凋亡抑制蛋白家族中最重要成 员之一它在几乎所有癌细胞中高表达，而在正常组 织中不表达或者只在少数组织细胞中很低表达【1 1 。 S u r v i v i n 蛋白是一种双功能蛋白，不仅可以促进细胞 分裂而且能抑制细胞的凋亡 ：t 3 。转录因子激活蛋白 ( A P ) 一2 在基因表达调控、胚胎发育和抑制肿瘤发生 中起重要作用。研究发现A P 一2 在某些肿瘤发生过 程中起调节作用
9、。能抑制人类某些肿瘤和癌细胞株 的生长 引。我们首次发现了转录因子A P 一2 能有效抑 制肿瘤细胞中鲫r v i v i n 基因的表达而对正常细胞 影响很小 1 引。本研究主要利用双荧光素酶活性检 测、反转录一聚合酶链反应( R T P C R ) 和w e s t e m b l o t 检测A P 一2 对H e l a 细胞中s u “i v i n 基因表达的影 响，为靶向抑制肿瘤细胞中的s u 九r i v i n 基因表达而 促进肿瘤细胞凋亡的肿瘤基因治疗奠定一定的理论 和临床应用基础。 l 材料与方法 基金项目：国家自然科学基金资助项目( 3 0 7 0 1 0 1 4 )
10、作者单位：2 0 0 0 9 2 上海，同济大学生命科学与技术学院模式生物 技术开放实验室 1 1 材料：H e l a 细胞系由本实验室保存。A P 一2 表达 载体p R S V A P 一2 d 、p R S V 一2 p 、p R S V 一2 1 和p R S V N N 由美国r I I r e v o rW i l l i a m s 和H e l e nc H u r s t 博士惠赠。 S u r v i v i n 核心启动子一荧光素酶报告基因载体由本实 验构建。R P M l l 6 4 0 培养基购于H y c l o n e 公司；胎牛 血清购于复蒙基因生物科技有限公
11、司；L i p o f e c t a m i n e 心0 0 0 购于I n v i t r o g e n 公司；D a u l L u c i f e r a s e R e p o r t e rA s s a yS y s t e m 购于P r o m e g a 公司；R T P C R 试剂盒购于T a k 锄公司；聚偏氟乙烯( P V D F ) 膜购 于B i o R a d 公司。 1 2 方法：H e l a 细胞培养：用含1 0 胎牛血清的 R P M I l 6 4 0 培养基5 二氧化碳条件下细胞培养箱 常规培养。 荧光素酶报告基因质粒的转染：按l i p o
12、f e c t i m i n e T M2 0 0 0 转染试剂盒( I n v i t r o g e n ) 说明进行转染，细 胞接种于9 6 孔板，每孔加O 1 5 斗gs u n r i v i n 启动子一 荧光素酶报告基因质粒p L u c 一2 3 0 、0 0 5 斗gA P 一2 仅 表达载体、内参照p R L T K 质粒0 0 l 嵋、脂质体 l i p o f e c t i m i n e l M2 0 0 00 5p 1 、无血清无抗生素1 0 4 0 培 基1 0 0 斗1 ，三复孔检测。 万方数据 荧光素酶活性测定：按双荧光素酶活性检测试 2 3W e s t
13、 e mb l o t 结果：见图3 。 剂盒( P r o m e g a ) 说明进行。 收集H e l a 细胞，磷酸盐缓冲液( P B S ) 冲洗2 次， 加入1 P L B 细胞裂解液1 5 l ，室温放置1 0I l l i n 后，吹打细胞，收集细胞裂解液。荧光测定管中加 1 0 0 斗lL A R ( L u c i f e m s ea s s a yr e a g e n t ) ，再加细胞 裂解液1 0 斗l ，放置发光仪中，测定荧光素酶活性；然 后再加入1 0 0 斗lS t o p & G l or e a g e n t ，测定内参照质 粒p R L T K 中的
14、R e n i l l a 荧光素酶活性。发光仪程序 设置：延迟2s ，测定时间l Os 。 R T P C R ：H e l a 细胞铺2 4 孔板，l i p o f e c t i m i n e 喇 2 0 0 02 斗1 转染A P 一2 0 【和对照质粒，4 8h 后收集细 胞，进行R T P C R ，9 4 预变性4m i n 。9 4 变性4 5 s ，5 6 退火1m i n ，7 2 延伸4 58 ，7 2 终延伸1 0 m i n o S u r “v i n 弓l 物s e n s e ：5 一C C C C A T A G A G G A A C A T A A A
15、 一3 ：A n t i s e n s e ：5 一G G A A T A A A C C C T G G A A G T G 一3 ；B a c t i n 弓I 物s e n s e ：5 一G T G G G G C G C C C A G G C A C C A C 一3 ：A n t i s e n s e ：57 一C T C C T r A A T G T C A C G C A C G A ，I T r 一37 。 W e s t e mb l o t ：H e l a 细胞铺板6 孔板，4 8h 后收 集细胞总蛋白，1 2 分离胶，5 浓缩胶十二烷基硫 酸钠一聚丙烯酰胺凝胶
16、电脉( S D S P A G E ) ，转至 P V D F 膜，封闭，加s u i v i n 和G A P D H 一抗，T B S T 洗，加二抗，E C L 显色。 2 结果 2 1 荧光素酶活性检测结果：见图1 。 1 5 0 1 0 0 5 0 0 对照组A P - 2 qA r 2pA p 一2 1 图lA P _ 2 在H e l a 细胞中对蛐r v i v i n 核心启动子 p h c 2 3 0 活性影响 2 2R T _ P c R 结果：见图2 。 l ：阴性对照A P _ N N ；2 ： P - 孙；3 ：A P - 2 p ；4 ：A P - 柳；5 ：M
17、a r I 时 图2A P - 2 在m R N A 水平上对H e l a 细胞中 s u n r i v i n 基因表达的影响 o l ：H e h 阳性对照，2 ：A P - 卸， 3 ：A P - 2 B ，4 ：A P _ 孤，5 ：A P - N N 对照质粒 图3A P 一2 在蛋白水平对H e l a 细胞中 舳n r i v i n 基因表达的影响 3 讨论 大量实验研究表明，s u r v i v i n 在几乎所有的肿瘤 细胞中高水平表达。但在正常组织不表达或者只在 少数组织细胞中低水平表达 。而A P 一2 在人类某些 肿瘤发生过程中起到重要的调节作用。有实验表明。
18、如果A P 一2 缺失将会导致恶性黑色素瘤的进一步 发展 6 。我们近期的研究表明在肿瘤细胞中A P 一2 参 与到s u r 、，i v i n 基因表达抑制过程中 引。 ，I FS e a r c h 软件搜索s u n r i v i n 基因核心启动子。 发现该启动子上有A P 一2 结合位点一致序列为确 定A P _ 2 对s u r v i v i n 启动子的调控作用，本实验中采 用双荧光素酶活性测定，以海洋腔肠荧光素酶( T K ) 为内参照。A P N N 对照质粒转染H e l a 细胞后，荧光 素酶与海洋腔肠荧光素酶活性比为1 2 7 8 4 而转染 A P 一2 a 或
19、A P 2 B 或A P 一2 1 的比值分别为6 6 5 ，1 9 4 和1 7 3 8 。实验结果表明，A P - 2 可以在H e l a 细胞中 有效抑制s u i v i n 核心启动子活性。 为了进一步研究A P 一2 是否能在转录水平上 抑制s u n r i v i n 基因表达我们进行了R T P C R ，以 B a c t i n 为内参消除实验间的误差。实验结果显示 A P _ 2 仅或A P 一2 B 或A P 一2 1 可以在转录水平上部分 抑制s u r v i v i n 基因表达。说明A P 一2 作为转录因子可 能直接或间接参与到s u n r i v i
20、n 基因表达过程。但还 需要进一步的实验验证。 S u n r i v i n 基因在大多数肿瘤细胞中是高表达的。 通过W e s t e m b l o t 实验我们也确实发现H e l a 细胞中 有高表达的s u n r i v i n 而转染A P _ 2 质粒4 8h 后，以 还原磷酸甘油醛脱氢酶( G A P D H ) 为内参，发现A P 一 2 a 或A P 一2 B 或A P 一2 y 在蛋白水平上可抑制s u 卜 v i v i n 的表达。 S u r v i v i n 基因的高表达与肿瘤的发生、发展有 关。往往预示着患者的预后差、生存期短、抗化疗、抗 放疗 1 7 8
21、 】。因此，s u n r i v i n 作为恶性肿瘤选择性治疗 I 。 IHL H T T I 万方数据 6 0 6 靶点和预后判断具有极其重要的理论和临床意义。 通过本实验研究我们发现s u n r i v i n 基因表达可在 不同水平上被A P 一2 抑制，A P 一2 对8 u i v i n 基因表 达的抑制研究将丰富对肿瘤发生、发展过程的了解， 这一研究也有着重要的治疗肿瘤的临床价值和应用 前景。 参考文献 1 Z h 髓gM ，Y 眦gJ ，【jF T r a n 卵r i p t i o n a l 锄dp o s t 一心眦8 c r i p t i 佣a l c 州80
22、 fs u n r i v i ni nc 锄c e rc e U 8 ： 舯v e l 印p r o 盹h e sf o rc 柚c 盯 t r e 砒m n t JE x pC l i nC 锄c e rR e s ，2 0 0 6 ，2 5 ：3 9 l 4 0 2 2“F A l n b r i n iG ，C h uE Y ，e ta 1 C o n t r o l0 fa p o p t i B 柚dm i t o t i c 叩i n d l ec h e c k p o i n tb y8 u r v i “n N a t u 弛，1 9 9 8 ，3 9 6 ：5 8 0 -
23、 5 8 4 3“F ，A c k e n 啪nE J ，B e 仰e t tC F ，e Ia 1 P l e i o t r 叩i cc e u - d i v i 8 i 仰 d d 协柚da p 叩t o s i 8i n d u c e db yi n t e d e r e n c e 订t hs u r v i “n j f u n c t i o n N 砒C e uB i o l ，1 9 9 9 ，l 舶l - 4 6 6 4 A n t t i l aM A ，K e l l o k 稍bJ K ，M o i B i ol c I ，e ta 1 E x p s i o
24、n0 f 锄n 一 r i p t i 帆胁A P 一2 a l p I I ap n e d i c 协肌n r i v a li n 印i t I I e l i a lo v a r i 蛐 c a n c 日B rJC a n c e r 。2 0 0 0 ，8 2 ：1 9 7 4 一1 9 8 3 5 S p 眦l d i n gB P 明D ，G h a d 嘲o h i 气e ta 1 C h 蚰c t e r i z a t i 蚰0 ft h e 1 2 c 4s u 州1 r i nn 啪0 c l a l 趼t j b o d y 跚di 瑚j g I l ti n l
25、 ot h e “p 陀吕_ s i 0 f8 帅d “ni nh u H 幽a d u ht i s 眦H i 8 t 叩a t h o l o 盯，2 0 0 6 ，4 9 ： 6 2 2 6 3 3 6B 盯一E l iM R o l e0 fA P 一2i nt u 瑚rg w t h 柚dm e t 已g 啦i Bo fh u - H 啪脱l 锄伽C 锄c e rM e t a s t a 5 i sR e v 。1 9 魄1 8 ：3 7 7 3 8 5 7UF “n gX S m 、r i “n 砒u d y ：锄u p d a t e0 f ”w h ti 8 t I l en
26、 e x t 啪v e ”? JC e l lP h y s i o l ，2 0 0 6 ，2 0 8 ：4 7 6 - 4 8 6 8UF S u r v i “n 咖d y ：w h a ti sm en 嘲啪v e JC e uP I I y $ i o l ，2 0 0 3 ， 1 9 7 ：8 2 9 ( 收稿日期：2 0 0 8 0 4 2 3 ) ” 消电 “百普力百普素”有奖征文通知 为进一步探讨和交流“百普力百普素”在临床营养支持方面的应用和前景，对优秀临床经验进行总 结，中国药物与临床杂志社和纽迪希亚制药( 无锡) 有限公司联合举办“百普力百普素”有奖征文活动。希望 通过
27、各位专家、教授的共同参与和支持，为广大临床医师提供宝贵的“百普力百普素”治疗经验和临床资 料。 1 、征文内容：“百普力百普素”在胃肠道功能障碍：重症胰腺炎，炎性肠道疾病，放射性肠炎和化疗， 肠瘘，短肠综合征，艾滋病病毒艾滋病；危重疾病：大面积烧伤，创伤，脓毒病，大手术后的恢复期等危重 症患者；营养不良患者的手术前喂养；肠道准备等方面的应用。 2 、征文要求：征文侧重于临床应用的研究，单一病种的病例数不少于3 0 例；论文未在公开发行的杂 志及其他学术交流会议上发表；论文请附5 0 0 字以内的中英文摘要。并标注3 8 个关键词( 须是打印稿，并 请附软盘) ；请注明作者姓名、职称、单位、地址
28、、邮编及联系电话。 3 、征文截止日期：2 0 0 8 年9 月1 5 日前( 以邮戳为准) 。 4 、征文邮寄地址：山西省太原市东华门2 3 号中国药物与临床杂志社臧长海收，请注明“征文投稿”字 样，邮编：0 3 0 0 1 3 ；也可通过E m a i l 投稿，z z s z c h 1 6 3 c o m 。 5 、评选方法：由中国药物与临床杂志社组织专家成立评审委员会，评出一、二、三等奖及优胜奖，并向获 奖者颁发证书。其中一等奖1 名：奖金人民币5 0 0 0 元；二等奖2 名，奖金人民币3 0 0 0 元；三等奖3 名，奖金人 民币2 0 0 0 元；优胜奖1 0 名，奖金人民币1 0 0 0 元。 注：所有论文由中国药物与临床杂志编辑部录入论文汇编；获一、二、三等奖论文经筛选后优先在中 国药物与临床杂志刊登。 本刊编辑部 纽迪希亚制药( 无锡) 有限公司 万方数据