慢性肾衰竭大鼠主动脉UPP组分表达变化.pdf

《慢性肾衰竭大鼠主动脉UPP组分表达变化.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《慢性肾衰竭大鼠主动脉UPP组分表达变化.pdf（4页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、慢性肾衰竭大鼠主动脉U P P 组分表达变化 冯兵杨旭张耀全叶自林袁发焕杨惠标 321 基础研究 【摘要】目的探讨慢性肾衰竭大鼠主动脉泛素一蛋白酶体组分表达变化及意义。方法 采用单 肾切除、对侧肾动脉部分结扎法建立慢性肾衰竭模型，R T P C R 检测U b 、E 2m R N A 表达水平，免疫组 织化学检测U b 蛋白表达，免疫印迹法测定泛素化蛋白含量，并用图像分析定量。结果与正常大鼠 比较，慢性。肾衰竭人鼠术后4 个月和6 个月时主动脉U bm R N A ( 灰度值) 分别为( 1 4 3 6 0 1 4 2 ) 、( 1 4 8 0 0 1 2 4 ) ，E 2m R N A (

2、灰度值) 分别为( 2 2 5 3 0 6 8 9 ) 、( 2 0 0 2 0 3 8 3 ) ，均显著升高( 尸 0 0 1 ) 。与 正常大鼠比较，慢性肾衰竭大鼠主动脉U b 蛋白表达( 积分光密度) 在4 个月和6 个月时分别为( 8 2 0 1 1 5 ) 、( 9 4 8 2 8 0 ) ，也显著升高( 尸 0 0 1 ) 。而慢性。肾衰竭大鼠主动脉泛素化蛋白含量在术后4 个月 和6 个月时分别为( 积分光密度) ( 1 4 6 0 2 6 ) 、( 2 3 2 0 8 3 ) ，均显著低于正常大鼠( 尸 0 0 1 ) 。蛋白 酶体抑制剂M G 一1 3 2 可明显抑制慢性。肾衰

3、竭人鼠丰动脉U b 和E 2m R N A 和蛋白质表达，泛素化蛋白积聚增 多。结论慢性肾衰竭人鼠主动脉泛素一蛋白酶体信号通路显著活化。 【关键词】慢性。肾衰竭；主动脉：泛素( Ub ) ；泛素活化酶( E2 ) ；泛素化蛋白 中图分类号：R 6 9 2 5文献标识码：A E x p r e s s i o no fu b i q u i t i n - p r o t e a s o m ec o m p o n e n t si nt h ea o r t ao fr a t sw i t hc h r o n i cr e n a lf a i l u r eF E N GB i n g

4、 , Y A N GX u , Z H A N GY a o - q u a n , Y EZ i - l i n , Y U A NF a h u a n , Y A N GH u i - - b i a o D e p a r t m e n to f N e p h r o l o g y , X i n q i a o H o s p i t a l , T h i r dM i l i t a r yM e d i c a lU n i v e r s i t y , C h o n g q i n g4 0 0 0 3 7 , C h i n a A b s t r a c t O

5、 b j e c t i v eT oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o no fu b i q u i t i n - p r o t e a s o m ec o m p o n e n t si nt h ea o r t a o fr a t sw i t hc h r o n i cr e n a lf a i l u r e M e t h o d sT h ea n i m a lm o d e lw a se s t a b l i s h e db yp a r t i a ll i g a t i o no fr e n

6、a lp e d i c l e a r t e r ya to n es i d ea n dn e p h r o e c t o m ya tt h eo p p o s i t es i d e U ba n dE 2m R N A W a ss u r v e y e db yR T - P C R ，U bp r o t e i n w a sd e t e c t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ，a n dt h ea m o u n to fu b i q u i t i n a t e dp r o t e i n

7、w a ss u r v e y e db yw e s t e r nb l o t R e s u l t sI nt h ea o r t ao fr a t sw i t hc h r o n i cr e n a lf a i l u r e ，U bm R N Ai n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya tf o u r t hm o n t h ( 1 4 3 6 0 1 4 2 ) a n da ts i x t hm o n t h ( 1 4 8 0 0 1 2 4 ) a f t e ro p e r a t i o n (

8、P 0 叭，a sc o m p a r e dw i t ht h o s eo ft h ec o n t r o lg r o u p ) ， E 2m R N Aa l s oi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya tf o u r t hm o n t h ( 2 2 5 3 0 6 8 9 ) a n da ts i x t hm o n t h ( 2 0 0 2 0 3 8 3 ) a f t e r o p e r a t i o n ( P 0 0 1 ，a sc o m p a r e dw i t ht h o s eo

9、ft h ec o n t r o lg r o u p ) ，a n dU bp r o t e i ni n c r e a s e dt o8 2 0 1 1 5a tf o u r t h m o n t ha n d9 4 8 2 8 0a ts i x t hm o n t h ( P O 0 1 ，a sc o m p a r e dw i t ht h o s eo ft h ec o n t r o lg r o u p ) C o n v e r s e l y ，t h e a m o u n to fu b i q u i t i n a t e dp r o t e

10、i nd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yt O1 4 6 0 2 6a tf o u r t hm o n t ha n dt o2 3 2 _ + 0 8 3a ts i x t h m o n t h ( P 0 0 1 ，a sc o m p a r e dw i t ht h o s eo ft h ec o n t r o lg r o u p ) T h em R N Aa n dp r o t e i ne x p r e s s i o no fU ba n dE 2i n t h ea o r t aw e r es i g

11、n i f i c a n t l yi n h i b i t e db yt h et r e a t m e n to fa p r o t e a s o m ei n h i b i t o rM G 一1 3 2 ，a n da sar e s u l t ， u b i q u i t i n a t e dp r o t e i ni n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yi nt h ea o r t a C o n c l u s i o nT h eu b i q u i t i n p r o t e a s o m ep a

12、t h w a yi sa c t i v a t e di nt h ea o r t ao fr a t sw i t hc h r o n i cr e n a lf a i l u r e K e yW o r d s C h r o n i cr e n a lf a i l u r e ；A o r t a ；U b ；E 2 ；U b i q u i t i n a t e dp r o t e i n 尿毒症患者的动脉粥样硬化具有其特殊性，表 现为发病率极高、发病年龄早、累及范围广等特点， 目前推测可能与尿毒症时体内组织炎症活化有关。 泛素一蛋白酶体通路( u b i q u

13、i t i nP r O t e a s o m e p a t h w a y ，U P P ) 是目前已知的最重要的、有高度选择 性的蛋白质降解途径，细胞内约8 0 的细胞蛋白由 该通路降解，而且，研究发现，U P P 参与调节炎 症反应过程、信号转导等各种细胞生物学功能1 。 U P P 完成目标蛋白质降解需要经过三个关键步骤， 即目标蛋白的泛素化、不同组织特异性的E 3 连接酶 作用、26S 蛋白酶体的降解。初步研究证实，慢 性肾衰竭患者泛素一蛋白酶体通路存在显著激活， 基金项目：国家自然科学基金资助项目N o 3 0 5 7 0 7 6 3 作者单位：4 0 0 0 3 7重庆，第三

14、军医大学新桥医院肾内科 通信作者：冯兵4 0 0 0 3 7重庆，第三军医大学新桥医院肾内科 万方数据 322 生国血液洼化2 Q Q 璺生鱼且筮Z 鲞簋鱼期Q 蝤曼墅四也! 匹旦l Q 四d 互璺垒堂虫坠鳗1 2 ，2 鲤墨，! ：2 。丝Q ：鱼 并推测此通路的激活与尿毒症患者肌肉蛋白的降1 4 慢性肾衰竭大鼠主动脉U n 蛋白表达水平及分布 解、代谢性酸中毒、营养不良、炎症等慢性肾衰采用A B C 免疫组织化学染色试剂盒，根据免疫组 竭常见并发症密切相关 z 3 】。本课题组晚近研究发 织化学试剂盒( 购自北京中杉公司) 提供的操作说明 现，应用蛋白酶体抑制剂M G - 1 3 2 治疗

15、，可显著抑 进行。图像经L e i c aQ w i n 软件对于阳性区域的百分 制慢性肾衰竭大鼠主动脉N F KB 活性，间接说明 比进行分析计算。 慢性肾衰竭大鼠主动脉血管细胞中U P P 活化，因1 5 泛素化蛋白含量的测定 此，有必要阐明慢性肾衰竭时主动脉组织U P P 组分包采用上海申能博彩生物公司的组织蛋白抽提剂 括泛素( Un ) 泛素活化酶( E z ) 等表达变化规律，为进R I P A ( 使用前加入广谱蛋白酶抑制剂P M S F ) 抽提各组 一步探索以U P P 为靶点的防治尿毒症动脉粥样硬化的大鼠动脉的总蛋白质，提取的总蛋白质用考马斯亮 新措施提供依据。兰法测定蛋白浓

16、度。取1 5 g 总蛋白进行1 2 S D S 一 1 材料与方法P A G E 蛋白电泳( 8 0 v ，1 h 浓缩胶电泳；1 l O v ，2 h 分 1 1 慢性肾衰竭动物模型的建立离胶电泳) ；半干电转仪转膜( 90 m A ，1h ) ；洗 按本课题组报道的方法复制慢性肾衰竭大鼠模 膜后于封闭液中封闭3h ；洗膜后加入抗大鼠 型 5 l 。实验分组：按随机数字法将动物分为单纯慢U b i q u it in 抗体( 1 ：1 0 0 0 ) ( 购自A B C a m 公司) 或抗 性肾衰模型组( C R F ，1 0 只) ，慢性肾衰竭模型+ M G 一大鼠p a c t i n

17、 抗体( 1 ：5 0 0 ) ( 购自武汉博士德公司) 1 3 2 干预组( C R F + M ，1 0 只) ，假手术组( C O N ，1 04 过夜；第二天洗膜后加入H R P 标记的二抗( 1 ： 只) 。各组大鼠自由食水，治疗组术后开始给予腹1 0 0 0 ) ，室温反应3 h 后D A B 显色。成像分析系统 腔注射M G 1 3 2l O n g ( k g d ) ，持续4 6 个月。各 对结果成像、条带密度扫描，以p a C ti n 为内参 组大鼠取血后，分离主动脉组织，去除外膜后一部照，测定每个样品的泛素化蛋白的表达水平的相对 分液氮保存供测定m R N A 表达水平

18、变化和泛素化蛋白量变化。 含量测定，一部分于1 0 甲醛溶液固定，用于免疫1 6 统计学处理 组织化学染色。数据伍s ) 表示，采用S P S S l l O 统计软件单 1 2 肾功能测定因素方差分析，两两比较采用S N K 法。尸 0 0 5 采用酶法测定血清肌酐、尿素氮含量。差异具有统计学意义。 1 3主动脉U b 、E 2m R N A 表达的测定 2 结果 采用绵阳天泽基因工程有限公司的R N AO u t 试2 1 造模大鼠肾脏、主动脉的病理及肾功能变化 剂盒，用一步法提取细胞总R N A 。所有样品的D结果显示，与C O N 组比较，C R F 组大鼠肌酐显著 ( 2 6 0 )

19、 D ( 2 8 0 ) 值均介于1 9 - - 2 1 。采用T a k a R a 逆升高，随着时间延长，6 个月较4 个月时进一步明显 转录试剂盒把各组R N A 合成C D N A 。然后分别进行升高( P 0 0 1 ) 。C R F 组大鼠的尿素氮升高相对较 c D N A 的P C R 扩增，引物见表1 。P C R 反应体系先在慢较晚，仅6 个月时大鼠血尿素氮浓度显著高于C O N 9 4 预变性4 m i n ，然后进行P C R 反应，反应条件：组，C R F + M 组大鼠肌酐仍显著高于C O N 组( 表2 ) 。C R F 9 4 。C 变性5 0 s ，相应温度退火

20、5 0 s ，7 2 延伸l m i n ，大鼠肾脏病理显示，肾小球明显硬化特征( 系膜增 4 0 个循环。所用引物见表1 。取P C R 扩增产物5 p l ， 厚、小球细胞减少、小球体积缩小) ，间质纤维化、炎 在加了溴化乙锭的2 琼脂糖凝胶电泳板上电泳，凝性细胞浸润，及。肾小管细胞萎缩。这些结果表明，本 胶成像分析系统对结果成像、条带密度扫描，以实验动物模型是成功的。主动脉肉眼观察，内膜光 G A P D H 为内参照，测定每个样品的U b 和E 2 的m R N A滑，未见脂纹等；H E 染色可见内膜稍增厚。 表达水平的相对量变化。2 2 慢性肾衰竭大鼠主动脉泛素、泛素结合酶m R N

21、 A E 2 ( 4 7 6 b p ) 下游引物5 一G G G A T G G G T A G C 从G C T G 从G G 一3 上游引物5 一T A T G G G A C C T 从T G A C A G c C 一3 卜| 游，j | 物5 一G A A T G G A G G G A G G G 从A C A A 一3 上游引物5 一T G c T G A G T A T G T c G T G G A G T 一3 下游引物5 一A G T C T T C T G A G T G G C A G T G A T 一3 上游0 I 物5 一A C C A C A G T C C

22、 A T G C C A T C A C 一3 下游引物5 一T C C A C C A C C C T G T T G C T G T A 3 表达变化 本实验结果表明，与C O N 组比较，C R F 组大鼠 表2 慢性肾衰竭人鼠肾功能的变化及M G - 1 3 2 治疗的影响( n = 5 ) 注：”尸 0 0 l ，与C O N 组同时间点比较 万方数据 虫圈鱼渣逢丝星Q Q g 生鱼旦簋Z 鲞笠鱼期鱼鱼望Q 坚些! Q 旦! 鲤亟亘堑堕! i Q 虫坠堡1 2 ，2 四墨：! ：2 ：盥Q ：鱼 323 主动脉U b 、E 2 的m R N A 表达水平均显著升高，随着本实验结果表明

23、，M G - 1 3 2 治疗组泛素化蛋白的 时间延长，6 个月时较4 个月时进一步升高，但未累积水平明显升高，6 个月时较4 个月时泛素化蛋 达显著性差异。与C R F 组比较，M G - 1 3 2 治疗大鼠白累积进一步增多( P 0 0 1 ) 。C R F 组的泛素化蛋 主动脉U b 、E 2 的m R N A 表达水平显著降低，6 个月 白水平虽与C O N 组无显著性差异，但其泛素化蛋白 时比4 个月时表达量更低( 但未达显著性差异) 。M G 一水平有所降低，且6 个月时更为明显。由此可见， 13 2 治疗可显著抑制手术后大鼠主动脉U b 、E 2 的 M G - 1 3 2 治

24、疗可显著抑制泛素化蛋白的降解，即M G - m R N A 表达，即M G 一1 3 2 治疗组大鼠主动脉U b 、E 2 的 1 3 2 治疗组大鼠主动脉泛素化蛋白的累积水平明显高 m R N A 表达水平显著低于C R F 组，与C O N 组比较无显于手术组，与C O N 组比较无显著性差异表5 。 著性差异( 见表3 ) 。 表3 慢性肾衰竭大鼠u b 和E 2m R N A 表达变化( n = 5 ) 注：”尸 0 0 5 ，与C O N 组l 司时间点比较 2 尸 0 0 5 ，与C R F 组司时间点比较 2 3 慢性肾衰竭大鼠主动脉U b 蛋白表达变化 本实验结果表明，与C O

25、 N 组比较，C R F 组大鼠主 动脉U b 的阳性面积表达水平均显著升高( 尸 0 0 1 ) ， 随着时间延长，6 个月时较4 个月时的表达水平有一 定升高，但未达显著水平。与C R F 组相比，M G 一1 3 2 治 疗大鼠主动脉U b 的阳性面积水平显著降低。M G 一1 3 2 治疗可显著抑制手术后大鼠主动脉u b 的表达水平，即 M G 一1 3 2 治疗组大鼠主动脉U b 的阳性面积水平显著低 于C R F 组，与C O N 组比较无显著性差异( 表4 ) 。 2 4 慢性肾衰竭大鼠主动脉泛素化蛋白量的变化 表4 慢性肾衰竭大鼠主动脉泛素( U b ) 蛋白表达( n = 5

26、 ) 注：l P 0 0 5 ，与C O N 组刮时间点比较 2 尸 0 0 5 ，与C R F 组l 司时间点比较 表5 慢性。肾衰竭人鼠丰动脉泛素化蛋白表达( n = 5 ) 组别泛素化蛋白( 条带相对光密度) 术后4 个月术后6 个月 C O N1 5 2 O 2 93 0 7 O 4 8 C R F 1 4 6 O 2 62 3 2 O 8 3 C R F + M5 7 l 1 5 8 1 - 2 1 0 3 4 0 1 5 1 z 注：”P 0 0 1 与C O N 组同时日J 点比较 2 尸 0 0 1 ，与C R F 组同时间点比较 3 讨论 心血管并发症是尿毒症患者的主要死亡原

27、因。 与正常人群比较，尿毒症时主动脉粥样硬化病变发 病率显著升高达2 0 倍，发病年龄明显提前1 0 年左 右，而且病变累及范围更广，因此，阐明尿毒症 动脉粥样硬化的发病机制是肾脏临床医学中亟待解 决的问题。U P P 是一种高效和高度选择性蛋白降解 中国血液净化2 0 0 8 年第6 期围家级继续医学教育试题 ( 每题只选一个正确答案) 1 根据K D O Q I 指南建议，残余肾功能 2 m l m i n 1 7 3 m z ，接受每周3 次血液透析的患者，达到充分透析的最小剂量应为 A 单次透析时间少于5 h 者，U R R 6 5 ；s p K t V 1 2B 单次透析时间少于5

28、h 者，U R R 5 5 ；s p K t V 1 0 C 单次透析时间少于5 h 者，U R R 7 0 ；s p K t V 1 4n 单次透析时间少于5 h 者，U R R 5 5 ；s p K t V 1 2 2 根据K D O Q I 指南建议，残余。肾功能 2 m l m i n 1 7 3 m 2 ，接受每周3 次血液透析的患者，达到充分透析的月标剂量应为 A 单次透析时间少于5 h 者，U R R 6 5 ：s p K t V 1 2 B 单次透析时间少于5 h 者，U R R 5 5 ：s p K t V 1 0 C 单次透析时问少于5 h 者，U R R 7 0 ；s p

29、 K t V 1 4 D 单次透析时间少于5 h 者，U R R 5 5 ；s p K t V 1 2 3 根据2 0 0 6 年K D O Q I 指南建议，无残余肾功能( 尿量l O O m l d ) 的持续不卧床腹膜透析( c A P D ) 患者小分子溶质清除应 达到的最小剂量为 A 总K t V u r e a 1 2 wB 总K t V u r e a 1 5 wC 总K t V u r e a 1 7 w D 总K t V u r e a 2 O w 4为使腹透忠者达到理想的容量及血压控制，可以采取以下措施 A 在有残余肾功能的患者，町以应用利尿剂是患者达到T 体重 B 在适当

30、情况下，对患者进行饮食中的水、盐限制 C 尽量采用町能的最小浓度的腹透液以获得足够的超滤量D 以上全是 5 透析患者饮食中钠的摄入量应控制在 A 每日食盐摄入量 6 9B 每日食盐摄入量 5 9C 每日钠摄入量 3 9D 每日食盐摄入量 3 9 万方数据 。324 主国血液渔化2 Q Q 垦生鱼目筮Z 鲞筮期鱼鱼鳇业巫! 匹旦! 鲤鱼丛西鱼璺鲥鲤，坚韭1 2 ，2 四曼! ：2 ，世Q ：鱼 途径，蛋白质泛素化修饰已被公认为是真核生物细白表达均降低，这可能是由于泛素化蛋白积聚，反 胞内仪次于磷酸化的最重要的信号调节机制，与细馈抑制的结果。 胞周期调节、基因转录及表达、抗原呈递、炎症本实验发现，

31、术后6 个月时慢性肾衰竭大鼠较 等各种细胞生理、病理过程密切相关。鉴于动脉 术后4 个月时主动脉的泛素化蛋白积聚水平又有所 粥样硬化的病理实质是主动脉慢性炎症增殖反应，增加，但未达到显著水平，可能提示随着慢性肾功能 泛素系统可从多个环节参与调节免疫炎症细胞N F K B不全病程进展，主动脉血管细胞内功能紊乱加剧，需 的激活和再循环，更为重要的是目前发现泛素连接要降解的病态蛋白增多而所致，也迸一步提示，慢性 酶( E 3 s ) 具有数百种类型，具有组织特异性，因此阐。肾衰竭时主动脉病变的持续进展。 明慢性肾衰竭大鼠主动脉U P P 活化情况及变化规律， 将为T 预血管细胞特异性泛素系统激活，进

32、而抑制 参考文献 尿毒症动脉粥样硬化提供关键路径。 有关u P P 组分表达上调的分子机制尚未阐明， ：毓三， ：i 。：。：嚣；恶，5 戮：“嚣；。尝善鹏， 可能与胰岛素缺乏、糖皮质激素刺激有关【6 - 7 | 。本 2 M a r i n o v i cA C ，Z h e n gB ，M i t c hW E ，e ta 1 U b i q u i t i n ( U b C ) 研究发现，慢性肾衰竭大鼠U P P 系统组分u b 和E 2 ：蒜1 。o n 。i 。n h = ：e i 。c 。e 0 I v l l s i 。i g ss i p n l c r 卸e a d s e

33、 肛dK I b yJ 9 1 “c J B o c o i o l r t l ： m R N A 表达均显著增加，慢性。肾衰竭组大鼠主动脉U b 2 0 0 2 2 7 7 ：1 6 6 7 3 1 6 6 8 1 蛋白表达也显著升高，提示慢性肾衰竭大鼠主动脉 3 邱鸿，余毅慢性l 肾衰竭与泛素一蛋白酶体通路 J 医学综述，2 0 0 7 ， 组织中U P P 通路是高度活化的。W e s t e r nB l o t 测定 4 蔷Z 谎叶自林，等慢性肾衰竭大鼠主动脉N F 一。B 表达变化 证实，慢性。肾衰竭大鼠主动脉的泛素化蛋白积聚水 J 第二军医人学学报，2 0 0 8 ，印刷r t

34、 平低，提示慢性肾衰竭大鼠蛋白酶体活性也明显升 吲焉 马熏麓爹2 长0 0 7 等1 3 9 2 3 ：篙肾衰大鼠治疗作用的初步研 高。泛素系统可从多个环节参与调节免疫炎症细胞 6 申传安，柴家科，姚咏明，等地塞米松对离体培养肌管泛素系统基 N F - ) ( B 的激活和再循环 8 J ，是N F - x B 激活的关键上 因表达的调节及意义 J 解放军医学杂志，2 0 0 5 ，3 0 ：8 7 5 8 7 6 游调控机制，本课题组研究发现，应用蛋向酶体抑 口1 M 1 a 。r 。i ；n 。o 。”萎篙；：翟B ( , 。M b c i t ) c h 。，W a n E , 。e 。

35、t r i p a l 。T n b i s s ，u e 9 1 u - s p 。e 。c 。ir t i f i c 。：薹 制剂M G - 1 3 2 治疗，也可显著抑制慢性肾衰竭大鼠主 i nv i v oa n di nv i t r oa n a l y s e s J A mJP h y s i o lR e n a lP h y s i o l ， 动脉N F _ KB 活性，目前已经公认，动脉粥样硬化 8 ；0 i o g a l 7 , 2 翟：篙譬兰i 。f o r 。h 。l ；。；。；。：肝。B 一 实质上是一种血管细胞的慢性炎症反应，因此，可 f u n c t

36、i o n , a c t i ，。t io n ，c o n t r o l , 锄d 。q 。 J JC l i 。 以认为，在慢性肾衰竭大鼠主动脉组织中U P P 被显 R h e u m a t o l ，2 0 0 6 ，1 2 ：2 0 7 - 1 1 著激活，在尿毒症动脉粥样硬化形成过程中发挥了 ( 收稿日期：2 0 0 8 0 1 0 3 ) 重要作用。M G 一1 3 2 治疗后，U b 和E 2m R N A 和U b 蛋 ( 本文编辑：赵青艺) 中困血液净化2 0 0 8 年第6 期国家级继续医学教育试题答题卡 姓名职称试题1 A0BoC0O0E0 工作单位试题2 A0B0C0O0E0 通迅地址试题3A0BoC0DoE0 科别试题4 A0BOC0OoE0 邮编试题5 A0B0C0DoE0 联系电话( 区号) 注：请将正确答案用2 B 铅笔涂黑 此答题卡请寄至中国血液净化编辑部( 1 0 0 0 3 4 ) 收联系电话：0 1 0 6 6 5 8 3 6 5 5 0 1 0 6 6 1 8 1 9 0 0 万方数据