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1、实用癌症杂志第 1 3 卷第 1 期 急性白血病体外药敏试验MT T法的初步探讨 江苏省镇江市第一人民医院( 镇江市2 1 2 0 0 2 ) 许文林陈道明张永宁吴朝阳 摘耍为了探讨肿瘤细胞体外药敏试验M T T法的实验条件， 观察体外药敏结果和体内 疗效的相关性. 作者采用微量液体 培养和徽量比 色法测定了2 3 例急性白 血病患者对常用的6 种抗癌药物的体外敏感性， 确定了6 种化疗药物的体外作用浓度。 结果 显示， 体外药敏试验的结果和体内 疗效总符合率为8 2 . 6 0 o ， 阳性符合率为8 8 . 9 0 0 ， 阴性符合率为7 1 . 4 %.提示MT T法是 一种简 便、 快
2、速、 客 观的 肿瘤细胞药敏试验方法， 对指导急性白 血病个 体化治疗有较高的实用价值。 关锐词急性白血病MT T法药敏试验化学治疗 A T e n t a t i v e E x p l o r a t i o n o f MT T A s s a y f o r L e u k e mi a C e l l s C h e mo s e n s i t i v i t y X u We n l i n , C h e n D a o m i n g , Z h a n g Y o n g l i n , e t a l ( T h e F i r s t H o s p i t a l o
3、 f Z h e n j i a n g , Z h e n j i a n g , 2 1 2 0 0 2 ) A b s t r a c t T o e s t a b l i s h MT T a s s a y f o r d e t e r m i n a t i o n o f c h e m o t h e r a p e u t i c s e n s i t i v i t y i n a c u t e l e u k e m i a a n d s t u d y t h e r e l a t i o n - s h i p b e t w e e n c h e m
4、o s e n s i t i v i t y i n v i t r o a n d e f f i c a c y i n v i v o , a u t h o r s d e t e c t e d t h e s e n s i t i v i t y i n d e x t o 6 k i n d s o f d r u g w i t h m i c r o - w e l l c u l t u r e a n d m i c r o - c o l o r i m e t r y i n 2 3 a c u t e l e u k e m i a p a t i e n t
5、s . T h e e f f e c t i v e c o n c e r t r a t i o n s i n v i t r o o f 6 k i n d s o f d r u g w e r e a l s o d e t e r - m i n e d . I t w a s s h o w n t h a t t h e g e n e r a l , p o s i t i v e ， a n d n e g a t i v e c o i n c i d e n t r a t e s b e t w e e n c h e m o s e n s i t i v i
6、t y i n v i t r o a n d e f f i c a c y i n v i v o w e r e 8 2 . 6 肠， 8 8 . 9 % a n d 7 1 . 4 写 r e s p e c t i v e l y . MT T a s s a y i s s i m p l e , r a p i d ， o b j e c t a n d s e n s i t i v e . T h i s m e t h o d i s v e r y h e l p f u l t o c h o o s e e f f e c t i v e d r u g f o r
7、l e u k e m i a c h e m o t h e r a p y . K e y w o r d s A c u t e . l e u k e m i a MT T a s s a y i n v i t r o c h e m o s e n s i t i v i t y C h e m o t h e r a p y 白血病细胞对化疗药物的敏感性是影响疗效的关 键因素之一， 应用体外药敏试验， 可指导合理使用化疗 药物. M T T法是根据活细胞内唬拍酸脱氢酶能使无 色的 3 - ( 4 , 5 一 二甲一 2 - 唾哇) - 2 , 5 一 二苯一 漠化四氮哇 ( MT
8、 T ) 还原成紫蓝色的甲 腾， 甲 腾的生成量和活细胞 数呈正比， 以酸性异丙醇溶解甲潜， 比色后可测出吸光 度( A ) 值这一原理设计的( M) 。我们采用MT T法测定 了2 3 例急性白血病患者对常用6 种抗癌药物的体外 敏感性， 现将结果报告如下。 1 材料与方法 L1 病例选择 初治急性白血病 2 3 例， 男 1 1 例、 女 1 2 例， 年龄 1 5 - 6 0 岁( 平均 3 2 . 4 岁) ， 其中急性淋巴细胞白血病 5 例( L 1 型 2 例、 L Z 型3 例) ， 急性非淋巴细胞白血病 1 8 例( M, 型 3 例， M, 型 1 2 例， M, 型 1 例
9、， M。 型 2 例) ， 上述病例至少接受一个疗程诱导缓解治疗， 治疗前后 均作骨髓细胞学检查。 1 . 2 白血病细胞悬液的制备 化疗前取患者骨髓或周围血( 幼稚细胞大于 6 0 0 o ) 3 - 5 m l ， 以终浓度为5 0 u / m l 的肝素抗凝， 缓慢 加入3 m l ， 比重为 1 . 0 7 7 士0 . 0 0 2 的淋巴细胞分离液 的无菌试管中， 以 1 5 0 0 r / 分、 离心 1 5 分钟。 吸取单个 核细胞层， 以每毫升含青霉素和链霉素各 1 0 0 U的 R P MI 1 6 4 0 液洗涤三次， 用含 1 0 %胎牛血清的 I Z P MI 1 6
10、4 。 液制成5 X 1 0 6 / m l 的单个核细胞悬液备用。 1 . 3 药物工作液的配制及其浓度反应曲线的测定 试验选用的药物为柔红霉素( D N R) 、 阿霉素 ( A D M) 、 高三尖杉醋碱( H H T ) 、 长春新碱( V C R) , 氨 甲喋吟( MT X ) 、 阿糖胞昔( A r a - c ) 。 以上药物均用生理 盐水稀释成工作液， 各分为四个不同对数级的浓度进 行试验， 分别计算在不同剂量下细胞生长抑制率。 并绘 出浓度反应曲线。 1 . 4 药敏试验方法 经灭菌处理的9 6 孔细胞培养板， 每孔加入细胞悬 液1 0 0 川， 细胞终浓度为5 X 1 0
11、 / m l ， 对照组加入等量 的生理盐水， 每组三孔。 每个实验孔加入不同的化疗药 物， 1 0 闪 / 孔， 对照组加入等量的生理盐水震荡混匀， 置 3 7 C, 5 %C O : 及饱和湿度的细胞培养箱中 4 8小 时。 加入1 2 . 0 7 m o l / L的MT T磷酸盐缓冲液， 1 0 川/ 孔， 继续培养4 小时。 培养结束后， 加入0 . 0 4 m o l / L盐 酸异丙醇, 1 0 0川 / 孔， 溶解甲膳， 终止反应。以对照组 调零点， 用酶联免疫检测仪测定各孔 5 7 0 n m波长的 吸光度( A) 值， 取每组 3 孔A值的平均数作为最后结 果。按下列公式计
12、算细胞生长抑制率( %) : 第1 3 卷第 1 期 1 9 9 8 年 3 月 用癌症杂 THE P RAC TI C AL J OURNAL OF C ANC E R Vo l . 1 3 . N0 . 1 Ma r c h 1 9 9 8 值-值 抑制率=( 1 一 试验组 A 对照组 A ) X 1 0 0 1 . 5 确定体外敏感值 细胞生长抑制率为 5 0 % ( 1 C 5 0 ) 为敏感值下限， 抑 制率)5 0 %为体外敏感， 5 0 %为体内敏感， 5 0 %为体内耐药 ” 。 1 . 7 药 敏试验结果与临床疗效符合率评定 在联合化疗方案中， 数种药物的细胞生长抑制率 的
13、平均数)5 0 %为体外敏感， 5 0 %为体外耐药。例 如， D N R和A r a - c 的细胞生长抑制率分别为 7 0 %和 4 5 0 0 ， 则“ D A” 方案的平均抑制率为( 7 0 +4 5 ) =2 X 1 0 0 %= 5 7 . 5 0 o ， 为体外敏感。 体外敏感、 体内不敏感者 为假阳性; 体外不敏感、 体内敏感为假阴性; 否则为体 内、 外符合。 2 结果 1 9 8 7 年V o n H o f f 报告肿瘤细胞集落法药敏试 验， 体外药敏结果与体内疗效的符合率为8 4 . 7 0, 0 . 阳 性符合率为 9 2 . 2 %， 阴性符合率为 6 9 . 1
14、/0 ,0/ ( 4 ) 。本文结 果与其相近。 需要指出的是， 国外文献报告“ 符合率” 多 指单药， 而我们指多药， 也就是方案中各种药物生长抑 制率的平均积分， 我们认为这样较为准确。 本研究表明， 白血病细胞体外药敏试验MT T法 存在着一小部分假阳性和假阴性。体外药物浓度飞暴 露时间与体内药代动力学之间. 体外培养条件与体内 细胞生长环境之间存在着不同程度的差异， 这些差异 可能是导致体外药敏试验结果和体内疗效不尽符合 的 原因。 目 前， 白血病细胞体外药敏试验的研究仍是一补 有待进一步深入研究的领域。MT T法是一种较可靠 的肿瘤细胞药敏试验方法 5 。我们的结果初步证明， MT
15、 T法可同时筛选多种化疗药物。 又具有骨髓取样 少、 操作简便、 快捷、 重复性好、 敏感等优点。这对选择 敏感的化疗药物， 组合高效的化疗方案， 进行个体化治 疗， 有重要意义。 2 . 1 药物浓度效应曲线的测定 测定8 例白血病患者骨髓细胞对 6 种化疗药物浓 度反应曲线， 细胞生长抑制率在第二或第三个浓度组 内处于I C , 。 的S 期内， 因此， 药敏试验的剂量选择在此 范围内， 能增加试验的敏感性和准确性。 我们选择的体 外药物浓度为: D N R , A D M和MT X均为0 . 3 p .g / m l , P .r a - c 为0 . 0 5 p .g / m l ,
16、H H T和V C R为0 . 1 kg/ml。 2 . 2重 复 性 试 验 取同一份标本， 连续使用D N R试验 5 次， 计算出 每次细胞生 长 抑制率， x =5 8 . 4 o o , C V =1 . 7 %. 2 . 3 体外药敏试验结果与体内疗效的关系 体外试验敏感者1 8 例， 临床显示疗效者1 6 例、 阳 性符合率为8 8 . 9 %; 体外试验耐药者 5 例， 临床有效 参考文献 7 例， 阴性符合率为 7 1 . 4 %， 二者总符 合率为6 6 %。 者82. 3 讨论 Ah d r e w G. L u s c o mb e M. C o r r e l a t
17、 i o n s b e t w e e n t h e r a p e u t i c r e s p o n s e o f l e u k e m i a a n d i n v i t r o d r u g s e n s i t i v i t y a s s a y . L a n c e t , 1 9 9 1 ; 3 3 7 : 7 7 1 . 徐建明， 宋三泰. 肿瘤化疗MT T药敏试验方法学研究的现 状. 国外医学 生物化学与检验学分册. 1 9 9 4 ; 6 : 2 4 9 - 夏源天， 马逢顺， 虞荣喜. 等. 使用短期细胞培养体外药敏试 验预测急性白血病对化疗的反
18、应. 中华内科杂志， 1 9 8 6 ; 4 7 : 5 8 7 5 . V o n H o f # D . I n v i t r o p r e d i c t i v e t e s t i n g : t h e s u l f o n a n i d e e r - a . J c e l l c l o n i n g , 1 9 8 7 ; 5 : 1 7 9 . B e l l a my WT. P r e d i c t i o n o f r e s p o n s e t o d r u g t h e r a p y o f a n - c e r : a r e v
19、i e w o f i n v i t r o a s s a y s . D r u g ， 1 9 9 2 ; 4 4 : 4 9 6 . S a r g e n t J ， E l g i e A, T a y l o r C G . T h e i d e n t i f i c a t i o n o f d r u g r e s i s t a n c e i n o v a r i a n c a n c e r a n d b r e a s t c a n c e r : a p p l i c a t i o n o f t h e MT T a s s a y . C
20、o n t r i b G y n e c o l O b s t e r ， 1 9 9 4 ; 1 9 : 6 4 . ( 收稿日 期 1 9 9 7 -0 2 -2 0 修回日 期 1 9 9 7 - - - 0 9 - - 2 2 ) . 产 、 创 . . 产 、 砂 、 曰 尸 、 沪 、 曰 尸 、 沪 、 刁 尸 沪 、 曰 尸 、 沪 、 目 尸 、 产 、 . 尸 、 尸 乌 . 产 、 沪 ， . 产 、 沪 ， 曰 尸 、 沪 、 曰 户 尹 、 “ 幽 尸 一门 、 护 、 产 、 “ 、 . 曰 产 、 产、户 、 沪 两 产 、 护 、 ，创 八. 八J、 尸 、
21、 J、 外科 杂志更名为 外科理论与实践 并公开发行启事 经国 家科学技术委员会国 科发信字【 1 9 9 7 6 0 9 号文件批准， 由 上海第二医 科大学、 上海第二医 科大学附 属瑞金医院主办的原内 部刊物 外科 杂志， 将于1 9 9 8 年第1 期起更名为 外科理论与实践 向国内外公开发行. 刊号为C N 3 1 -1 7 5 8 / R , 外科理论与实 践 杂志以普通外科学和肿瘤外科学的基础和临床研究为重点， 兼及外科各专科进展， 设有专家论坛、 论著、 新技术与技术改进、 综 述及讲座等栏目。 欢迎各位读者下半年开始向当地邮局订阅或直接向 外科理论与实践 杂志编辑部订阅， 并踊跃投稿。本刊为季 刊， 大1 6 开， 6 4 页， 每期定价人民币5 . 0 0 元， 全年2 0 元。编辑部地址: 上海市瑞金二路 1 9 7 号瑞金医院内， 邮政编码: 2 0 0 0 2 5 a