《热休克蛋白27在耳蜗基底膜上的表达及其意义.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《热休克蛋白27在耳蜗基底膜上的表达及其意义.pdf（4页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、实验研究 热休克蛋白 27 在耳蜗基底膜上的表达及其意义* 梅玲1黄治物1凡启军1肖伯奎1 【摘要】 目的探讨热休克蛋白 27 （HSP27） 在耳蜗基底膜上的分布及意义。方法应用免疫荧光标记技术和 激光扫描共聚焦显微镜技术 （laser scanning confocal microscopy， LSCM） 检测 HSP27 在正常成年大鼠耳蜗基底膜上的表 达。结果HSP27 主要表达于耳蜗基底膜 Corti 器中外毛细胞的表皮板及其侧壁、 内外柱细胞表面、 外柱细胞的头、 体及其足板， 而内毛细胞及其它支持细胞上未见其表达。结论在发育成熟的正常耳蜗中， HSP27 主要是通过稳定 肌动蛋白
2、微丝的正常结构， 维持细胞骨架的稳定， 维持耳蜗内活性氧在正常水平及执行分子伴侣的功能， 保护细 胞， 从而达到维持耳蜗正常生理功能的作用。 【关键词】 热休克蛋白 27； 基底膜； 激光扫描共聚焦显微镜； 外毛细胞 【中图分类号】 R339.16【文献标识码】 A 【文章编号】 1006 - 7299 （2006） 03 - 0193 - 03 Expression of Heat Shock Protein 27 in the BasiIar Membrane of Rat CochIea Mei Ling， Huang Zhiwhu， Fan Qijun， et aI. （Departm
3、ent of OtoIaryngoIogy - Head and Neck Surgery， Renmin HospitaI of Wuhan university， Wuhan， 430060， China） 【Abstract】 ObjectiveTo investigate the distribution of heat shock protein 27 （HSP27）in the basilar membrane of rat co- chlea.MethodsLaser scanning confocal microscopy （LSCM）combined with immune
4、- fluroscence histochemistry was performed in this expriment.ResuItsLSCM showed HSP27 staining was localized in the curticular plate and lateral wall of outer hair cells， the apical region of inner and outer pillar cells，the head， body and footplate of outer pillar cells.HSP27 immunolocalization was
5、 not found in inner hair cells.ConcIusionIn the basilar membrane of mature cochlea of rat， HSP27 may play different roles in cy- toprotective effects， such as a molecular chaperone to regulate cytoskeleton and modulation of oxidative stress. 【Key words】 Heat shock protein 27； Basilar membrane； Laser
6、 scanning confocal microscopy（LSCM） ； Outer hair cell 热休克蛋白 （heat shock protein， HSP） 是在结构上 拥有高度保守晶体蛋白序列的一组多肽， 是一类应 激蛋白。依据它们的分子量大小、 结构和功能， 将热 休克蛋白分成 5 大类： HSP110、 HSP90、 HSP70、 HSP60 和小分子量热休克蛋白亚家族 （small heat shock pro- tein， sHSP） 。HSP27 是小分子量热休克蛋白亚家族 的成员之一。耳蜗基底膜， 特别是 Corti 器， 是生物 体中一类特殊的感受器， 其感受形式
7、表现为基底膜 的振动。在前期工作中我们应用免疫组织化学 SP 法检测到 HSP27 表达于正常大鼠耳蜗 1， 而 HSP27 在耳蜗基底膜上精确的分布及意义值得探讨。本次 研究应用免疫荧光标记技术和激光扫描共聚焦显微 镜 （laser scanning confocal microscopy， LSCM） 观 察 了 HSP27 在耳蜗基底膜上的分布， 并探讨这种分布的 意义。 * 国家自然科学基金资助项目 （编号30000190） 1武汉大学人民医院耳鼻咽喉 - 头颈外科 （武汉430060） 作者简介： 梅玲， 女， 湖北人， 硕士研究生， 主要从事听力学研究 通信作者： 黄治物 （Ema
8、il： Huangzw086 ） 1材料与方法 1.1实验动物 60 天龄健康 Wistar 大鼠 （购自湖北省预防医学 科学院动物试验中心） 20 只 （40 耳） ， 体重 180 200 克， 雌雄不拘， 耳廓反射灵敏， 无强噪声暴露及耳毒 性药物应用史。 1.2试剂 山羊抗 HSP27 多克隆抗体购自 Santa Cruz 生物 技术公司， FITC 标记的兔抗山羊 IgG 及正常兔免疫 血清购自北京中山生物技术有限公司。其它试剂均 为国产分析纯。 1.3实验方法 将大鼠快速断头处死， 取出双侧听泡， 打开听泡 暴露耳蜗， 蜗尖和圆窗膜各钻一小孔， 4%多聚甲醛 固定液灌流及浸泡固定
9、2 小时； 磷酸缓冲液漂洗后， 解剖显微镜下去除耳蜗骨性外壳、 膜性外侧壁及盖 膜， 分离出耳蜗基底膜， 0.3%TritonX - 100 浸泡基底 膜 30 分钟， 磷酸缓冲液漂洗； 正常兔血清作非特异 性阻断后， 耳蜗基底膜标本置入可与 HSP27 的羧基 391 听力学及言语疾病杂志 2006 年第 14 卷第 3 期 末端的抗原决定族结合的山羊抗 HSP27 多克隆抗 体 （1： 25， Santa CruI， SC - 1048） 4孵化 48 小时， 磷 酸缓冲液漂洗后， 将标本置入 FITC 标记的兔抗山羊 IgG 中 （1： 25， 北京中山生 物 技 术 有 限 公 司，
10、2F - 0314） 4孵化 12 小时， 耳蜗基底膜铺于单凹载玻片 小凹内， 缓冲甘油封片。以磷酸缓冲液代替一抗作 阴性对照 （5 耳） 。对标本同一区段行垂直于载玻片 平面的 Z 轴连续光学切片， Leica TCS SP - 2 AOBS 激 光扫描荧光显微镜 （针孔 1.00） 观察标本。 2结果 激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察， 阴性对照 组 5 耳， 视野中无绿色荧光， 实验组 35 耳 HSP27 的 阳性表达部位发绿色荧光。当激光束聚焦于标本表 面时， 发现 HSP27 表达于外毛细胞的表皮板， 内、 外 柱细胞表面 （图 1） ； 随着扫描深度增加， 发现外毛细 胞侧壁 （图
11、 2、 3） 外柱细胞的头、 体及其足板的侧壁 （图 4） 亦见 FITC 标记的 HSP27 阳性表达， 而内毛细 胞及其它支持细胞始终未见阳性表达。 3讨论 HSP27 是小分子量热休克蛋白亚家族的重要一 员， 其重要的生物学功能是保护细胞免受各种应激 因素的损伤， 此外， HSP27 也可参与细胞的增殖、 分 化及细胞凋亡的信号调节等。在生物体内， 主要有 两种 HSP： 构成型和诱导型。作为 HSP 家族的一员， HSP27 也分为构成型和诱导型。构成型 HSP 在生理 状态下表达， 与细胞的分化、 发育密切相关； 诱导型 HSP 主要在外界环境的刺激下表达， 具有保护细胞 的功能。L
12、eonova 等 2发现 HSP27 主要分布于成年 雄性 SD 大鼠耳蜗基底膜上外毛细胞的表皮板及其 侧壁和内、 外柱细胞表面。本实验结果发现， 在正常 成年大鼠耳蜗的基底膜， HSP27 不仅分布于外毛细 胞的表皮板及其侧壁和内、 外柱细胞的表面， 在外柱 细胞的头、 体及足板也有分布， 与 Leonova 的研究结 果一致。 3.1HSP27 对细胞骨架的作用 HSP27 是细胞骨架的重要调节剂， 特别是对肌 动蛋白形成的微丝有主要调节作用 3。肌动蛋白广 泛分布于几乎所有的听觉上皮细胞， 毛细胞的纤毛、 表皮板、 外毛细胞的侧壁、 柱细胞、 Deiters 细胞等 4。 听觉的产生依赖
13、于基底膜内不同细胞结构间的相互 作用。Fridberger 等 5研究了离体的活耳蜗基底膜 振动时 Corti 器内部的剪切力， 发现在内毛细胞下区 域的运动很小， 可以忽略不计， 内毛细胞和内柱细胞 形成了一易变形区域， 外毛细胞和外柱细胞的体均 有明显的放射状位移 （radial displacement） ， 在耳蜗基 底膜振动中， 外毛细胞表现为细胞体的弯曲， 外柱细 胞呈现整体强直样运动 （rigid - body type motion） 。 Olson 和 Moutatin 6在活体动物耳蜗基底膜上也观察 到了这种现象， 他们发现外柱细胞下的基底膜较其 周围区域有明显的劲度 （s
14、tiffness） 增加。外毛细胞的 弯曲依赖于细胞的劲度， 外毛细胞轻微的劲度改变 就可改变基底膜和表皮板间的有效机械耦联， 进而 影响网状板和纤毛束的运动 5。支持细胞刚性的丧 失、 盖膜和基底膜间去耦联， 可致听觉敏感度下降， 这种现象会随着年龄增加而出现 7。细胞骨架对维 持外毛细胞的劲度和外柱细胞刚性起到了重要作 用。本实验结果显示 HSP27 同肌动蛋白在基底膜 上的分布基本一致， 提示在正常生理状态下， HSP27 可调节和稳定肌动蛋白微丝， 维持细胞骨架结构的 完整性， 有助于正常听觉处理过程的完成。这种分 布特征与内、 外毛细胞及内、 外柱细胞在耳蜗基底膜 振动中的运动方式密
15、切相关， 表现为结构与功能的 一致性。 3.2HSP27 可抑制活性氧产生 耳蜗是有氧代谢旺盛的器官， 维持外毛细胞和 内淋巴间的电化学梯度， 基底膜的调谐振动都是能 量依赖性的 8， 都有活性氧 （reactive oxygen species， ROS） 产生。Sha 等 9证实外毛细胞对氧化损伤尤其 敏感， 内 毛 细 胞 能 耐 受 ROS 10。一 些 研 究 显 示 sHSP， 尤其是 HSP27 可通过促进谷胱甘肽 （GSH） 自 身氧化还原循环， 提高葡萄糖 - 6 - 磷酸脱氢酶活 性， 使胞内 GSH 的水平增高， 抑制 ROS 产生 11。本 实验结果显示， 外毛细胞上有
16、 HSP27 表达， 而内毛 细胞上未见其表达， 这恰好满足了耳蜗基底膜正常 调谐振动过程中抗氧化的需要。 3.3HSP27 执行分子伴侣的功能 分子伴侣是一类能协助其它多肽进行正常折 叠、 组装、 转运、 降解的蛋白质， 并在 DNA 的复制、 转 录细胞信号转导及微管的形成和恢复过程中发挥重 要作用。HSP27 还可作为分子伴侣参与细胞的各种 代谢活动、 蛋白质的折叠、 亚基的形成、 细胞内运输 以及蛋白质降解等过程， 以调节靶蛋白的活性和功 能， 但不参与靶蛋白的组成 12。在热休克、 缺血、 缺 氧等应激情况下， 大量蛋白质遭到破坏， 被破坏的蛋 白质易聚合而激活凋亡途径。HSP27
17、可抑制热休克 过程中蛋白的合成， 使真核细胞中未折叠的蛋白质 的量减少， 错误折叠的蛋白质降解， 从而减少对细胞 的破坏作用。本实验结果提示， 在正常情况下， 大鼠 耳蜗中 Corti 器中的 HSP27 可能主要执行分子伴侣 的功能。 总之根据本次实验结果， 推测在正常成熟大鼠 （下转第 201 页） 491Journal of Audiology and Speech Pathology 2006.Vol 14.No.3 交感颈上神经节切除前后的豚鼠进行了 ABR 检测。 发现单侧颈上神经节切除后， 只在短时间内影响了 ABR 的-波间期， 但其反应阈没有明显变化。 可以认为， 豚鼠单侧交
18、感颈上神经节切除后所引起 的耳蜗微循环变化， 并没有造成其听力的损失。在 此基础上， 研究中对单侧颈上神经节切除后 1 周的 豚鼠给予噪声干预， 以 115 dB、 4 000 Hz 纯音连续刺 激 200 分钟后， 颈上神经节切除术侧的 ABR 阈移明 显低于对照耳， 以上结果提示颈上神经节切除对噪 声性耳蜗损伤有一定的保护作用， 这种保护作用是 双侧的， 但以同侧更为显著。有学者认为这种保护 作用可能与颈上神经节切除导致橄榄耳蜗传出系统 功能变化有关 9， 但是否受到颈上神经节切除后耳 蜗局部微循环变化的影响尚不能明确。总之， 可以 推测分布于耳蜗的交感神经纤维参予了耳蜗微循环 的调节，
19、颈交感神经节切除对豚鼠耳蜗血流及听觉 生理功能具有一定的影响， 其内在机理以及失交感 神经支配后耳蜗血流自主调节功能的变化尚有待进 一步深入研究。 4参考文献 1Wangemann P，Wonneberger K. Neurogenic regulation of cochlear blood flow occurs along the basilar artery，the anterior inferior cere- bellar artery and at branch points of the spiral modiolar artery J . Hear Res，2005， 209
20、： 91. 2Lyon MJ，Payman RN. Comparison of the vascular innervation of the rat cochlea and vestibular system J .Hear Res， 2000， 141： 189. 3Gil - Loyzaga P，Vicente - Torres MA，Arce A. Effect of superior cervical ganglionectomy on catecholamine concentration in rat cochlea J .Brain Res， 1998， 779： 53. 4L
21、aurikainen EA，Ren T，Miller JM. The tonic sympathetic input to the cochlear vasculature in guinea pig J .Hear Res， 1997， 105： 141. 5马芙蓉， 李学佩， 王伟 .颈上神经节切除对椎基底动脉供血障碍 时耳蜗血流的影响 J .北京医科大学学报， 1997， 29： 51. 6邱建华， 乔莉， 刘顺利 .耳蜗血管交感及感觉神经双重调节的形 态学证据 J . 听力学及言语疾病杂志， 2004， 12： 96. 7Hozawa K， Kimura RS. Cholinergic
22、 and noradrenergic nervous systems in the cynomolgus monkey cochleaJ . Acta Otolaryngol， 1990， 110： 46. 8Watanabe K，Sugimoto T，Tsunoda A.Effect of sympathectomy on cap- illaries of the cochlear lateral wallJ . ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec， 1990， 52： 205. 9Giraudet F，Horner KC，Cazals Y. Similar
23、half - octave TTS protec- tion of the cochlea by xylazine/ketamine or sympathectomy J . Hear Res， 2002， 174： 239. （本文图 1， 2 见插图第 3 - 2 页） （2006 - 01 - 06 收稿） （本文编辑雷培香） （上接第 194 页） 耳蜗中， HSP27 主要通过执行分子伴侣的功能， 稳定 肌动蛋白微丝的正常结构， 维持细胞骨架的稳定， 抵 抗基底膜的振动过程中细胞承受的机械压力， 维持 耳蜗内活性氧在正常水平， 从而达到保护细胞、 维持 耳蜗正常生理功能的作用。已知外
24、毛细胞是耳蜗中 最脆弱的部分 13， HSP27 表达于外毛细胞可能是起 到一种前保护 （pro - protecting） 的作用。 4参考文献 1凡启军， 黄治物， 梅玲， 等 .水杨酸钠作用后大鼠耳蜗、 热休克蛋 白 27 表达的研究 J .听力学及言语疾病杂志， 2005， 13： 47. 2Leonova EV， Fairfield DA， Lomax MI， et al. Constitutive expression of Hsp27 in the rat cochlea J . Hea Res， 2002， 163： 61. 3Concannon CG，Gorman AM，Sa
25、mali A. On the role of HSP27 in re- gulating apoptosis J . Apoptosis， 2003， 8： 61. 4Pack AK，Slepecky NB. Cytoskeletal and calcium - binding proteins in the mammalian organ of corti： cell type - specific proteins displaying longitudinal and radial gradients J . Hea Res， 1995， 91： 119. 5Fridberger A，
26、Boutet de Monvel J，Ulfendahl M. Internal shearing within the hearing organ evoked by basilar membrane motion J . The Journal of Neuros Sience， 2002， 22： 9 850. 6Olson ES， Mountain DC.Mapping the cochlear partition， stiffness to its cellulararchitecture J .J Acoust Soc Am， 1994， 95： 395. 7Saha S，Slep
27、ecky NB. Age - related changes in microtubules in the guinea pig organ of Corti. Tubulin isoform shifts with increasing age suggest changes in micromechanical properties of the sensory epithelium J . Cell Tissue Res，2000， 300： 29. 8Brass D， Kemp DT. Analyses of mssbauer mechanica measure men- tsidic
28、ate that the cochlea is mechanically active J . J Acoust Soc Am， 1993， 93： 1 502. 9Sha SH，Taylor R，Forge A， et al. Differential vulnerability of basal and apical hair cells is based on intrinsic susceptibility to free radicals J .Hea Res， 2001， 155： 1. 10Meyer zum Gottesberge AM， Felix H， Reuter A，
29、et al. Ultrastructural and physiological defects in the cochlea of the Mpv 17 wouse strain.A comprison between yong and old adult animals J . Hear Res， 2001， 156： 69. 11Preville X， Salvemini F， Giraud S， et al. Mammalian small stress pro- teins protectagainst oxidative stress through their ability t
30、o increase glucose - 6 - phosphate dehydrogenase activity and by maintaining op- timal cellular detoxifying machinery J .Exp Cell Res， 1999， 247： 61. 12Hart FU，Hayer - Hart M. Molecular chaperones in the cytosol： from nascent chain to folder protein J .Science， 2002， 295： 1 852. 13Hawkins JE. Comparative otopathology ： aging，noise， and ototoxic drugs J .Adv.Otorhinolaryngol，1973， 20： 125. （本文图 1 4 见插图第 3 - 1 页） （2005 - 11 - 07 收稿） （本文编辑曹永茂） 102 听力学及言语疾病杂志 2006 年第 14 卷第 3 期