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1、中国药9学 通报C h i n e mP h o r m a c o l o g ic a l B u l l e t i n 2 0 0 1 m; 1 7 ( 3 ) : 2 7 5 - 8 2 7 5 牛主动脉内皮细胞乙酞胆碱激活蛋白介导的胞内钙离子变化 王莉莉丁建花汪 海 ( 军事医学 科学院毒物药物研究所， 北京 0 0 8 5 0 中国图书分类号R - 3 3 2 ; R 3 2 2 . 1 2 1 ; 8 3 2 9 . 2 4 ; 8 3 4 5 . 5 7 ; R 3 4 8 . 2 ; 8 3 9 4 . 2 ; 8 9 7 1 . 9 1 文献标识码A文章编号1 0 0 1
2、 - 1 9 7 8 ( 2 0 0 1 ) 0 3 -0 2 7 5 - 0 4 摘要目的研究主动脉内皮细胞乙酸胆碱激活蛋白 ( E P A ) 介导 胞内钙离子变化的特征， 并探讨培养牛主动脉内 皮细胞E P A功能的变化。方法以F u o- 3 , F - 2 为荧光探 钊， 采用共聚焦和荧光光度法测定内皮细胞 cal3 。结果 A c h 能 够引 起体外培养6 代以内内 皮细胞 以 I I 、 的 增 加; A c h 激发的内皮细胞 以 + 、 信号表现为瞬时性单次或 连续2 次的钙振荡， 具有异时性和快速耐受的特点。未观察 到烟碱和其它M受体激动剂引起的 口 . I 、 变化。
3、A c h 对 胞内 C a t 十 浓度的作用以原代细胞增加最为明显， 但随培 养时间的延长 此效应逐渐减弱， 至1 3 代后无效应。结论 血 管内 皮细胞乙酞胆碱激活蛋白激活能介导胞内钙离子的 增高， 经培养后 E P A功能丧失 关健词 A c h ; 血管内 皮细胞; C d + ; 细胞培养 激活内皮细胞乙酞胆碱激活蛋白( E P A ) 介导内 皮依赖性舒血管反应作为检验血管内 皮细胞功能的 指 标应用己 有2 0 年 1 .2 1 。 但是， 血管内 皮细 胞单层 分布、 体外培养时E P A效应极易丧失的特点， 极大 地阻滞了 对E P A分子结构、 受体类型及其效应机制 的
4、研究及阐明 3 1 内 皮细胞 Ca2 十 ， 增加是E P A激活， 介导内皮 依赖舒血管反应重要的信使物质， 与A c h 引起的E - D R F 和P C s 释 放、 内 皮细胞超极化密切相关 4 1 。 近 年 来， 有研究同时观察A c h 诱导内 皮依赖舒血管功 能 反 应与内 皮细胞 c a t ; 变化 5 1 。 表明， 内 皮细 胞 C a t 十 1 与E P A 激活状态密切相关。 但是， 内皮细胞在离体条件下， 特别经体外培养 后， A c h 引起的E D R F 释放量显著降低， 甚至完全丧 失“ ; 采用膜片钳和显微荧光法观测到A c h 引起的 2 0 0
5、 0 - 1 1 1 5 收稿 2 0 0 1 -0 1 - 1 8 修回 ， 国家重点基础研究发展规划项目 资助课题, N o G . 1 9 9 8 0 5 1 1 1 2 ， 南京医 科大学生理药 理学系， 南京 2 1 0 0 2 9 作者简介: 王莉莉， 女， 3 7 岁 医学博士. 博士后， 从事心血管分子药 理学研究; 汪海， 男. 3 6 岁， 博上生导师 内 皮细胞厂 C a t 十 ， 变化在动物不同种属、 同种动物 而不同实验者也无一致结论。如在原代培养的兔主 动脉血管内 皮细 胞上， A c h 剂量依赖引 起 c2 a 升 高 或内皮细胞超极化反应 7 1 ， 而在牛
6、主动脉血管内 皮 细胞结论不一 “ 。牛主动脉血管内皮细胞是来 源较为丰富的实验材料。因此， 本实验采用共聚焦 和荧光光度法， 系统研究A c h 对离体培养不同时期 牛主动脉内皮细胞 Ca2 + I ， 的影响特征， 确定具有 功能性E P A内 皮细胞的培养时期， 并初步分析E P A 功能丢失原因。 1 材料与方法 1 . 1 试荆与药品F u r a - 2 , F l u o- 3 , A T P和I 一 胶原 酶均为S i g m a 公司 产品。胎牛血清， 新生牛血清及 D ME M为G i B o 产品。 1 . 2 内 皮细胞的分离、 培养及鉴定 无菌条件下取 未进食新生小牛
7、主动脉， 去除粘连及脂肪组织， 用生 理盐水冲洗， 截取5 - - 6 c m长血管段， 结扎分支和下 端开口， 注人 1 9 6 1 型胶原酶溶液， 3 7 1 v , 巧m i n 2 次， 收集消化液， 并用D ME M洗2 - 3 次， 液体与消 化液合并， 离心， 用含1 0 %的胎牛血清的D ME M培 养 液悬浮细胞， 种植于 % 孔板和培养瓶中， 置 3 7 -C, 0 . 0 5 C 诀孵箱中 培养。同时将剩余主动脉血 管， 纵向剖开， 用细胞刮刀轻取内皮细胞置培养液 中， 轻轻吹散种植于9 6 孔板和培养瓶中， 3 7 -C , 0 . 0 5 C 飞孵箱中培养。细胞长至融
8、合， 按1 : 2 进行传代。 以珊因子相关抗原阳 性和鹅卵石样单层排列的形态 特征鉴定内皮细胞。 1 . 3 荧光双波长法测定内皮细胞【 C a t 。取生长 刚 至融合、 状态良好细胞， 胰酶消化。3 7 t , 0 . 0 5 C U 2 孵 箱中 负 载F u r a - 2 ， 终 浓 度5 u m o l “ I 一 。 以D H a n k ， 洗细胞2次， 并以H a n k s 悬浮计数细胞 3 X 1 0 “ - - 5 X 1 0 - L - 1 ， 取2 m l 细胞悬液， 于比色杯槽 中， 3 7 C 稳定5 m in ， 开始测定。E x i t a 分别为3 4
9、0 n m和3 8 0 = , E m i t 7. 为5 0 0 n m， 激发光光栅5 n m o 发射光光栅1 0 n m， 基线平稳后依次加人激动剂， 记 录 时 程为5 一 7 m in 。 按下式计算 。一 : 【 c w 十 1 = K d ( F一 F ,; ) A F 二一 F ) 9 , 分别以0 . 2 % T r i t o n X - 1 0 0 和5 m m o l “ L - 1 E G T、 读取F 二和F,; o 万方数据 2 7 6 中国 药 9学通 报 C h i n e s e P h a r m a c a lo g ic a l B u l l e
10、t i n 2 0 0 1 J u n ; 1 7 ( 3 ) 1 . 4 共 聚焦测定单个内 皮细胞 C a “ I ， 改 变9 6 孔板中， 培养1 d 内皮细胞用无血清D ME M洗2 - - 3 次， 3 7 C , 0 . 0 5 C 0 2 孵箱中负载F l u o- 3 ， 终浓度5 p m o l “ I 一 。以H a n k s 洗细 胞2 次， 在M e r d ia n 公司 U h i m a 型 激光扫描共聚焦显微镜进行检测。激发 波长4 8 8 n m, A r +激光器， 检测波长5 3 0 n m / 3 0 o 以F I u o- 3 荧光强度的改变表示胞
11、内 C a t 十 ; 的变 化 ( “ ! 。 1 . 5 给药方式2 种测定方法均为在基线平稳后 给予不同浓度的胆碱能激动剂， 最后用能有效升高 内 皮细胞 以 干 的A T P 鉴定内 皮细胞功能状态。 A T P 能显著 升高仁 C a F 十 1 、 的内皮 细胞为有 效细胞。 1 . 6 数据处理 统计学分析采用组间t 检验方式。 2 结果 2 . 1 A c h 对原代培养内皮细胞仁 C a t 。 影响 2 . 1 . 1 A c h对原代培养 2 2 - - 2 4 h内皮细胞 【 CR2 十 ， 改变以F l u o- 3 为荧光探针， 用共聚焦方 法对3 株( E C 5
12、 3 1 , E C 6 0 7 , E C 6 2 2 ) 、 培养2 2 - 2 4 h 牛 内 皮细胞测定1 1 次; 以A T P 能 够诱导【 以 十 . 升高 的细胞为有效细胞， 共记录细胞 ， = 6 3 个。 A c h 能 够 引 起内 皮细胞t Ca2 . 一过性增加的细胞主要为 E 0 6 0 7 株细 胞; 分别对采用 机械法和酶法分离的 此 株2 4 个 细 胞进行测定; 出现一过性【 cz . 增加有 1 1 个细胞， 为所检测此株细胞总数的4 5 . 8 9 6 ; 其中 酶法分离细胞61 2 ， 机械法分离细胞5 / 1 2 ， 所占比 率基本相同。 A c h
13、 引起的内 皮细胞 C a t 十 ; 一过性 增加在给药后5 一1 0 s 内即达峰值， 约为静息时一 倍。1 0 。 或稍长时间， 回 落到静息状态， 个别细胞表 现为连续两次振荡。A c h起效浓度主要为 1 , 1 0 li m o l “ L - ， 低浓 度诱 导出的一过性【 C a t +， 增加， 不 为高 浓度增强( 见图1 ) 。提示， 内皮细胞对于A c h 表 现为快速耐受。此外， A c h 最大效应显著弱于 A T ， 诱导的最大效应。绝大多数未有明显反应， 机 械分离与酶法分离内皮细胞无差异。上述结果表 明， 体外培养 2 4 h 以内的内皮细胞， A c h能诱
14、导 C a 2 +; 的 增加， 但不同 个体的内 皮细胞， 对A c h 的 反应敏感性存在较大的差异性。 2 . 1 . 2 原代培养5 - - 7 d内 皮细胞 。平 十 1 、 改变 以F u r a - 2 为荧光探针， 采用双波长荧光光度法测定 A c h 等胆碱能激动剂对血管内 皮细胞影响结果见表 1 , 2 . A T P 1 0 p n io 1 - L - 能 够引起L C a t 7 的成 倍增 加。表明该实验体系内皮细胞状态良好。随A c h 剂 量 增加， 内 皮细胞 C a 2 + I ; 呈上升 趋势， 无统计学 意义; 但从仁 口 + 1 ; 变化率上 来看,
15、A c h 1 0 tm o l “ L - t 能 促 进 胞 内 C a t I 增 加( P 0 . 0 5 ) 0 1 0 1a m o l - L - 槟榔碱， 氧化震颤素， 毛果芸香碱， 尼古丁则对 汇 ) 2 + ; 无影响。 2 . 2 A c h 对传代血管内 皮细胞【 ,C a 1 + I . 影响 由 表 1 可 见， 传 代5 - - 6 次 后， A c h 1 0 t m o l “ L - 仍显 著 增 加内 皮细胞的 C a 2 + , ， 但较原代培养细胞对A c h 的 反应性略有降低， 提示: 经传代培养至5 一 6 代， 内 皮 细胞仍保留对A c h
16、的反应性。 血管内 皮细胞传至1 3 一1 4 代， 此时， 随A c h 浓 度的 增加， 内皮细胞 C a t + 1 . 已无变化。 增加胞外 c2 . 浓度仍不能增加内皮细胞对A c h 的反应性。 2 . 3 培养不同时期血管内皮细胞对A c h 的反应性 的 变化 A c h 从0 . 1 JA m a 卜 I 一 起， 血管内 皮细胞对 A c h 的反应性就表现为随培养时间的延长， 敏感度 下降。至1 3 一1 4 代， 内皮细胞完全丧失对A c h的 反应性。提示随内皮细胞体外培养时间的增加， 内 皮细胞上具有功能性的A c h 作用位点逐渐丧失。5 - 6 代前， 内 皮细
17、胞尚 存在功能性的A c h 作用的位 点， 1 3 代后则完全丧失。 T a b 1 E f f e c t o f A c h o n c a “ , o f B A E c in d i f f e re n t c w t - t i m e A c h仁 C a t ,/ % / t. - 1 “ L - l” P r im a ry P 2 - 3 0 . 3土0. 6 1 7 . 8士3 . 5 0 . 7土0 . 5 2. 712. 9 0. 4土3 . 7 5 3士0 2 5 1 2 . 3 士 5 . 6 “ 6 . 2 ! 3 . 3 7 . 6 - 3 . 4 1 .
18、8 土1 . 7 P ; p a s s e g , ;n= 3 -5 ; P0.0 5 ; “P 0 . 0 1v s r e s ti n g T 曲 2 E f n x ts o f t h e 如H i n g e 画t ic a 5甲 价 fis t s o n C a ， * , o f p c i m v y B A E C A g o m i s ( 10 pm ol-L ) C “, I :Ca r l i/ % R e s t in g s t a t e 八r-he 0- 1 -t i . P i lo c a t p in e Ni mt i n e ATP 1 6 1
19、 士1 4 1 6 4士3 7 1 6 7土3 1 1 6 6士3 7 1 6 5士41 2 9 0 13 8 . 0 . 330 . 6 3 . 231 . 7 4 . 132 . 4 3 . 7士1 . 8 3 . 6士2 . 9 9 6 士2 0 a = 3 -5 ; P 0 . 0 5 ; “ P 0 . 0 1 v s -t i. R 3 讨论 本实验结果表明， A c h 能够引起体外培养一定 时期内内皮细胞 C a 2 十 ; 的增加; 以原代细胞增加 最为明显， 但随培养时间的延长， 此效应逐渐减弱， 至 1 3 代后无明显效应; 单个细胞共聚焦观测中， A c h 激发的内
20、皮细胞 份 + l ; 信号表现为瞬时性单 次或连 续2 次的 钙振荡， 与L y n c h 等人用显 微荧光 观测到的复 杂的 钙波可能 相同 L l l ， 具有异时性和快 速耐受的特点。说明， 6 代以内培养的牛主动脉内 皮细胞具有E P A功能， 以原代较好。1 0 p r n o l - L - l 万方数据 中国药理学通报C h .i n v s e P h a r n t rm k tg i c a l B u l l e t i n 2 0 0 1 J -; 1 7 ( 3 ) 2 7 7 槟榔碱， 氧化震颤素， 毛果芸香碱， 尼古丁则对 【 以 + 1 、 无明显影响， 表
21、明， E P A虽然可被A c h 激 活， 与经典的M受体有明确的差异性， 仍有待进一 步证实。 以往的多数研究表明， A c h 不能引起体外培养 内 皮细胞E D R F 的释放。因此推测， 内 皮细胞酶解 或传 代过程使E P A丧失! 1 2 1 。 本实验中 培养l d 内 皮细胞观察表明， 机械分离或酶法分离对E P A无显 著影响， 此外， 即使是采用机械法新鲜分离的内皮细 胞， A c h 处理释放E D R F ， 诱导的最大舒张反应也仅 有1 0 4 6 1 6 1 与本实验中A c h引起原代培养细胞 厂 以 + ， 最大增加也 仅为1 2 % 的作 用程度相似。 提
22、示， 酶解分离内皮细胞叮能不是E P A丧失的主要原 因。 已 知A T P , A 2 3 1 8 7 也是通过激活内皮细胞释 放N O诱导内 皮依赖舒血管作用的物质， 这些物质 在血管功能试验上的强度远小于A c h ， 但诱导的新 鲜分离和体外培养内皮细胞E D R F的释放和c2 . 浓度的 增加却远大于A c h l 1 3 1 。本实验在原代和 传 代培养的内皮细胞上均观察到A T P能有效升高胞 内C a t + 浓度， 提示， 经传代培养的内皮细胞仍保持 良 好C a t + 信号转导功能; 离体内皮细胞， 尤其是在 原代新鲜分离内皮细胞上， A c h 诱发胞内钙离子效 应大
23、幅度降低的主要原因可能是内 皮细胞脱离 在体 状态时， E P A及其所偶联的效应系统信号转导途径 中断。 推测这种情况应在第二信使前的信号传导效 能的显著降低。 综上所述， 新鲜分离及原代培养的内皮细胞仍 不失为 研究E P A基因和受体结构的最有希望的实 验体系。 胞内 C a l 十 ， 变化可以作为鉴定培养血管 内皮细胞存在功能性E P A的 指标。 参考文献 1 F u m h g o i t R F , Z a w a d z k i J v . T h e o b l i g a t o r y m le o f e n d o t h e l ia l c e l ls i n
24、 t h e r e la x a t io n o f a r t e ri a l s m o o t h m u s c le b y a c e t y lc h o l i n e N a t u r e , 1 9 8 0 ; 2 朋: 3 7 3 -6 F t u c h g o t t R F . R o l e o f - d u t h e l i u r n i n r e a p . n s e o f v a s c u l a r s m oot h m u s c l e . C i mR e s , 1 9 8 3 ; 5 3 : 5 5 7 -7 3 C u
25、l f ie ld N T. Mu s c a r i n ia r e c e p t o r - c h a r a c t e r i z a t io n c o u p l in g a n d f u n c t io n . P h a r m a ml T h e r , 1 9 9 3 ; 5 8 : 3 1 9 一7 9 K . r e n a g a R, A n d . J , O h t s u k a A, S a k u m a 1 . C l o s e c o rnl a t i- b e t w e e n c y i o p l a s m i c C a
26、 t l e v e l s a n d r e le a s e o f a n e n d o t h e h u m - d e r i v e d r e le s i n g f a c t o r f r o m c u l t u r e e n d o t h e l is f ce ll s . C e l l S t n - F u r ze, 1 9 9 3 ; 1 8 : 9 5一 1 0 4 Mi w a Y , H i m i a K, K a w a s h i m a5 ，A k i ta H . L y a o p h o u p h a d d y l c
27、h l o in e in h ib i t s r e c e p t o r - m e d i a t e d C a “ m o b il iz a t i o n in i n t a c t e n d o t h e l ia l c e l ls o f r a b b i t - A rt e r io s d - T k mr n b V a s e B i . 1 . 1 9 9 7 ; 1 7 : 1 5 6 1 -7 C k s T M, A u g - J A , C a m p b e l l J H, C a m p b e l l ( ; R . R e le
28、 a s e a n d p r o p e rt i e s o f e n d o t h c h u m - d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r ( E D R F ) f r o m e n l o t h d i a l c e ll s i n c u l t u r e . 1 ( : e l l P h y s i o l , 1 9 8 5 ; 1 2 3 ; 3 1 0 一2 0 l )a n t h u l o r i N R , C y b u ls k y Ml , B r o c k T A . A c h - in
29、d u c e d c a l c i u m r r u c e n t s in p r i n r a r y c u l t u r e s o f r a b b it a o rt ic e n d o t h e l ia l c e l l s . A , n J P h y a “ 1 9 8 8 ; 2 5 5 : H1 5 4 9 -5 3 K o r c n a g a R . R e l e a s e o f e n d o t h e li u m d e r i v e d r e la x i n g f a c t o r ( E - D R F ) f r
30、o m c u l t u r e d v a s c u l a r e n d o t h el i a l c e l l s d e p e n d s o n e x t r a a n d i n t r a c e ll u la r C a r c o n c e n t r a t i o n s . H d ek u id o f g a k u Z n s s h i , 1 9 9 3 : 6 8 ( 5 ) : 7 4 4 一5 4 G r y n k i 二G , P o e m , M, T s ie n R Y . A n e w g e n e r a t i
31、o n o f C a r - i n d ic a t o r s v ri t h g r e a t l y ir n P r o v e d f l u o r e s c e n c e P r o p e rt i e s . J B i o l C h e at, 1 9 8 5 ; 2 6 0 : 3 4 4 0 -5 0 N o v a k 曰， R s b i n n v ft c h P S . I r n p ro v e d s e n s i t iv i t y i n f lo w c y r o r a c t t ic i n t r a c e ll u
32、a r io n i z e d ca l c iu m m e a s u r e m e n t u s i n g f lu :r 3 / F u r a R e d f l u o r e s c e n ce r a t i- C y r a at e r r y， 1 9 9 4 ; 1 7 : 1 3 5 - 4 1 L y n c h M, G i ll e s p ie J 1 , G r e e n w e l l J R , J o h n s o n C . I mr a c e l l u l a r c a l a u m s ig n a t u re s e v
33、 o k e d衍 d if f e r e n t a g o t r s t s i n is o l a t e d b o v i n e a o rt i c e n d o t h e l ia l c e l l s . ( k t d C ! a u . , 1 9 9 2 ; 1 3 : 2 2 7 一3 3 G r y g le w s k i R J , Mo n c a d a S , P a l r n e r 1 2 M. B io a s s a y o f p r ca t a c y c h n a n d e n d o t h el i u m - d e
34、 r i v e d r e la x i n g f a c t o r ( E D R F ) f r o m p o r c i n e s o r t i c e n d o t h el ia l c e ll s . B r J P l u r -t , 1 9 8 6 ; 8 7 : 6 8 5- 9 4 L o e b A L , O w e n s G K, P e a c h MI . E v i d e n c e f o r E n d o t h e l h mr - d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r in c u l
35、 t u r e d ce l l s . H y p e r t e n s i o n , 1 9 8 5 ; 7 : 8 0 4 T h e c h a n g e o f i n t r a c e l l u a r C a t 十 l e v e l r e g u l a t e d b y e n d o t h e l i a l p r o t e i n - a c t i v a t e d b y a c e t y l c h o l i n e i n c u l t u r e d b o v i n e a o r t a e n d o t h e l i
36、a c e l l WA N G L i - L i , D I N G T a n - H u a , WA N G H a i ( I n s t i t u t e ABST RACT o f P h a r m a co l o g y a n d T o x i c o l o g y ， A c a d e m y o f Mi l i t a r y Me d i c a l S c i e n c e s , B e ij i n g 1 0 0 8 5 0 ) A I M T o e x a mi n e t h e c h a n g e o f i n t r a c e
37、 l l u a r C a 十l e v e l r e g u l a t e d b y E P A i n b o v i n e a o r t a F l u o- 3 a n d F u r a - 2 w e r e u s e d in a s s a y in g C a tin e n d o t h e l i u m b y c o n f o c a l m i c r o s c o p y a n d fl u o m p h o - e n d o t h e l i u m o f d i f f e re n t s t a g e s o f c u l
38、 t u r e m in etio n a l t h e t i me t h a t c u l t u r e d e n d o t h e l i u m a n d d e t e r - l o s e s f u n c - 1 o me t r y RES T I L T S A c h c o u l d a c t i v a t e E P A a n d EP AA s fl u o r e s c e n c e p rob e , e l i c i t e t h e C a 十 ; c h a n g e o f e n d o t h e l i u m
39、i n p e r i o d s o f c u l t u r e , e s p e c i a l l y i n p r im a ry s t a g e c erta i n o f c u l - 万方数据 中国药 理学通报 7 i i P h - a t o l o g ic a l B u l le t i n 2 0 0 1 J u n ; 1 7 ( 3 ) : 2 7 8 - 8 1 腺病毒介导的p 5 3 转移对顺铂诱导细胞凋亡的影响 白雪源 马玉香z 周煌崔红 KB 李劲松 ( 军事医学科学院微生物流行病研究所， 北京1 0 0 0 车凤翔 7 1 ) 中国图书分
40、类号R -3 3 2 ; R 3 2 9 . 2 5 ; R 3 7 3 . 1 ; R 3 9 4 . 2 ; R 7 3 9 . 8 ; R 9 7 9 . 1 文献标识码八文章编号1 0 0 1 - 1 9 7 8 ( 2 0 0 1 ) 0 3 - 0 2 7 8 - 0 4 摘要 目的 探讨野生g ! p 5 3 基因对顺铂诱异肿瘤细胞凋 亡的影响。方法 用重组p 5 3 腺病毒( A d p 5 3 ) 和重组!u c 腺 病毒( A d - I. , ) 分别感染p 5 3 缺失的口 腔癌细胞K B , 观察外0 p 5 3 基因对顺铂诱导肿瘤细胞凋亡的影响。结果流式细 胞术和原
41、位末端标记显示用 A d - l u c 与顺铂联合处理 K B 细 胞不能诱导凋亡发生， 用A d 颐3 与顺铂联合处理则诱导出 较明显的细胞凋亡， 表明p 5 3 可增强K E 细胞对顺铂的敏感 性; N o r t h - b lo t 显示颐3 可下 调1 x 1- 2 基因表达及土调b a s 基因的表达。结论1, 5 3 可能通过调节凋亡相关基因的表 达水平而在顺铂诱导的肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用， 重组 p 5 3 腺病毒与 顺铂联合应用有助于克服p 5 3 失活肿瘤细胞 的耐药性 关键词腺病毒; p 5 3 ; 顺铂: 凋亡; 肿瘤细胞 J IM . 铂是目 前常用的一种广谱高
42、效肿瘤化疗药 物， 以前认为该药杀伤细胞的主要方式是坏死， 现认 为 它可通过损伤细胞的D N A而诱导肿瘤细胞凋 亡， 但是在临床化疗中常发现许多肿瘤细胞对该药 产 生耐药 性。为 探讨p 5 3 基因 在顺铂诱导肿 瘤细胞 凋亡中的作用及其与肿瘤耐药性的关系， 本文用重 组腺病毒 作载体分 别将野生型p 5 3 基因 及对照基因 1 - u c 转移到必3 基因缺失的K 73 细胞中， 然后用顺 铂诱导凋亡， 观察导人的外源p 5 3 基因是否可克服 耐药性、 增加肿瘤细胞对顺铂的化疗敏感性 2 0 0 0 - I 1 - 2 3 收稿. 2 0 0 1 - 0 4 - 0 8 再修回 “
43、 军队 九五，. 指令性课题基金资助, N o 9 6 0 8 0 0 2 ， 解放军总医院， 全军肾病研究中心暨重点实验室， 北京1 0 0 0 2 0 2 北京市垂扬柳队院， 北京1 0 0 0 2 0 作者简介 白 雪源 男 3 7 岁. 博士后; 车风翔. 男， 研究员. 陌士生导师 1 材料 1 . 1 主要试剂含人 p 5 3 基因的质粒 p G E M p 5 3 由 军事医学科学院生物丁程所王恒粱博士惠赠， 携 带腺 病毒同源序列的真核表达质粒p A d C M V由美 国宾州大学G u o 博士赠送， 含有腺病毒基因组D N A 的讨 M 1 7 质粒来自 军事医学科学院微生
44、物所扬佩 英教授， 含有萤光素酶( l u c i f c r a s e ) 基因的质粒 P G V E - l u c 由本室保存。b c l - 2和 b a x c D N A系用 R T - P C R 从人细胞中扩增获得并经测序证实。脂质 体L i p o f e c t a m i n 购自G I B ( ”公司， p 5 3单抗购自 S a n t a c r u z 公司。 顺铂购自S i g m a 公司， 用生理盐水 配成6 m m o l “ L - 贮存液， 使用前用培养基稀释到所 需浓度。 1 . 2 细胞株K B 细胞来自中 科院细胞库， 用含有 I x 1 0
45、5 U “ L - 的青链霉素, 2 m m o l - L - t 谷氨酸胺、 体积积分数为1 0 4 6 胎牛血清的R P MI - 1 6 4 0 完全培 养基培养于3 7 1C孵箱中。人胚肾细胞 2 9 3由军事 医学科学院微生物所扬佩英教授赠送， 培养于 M E M完全培养基中。 2 方法 2 . 1 重组p 5 3 腺病毒的 构建、 鉴定、 纯化与滴度测 定 用限 制性内 切酶K p n I , X b a I 将p 5 3 c D N A从 p G E M p 5 3 中切下， 克隆于p A d C MV的K p n I , S p e I 位点之问， 使其受C M V启动子的
46、转录调控， 所得重 组质 粒p A d C M V - p 5 3 含有完整的C M V - 户3 - S V 4 0 - p o l y A基因表达盒。 将此质粒与p M1 7 通过 L i p o - f e c t a m i n 的介导共转染2 9 3 细胞( 细胞密度为5 0 4 6 - 7 0 %) , 5 h 后用含5 %马血清的M E M琼脂( 琼脂 浓 度为0 . 5 %) 覆盖细胞， 室温凝固后放3 7 培养 1 0 -1 2 d ， 当 细胞出 现病变( c y t o p a t h ic e f fe c t ) 如 细胞 变圆、 出现病毒空斑时， 在显微镜下用平头毛
47、细管挑 出单个空斑， 放人含1 0 %甘油的P a s 中捣碎， t u r e . T h e r is e s o f C a t ， e x h i b it e d a s o s c il la t io n c h a r a c t e r i z e d b y i s o-t i m i n g a n d i m m e d i a t e t o l e r a n c e . T h e f u n c t io n a l E P A w a s l o s t i n p a s s a g e 1 3 . C O N - 口. U S I O N E P A c
48、a n b e a c t i v a t e d b y A c h , w h i c h m e d ia t e d t h e r i s e o f i n t r a c e l l u a r C a t i n b o v i n e a o r t a e n d o t h e l i a cel l p a s s a g i n g. K E Y WOR D S t un T h i s c h a rac t e r o f E P A is lo s t d u r i n g A c h ; C a 2 ; ; e n d o t h e l iu m; ce l l c u t 万方数据