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1、论著 灯盏花素对缺血再灌注沙土鼠海马AT P 含量变化和兴奋性氨基酸释放的影响 张 焰 陈 群 顾卫东 丁浩中 曾因明 【 摘要】 目的 研究灯盏花素对缺血再灌注沙土鼠海马A T P含量、A T P酶活性和兴奋性氨基 酸释放的影响。方法 脑缺血1 0m i n建立沙土鼠缺血再灌注模型。9 0只沙土鼠分为假手术组、 脑 缺血组和灯盏花素组。测定脑缺血后和再灌注1、 1 2和2 4h海马A T P含量、A T P酶活性和兴奋性 氨基酸含量。结果 脑缺血组,A T P、N a +- K+- A T P酶和C a2 +- A T P酶含量明显下降( P - J ( N . R I - * . 2 H“
2、 * - P . I s c h e m i a/r e p e r f u s i o n;B r a i n;A T P a s e;E x c i t a t o r ya m i n o - a c i d s B % ( * 3 P E - =B,+ 2 Q - I : - N2 0 0 5,3 1(1 1) :8 4 3R8 4 5 M 作者单位:2 1 4 0 6 2 无锡市第四人民医院麻醉科( 张 焰、 顾卫 东、 丁浩中) ; 徐州医学院麻醉学系( 陈 群、 曾因明) 灯盏花素作为蛋白激酶C(P K C) 抑制剂, 具有 减轻脑缺血 / 再灌注引起的神经细胞死亡作用 1, 但
3、 其作用是否与减少A T P含量下降、 降低兴奋性氨 基酸释放有关尚不清楚。本文应用沙土鼠脑缺血再 灌注模型, 探讨灯盏花素是否具有上述作用。 材料与方法 一、 动物与药品 蒙古沙土鼠, 6 07 0g, 雄性, 徐州医学院实验 动物中心提供。灯盏花素注射液( 云南省生物制药 厂, 含黄酮4 . 5m g/m l) ,A T P( S i g m a公司) ,A T P 酶试剂盒( 南京建成生物制品研究所) , 谷氨酸 ( G l u) 、 天冬氨酸(A s p) 、 谷氨酰胺(G l n) 、 - 氨基丁 酸( G A B A) 标准品由华美生物工程公司提供; 其余 试剂均为国产分析纯。 二
4、、 方法 1 .动物模型与分组 戊巴比妥钠4 5m g/ k g 腹 348 江苏医药2 0 0 5年1 1月第3 1卷第1 1期 J i a n g s uM e dJ,N o v e m b e r 2 0 0 5,V o l 3 1,N o . 1 1 腔注射麻醉后, 仔细分离双侧颈总动脉, 用无创动脉 夹阻断脑血流即可造成前脑缺血1 0m i n, 松开动脉 夹恢复脑血流即为再灌注。9 0只沙土鼠分为假手 术组(A组) 、 脑缺血组( B 1组) 、 脑缺血再灌注1h 组( B 2组) 、 脑缺血再灌注1 2 h组(B 3组) 、 脑缺血再 灌注2 4 h组( B 4组) 、 灯盏花素
5、+脑缺血组(C 1组) 、 灯盏花素+脑缺血再灌注1h组( C 2组) 、 灯盏花素 +脑缺血再灌注1 2h组(C 3组) 、 灯盏花素+脑缺 血再灌注2 4h组( C 4组) , 每组1 0只。灯盏花素组 在缺血前3 0m i n腹腔注射灯盏花素1 0m l/ k g , 其余 组同期注射生理盐水。每组6只行A T P、A T P酶 和兴奋性氨基酸测定, 4只行病理学检查。在缺血 期间监测鼓膜温度反映脑温, 并维持鼓膜温度于( 3 7 0 . 2)。 2 .实验方法 (1) 沙土鼠断头取脑, 冰面上分 取海马组织,- 7 5 液氮冷冻, 保存待测标本。( 2) 应用高效液相紫外检测法测定A
6、T P含量, 应用钼 蓝分光光度法测定A T P酶活性。( 3) 应用高效液 相紫外检测法测定G l u、A s p、G l n、G A B A含量。 ( 4) 脑 缺 血 再 灌 注 后7d, 沙 土 鼠 戊 巴 比 妥 钠 4 5m g / k g 腹腔注射麻醉后, 经主动脉插管先后灌注 生理盐水8 0m l和4 %甲醛溶液1 2 0m l。然后断头 取脑, 并浸泡固定于4 %甲醛溶液, 在囟门后1 . 7 mm处石蜡切片, 厚5m。低倍镜观察海马C A 1区 锥体细胞带的厚度; 高倍镜观察海马C A 1区锥体细 胞膜和核膜完整、 核仁清楚的存活锥体细胞数目。 结果以各治疗组计数的海马C
7、A 1区锥体细胞占假 手术组海马C A 1区锥体细胞数的百分数表示。 三、 统计学处理 计量数据以均值标准差(- xs) 表示, 组间比 较采用方差分析, 以P 0 . 0 5为差异有显著意义。 结果 一、A T P、N a + - K + - A T P酶、C a 2 + - A T P酶含 量变化 脑缺血和再灌注组含量均明显下降, 灯盏花素 +脑缺血组, 含量均高于脑缺血组( 表1) 。 二、 脑缺血组, 缺血后G l u、A s p明显升高,G l n 降低, G A B A升高; 再灌注后G l u、A s p、G l n、G A B A 含量明显升高。灯盏花素+脑缺血组,G l u、
8、A s p、 G A B A虽亦升高, 但明显低于脑缺血组,G l n则明显 高于脑缺血组( 表2) 。 三、 脑缺血后7d, 海马C A 1区低倍镜下缺血 / 再灌注组锥体细胞带变薄、 稀疏, 甚至消失; 灯盏花 素组锥体细胞带明显比缺血组宽厚。高倍镜下缺血 组锥体细胞大部凝固性坏死, 核膜完整、 核仁清楚的 存活锥体细胞数较少( 见封二图1) ; 灯盏花素组存 活锥体细胞明显多于缺血组( 见封二图2) 。各组锥 体细胞存活数见表3。 表1 海马A T P和A T P酶含量的变化(- xs,n= 6) 组别 A T P (mm o l/ k g ) N a +- K+- A T P酶 ( m
9、 o l p i m g p r o t - 1 h - 1) C a 2 +- A T P酶 ( m o l p i m g p r o t - 1 h - 1) C 1组0 . 5 6 0 . 1 1#5 . 4 3 0 . 5 5#2 . 4 5 0 . 3 6# C 2组0 . 8 1 0 . 1 2#5 . 0 9 0 . 3 6#2 . 1 4 0 . 4 1# C 3组0 . 5 8 0 . 0 7#3 . 6 7 0 . 3 7#1 . 6 4 0 . 3 9# C 4组0 . 4 3 0 . 0 9#2 . 7 1 0 . 4 2#1 . 3 9 0 . 4 0# B 1组0
10、 . 2 1 0 . 0 4#4 . 1 3 0 . 4 1#1 . 9 2 0 . 4 7# B 2组0 . 4 9 0 . 0 9#4 . 3 5 0 . 2 9#2 . 0 7 0 . 3 7# B 3组0 . 3 8 0 . 1 1#3 . 0 7 0 . 3 7#1 . 2 8 0 . 4 8# B 4组0 . 2 5 0 . 0 8#1 . 2 3 0 . 4 3#0 . 5 8 0 . 3 5# A组1 . 1 2 0 . 1 28 . 8 7 0 . 3 93 . 8 5 0 . 4 4 与A组比较, #P 0 . 0 1 与B组比较,P 0 . 0 1 表 2 海马G l u
11、、A s p、G l n、G A B A的含量(n m o l/g,- xs,n= 6) 组别 G l uA s pG l nG A B A C 1组1 8 . 3 8 2 . 9 1#9 . 5 5 2 . 6 2#4 . 2 3 0 . 8 1#3 . 8 3 0 . 6 7# C 2组2 1 . 4 2 3 . 0 2#1 2 . 6 4 2 . 6 9#6 . 4 9 1 . 0 1#4 . 1 9 0 . 5 1# C 3组2 1 . 7 7 2 . 9 7#1 2 . 2 9 2 . 5 9#6 . 9 7 0 . 9 8#4 . 0 9 0 . 4 8# C 4组2 2 . 3
12、2 2 . 5 4#1 2 . 8 3 2 . 1 2#7 . 2 2 1 . 1 7#3 . 7 9 0 . 4 9# B 1组2 7 . 2 1 3 . 4 5#1 6 . 3 1 2 . 7 8#3 . 4 2 0 . 6 2#4 . 9 7 0 . 5 9# B 2组3 2 . 7 6 2 . 9 8#1 9 . 1 9 3 . 0 1#5 . 9 7 0 . 9 2#5 . 1 3 0 . 6 7# B 3组3 3 . 4 8 3 . 7 6#1 9 . 9 4 2 . 8 8#6 . 1 3 0 . 8 1#5 . 0 8 0 . 5 1# B 4组3 6 . 4 4 2 . 7
13、1#2 1 . 0 6 2 . 4 2#6 . 5 4 1 . 0 7#4 . 9 8 0 . 4 8# A组6 . 4 5 1 . 1 03 . 0 7 0 . 7 45 . 1 1 0 . 5 93 . 0 4 0 . 4 1 与A组比较, #P 0 . 0 1 与B组( 各亚组之间) 比较,P 0 . 0 1 表3 海马C A 1区锥体细胞计数(- xs,%,n= 4) 组别内侧中间外侧 灯盏花素组(C 1 4组) 7 1 1 5 # 7 2 1 1#7 5 1 4# 缺血组(B 1 4组) 4 36 25 3 与缺血组比较, #P 0 . 0 1 讨论 脑组织缺血时, 氧供中断, 导致
14、线粒体能量代谢 障碍, A T P含量减少, 引起N a + - K + - A T P和C a 2 + - A T P酶活性下降, 突触体外K +增多、 细胞内 N a + 滞留并严重影响膜内外C a 2 +的转运, 从而影响突触 兴奋性传导和导致等G l u兴奋性氨基酸大量释放、 再摄入减少 2。上述因素均导致细胞内C a2 +超载, 激活蛋白酶、 蛋白激酶等, P K C的移位激活进一步 促进细胞内钙超载, 而钙超载又可激活P K C 3, 形 成恶性循环, 最终神经细胞膜降解、 细胞骨架解体、 D N A断裂, 神经细胞死亡。P K C抑制剂可以通过 抑制P K C移位激活而达到防止其
15、引起的缺血损伤。 448 江苏医药2 0 0 5年1 1月第3 1卷第1 1期 J i a n g s uM e dJ,N o v e m b e r 2 0 0 5,V o l 3 1,N o . 1 1 灯盏花素是从灯盏花中提取的, 其有效成分为 黄酮, 由于其有扩血管、 活血化瘀作用而广泛应用于 缺血性心脑血管病的治疗。目前研究发现它可部分 阻滞脑缺血再灌注所致的胞浆成分P K C( P K CC) 活 性下降和胞膜成分P K C( P K CM) 活性的增加, 具有 良好的抑制P K C的移位激活、 防止钙超载、 保护神 经细胞的作用 4。 本实验结果表明: 脑缺血后N a + - K
16、 + - A T P酶 和C a 2 + - A T P酶活性下降同A T P含量减少同步, 再 灌注后恢复了血氧供应, A T P的产生得到部分恢复 并为A T P酶提供了能量, 酶活性有所恢复, 但随着 再灌注的进行, 能量状况发生进一步恶化,A T P酶 活性亦明显降低, 提示两者具有明显相关性。使用 灯盏花素后, 可明显增加脑缺血及再灌注后A T P 含量和酶活性, 在一定程度上抑制了G l u、A s p的大 量释放, 增加了重摄取并转化G l n, 并增多G A B A 含量, 从而降低了神经细胞的缺血再灌注损伤。 参考文献 1 张焰, 陈群, 颜学军, 等. 灯盏花素对沙土鼠缺血
17、再灌注损伤的影 响.临床麻醉学杂志,2 0 0 1,1 7:6 2 2 - 6 2 4 . 2 罗跃娥, 刘斌. 谷氨酸和蛋白激酶C在脑缺血 / 再灌注损伤中作 用及机制研究概述.天津医科大学学报,2 0 0 4, 增刊:1 6 2 - 1 6 5 . 3 帅杰, 董为伟. P K C抑制剂灯盏花素对缺血 / 再灌注脑损害的作 用研究.中国药理学通报,1 9 9 8,1 4:7 5 - 7 7 . 4 陈康宁, 董为伟. 蛋白激酶C抑制剂对脑缺血大鼠突触体游离钙 的影响.第三军医大学学报,2 0 0 0,2 2:1 2 - 1 4 . ( 收稿日期:2 0 0 5 - 0 3 - 1 0) (
18、 供稿编辑: 张国楼) 论著 孟鲁司特对哮喘豚鼠肺血管通透性的影响 张 浩 陈 亮 甄福喜 【 摘要】 目的 研究孟鲁司特(m o n t e l u k a s t,MK) 对哮喘豚鼠肺血管通透性和肺泡灌洗液 (B A L F) 中一氧化氮(N O) 水平的影响, 探讨MK拮抗哮喘气道炎症的机制。方法 制备卵白蛋白致 敏豚鼠哮喘模型。通过豚鼠引喘潜伏期和跌倒率的变化评价MK对哮喘的拮抗作用; 苏木精-伊红 (H E) 染色观察肺组织炎症的改变; 伊文思蓝分光光度法测定哮喘豚鼠肺血管的通透性; 硝酸还原酶 法测定B A L F中N O的含量。结果 MK治疗组致敏豚鼠引喘潜伏期延长, 跌倒率降低
19、, 肺组织炎 症减轻; 肺组织提取液中伊文思蓝含量及B A L F中N O含量显著降低, 与模型组相比差异有显著性。 结论 降低B A L F中N O水平和肺毛细血管通透性, 是MK拮抗哮喘气道炎症的重要机制。 【 关键词】 白三烯受体拮抗剂;孟鲁司特;哮喘 T h e e f f e c t o fm o n t e l u k a s t o np u l m o n a r ym i c r o v a s c u l a rp e r m e a b i l i t y i na s t h m a t i cg u i n e ap i g s 4 , “ + 5 , ( 2,6 ,
20、 7 +$ % ( * 3,4 , 7 +0 ? %M+ ( * A % * 3E - = % O ( /; * % Q - N P % . C,+ ( * A % * 32 1 0 0 2 9,6 , ) + “ 【A b s t r a c t】 O b j e c t i v e T os t u d y t h e e f f e c t o fm o n t e l u k a s t o np u l m o n a r ym i c r o v a s c u l a rp e r m e a - b i l i t y a n d t h e l e v e l o fN Oi
21、 nb a r b o t a g e a l v e o l a r f l u i d(B A L F)o f a s t h m a t i c g u i n e ap i g s,a n de x p l o r e t h e p o s s i b l em e c h a n i s mo f a n t i - a i r w a y i n f l a m m a t i o n o fm o n t e l u k a s t . M e t h o d s E x p e r i m e n t a l a s t h m am o d - e l o f g u i
22、n e a p i g sw a s e s t a b l i s h e db y o v a l b u m i n i n v i v o . T h e a n t a g o n i s t i c e f f e c t o fm o n t e l u k a s t o n a s t h - m a t i cg u i n e ap i g sw a s e v a l u a t e db y t h e c h a n g e s o f a s t h m a t i c l a t e n c y a n d t u m b l e r a t i o . T h
23、 e i n f l a m m a - t i o n i n t h e l u n g so f a s t h m a t i cg u i n e ap i g sw a so b s e r v e r e db yH Es t a i n i n g .W eu s e de v a n sb l u es p e c - t r o p h o t o m e t r y f o r d e t e r m i n a t i o no f p u l m o n a r ym i c r o v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y .
24、T h e c o n t e n t o f n i t r i c o x i d e (N O)i nB A L Fw a sd e t e c t e db yt h em e t h o do fn i t r o r ed u c t a s e . R e s u l t s M o n t e l u k a s tp r o l o n g e dt h e a s t h m a t i c l a t e n c ya n d r e d u c e d t u m b l e r a t i oo f a s t h m a t i cg u i n e ap i g
25、s . A f t e r t r e a t e dw i t hm o n t e l u k a s t, t h e a i r w a y i n f l a m m a t i o no f a s t h m a t i c g u i n e ap i g sw a s r e l i e v e d,a n d c o n t e n t s o f e v a n sb l u e i n l u n g t i s - s u e s a n dN O i nB A L Fw e r e l o w e r e d s i g n i f i c a n t l y .
26、C o n c l u s i o n L o w e r i n g t h e l e v e l o fN O i nB A L Fa n d p u l m o n a r ym i c r o v a s c u l a rp e r m e a b i l i t y i s a n i m p o r t a n tm e c h a n i s mf o rm o n t e l u k a s t t oa n t a g o n i z e a s t h - m a t i c a i r w a y i n f l a m m a t i o n . 【K e yw o r d s】 L e u k o t r i e n e r e c e p t o r a n t a g o n i s t;M o n t e l u k a s t;A a s t h m a B % ( * 3 P E - =B,+ 2 Q - I : - N2 0 0 5,3 1(1 1) :8 4 5R8 4 7 M 作者单位:2 1 0 0 2 9 南京医科大学 548 江苏医药2 0 0 5年1 1月第3 1卷第1 1期 J i a n g s uM e dJ,N o v e m b e r 2 0 0 5,V o l 3 1,N o . 1 1