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1、第 21 卷第 2 期大连水产学院学报Vol. 21 No. 2 2 0 0 6 年 6 月JOURNAL OF DALIAN FISHERIES UNIVERSITYJun . 2 0 0 6 文章编号： 1000 -9957 （2006） 02 -0131 -03 海马病原菌的分离鉴定及其对抗生素敏感性的研究 杨 弘 诣1， 杨 为 东2， 赵 文3， 腾 力 平2， 张 国 辉1， 程 刚4， （1. 辽宁检验检疫局， 辽宁 大连 116601； 2. 大连虎滩海洋公园， 辽宁 大连 116001； 3. 大连水产学院 辽宁省省级高校水生生物学重点实验室， 辽宁 大连 116023； 4
2、. 大窑湾检验检疫局， 辽宁 大连 116001） 摘要：从患病海马 Hippocampus kelloggi 体内分离到 3 株菌株，用分离菌株的纯培养物感染健康海马， 48 h 内海马全部发病，其临床症状与原患病海马相似，经形态学、生化和室内感染试验，鉴定该菌株 为副溶血弧菌 Vibrio parahemolyticus。药敏试验结果表明，所分离菌株对链霉素、利福平、卡那霉素、 环丙沙星、氟派酸、四环素、复达欣、菌必治、奈定酸等抗菌药表现为高敏感性；对红霉素、新霉 素、先锋霉素、强力霉素、新生霉素、头孢呋肟、呋喃妥因等药物敏感性较高；对氨苄青霉素、羟 苄青霉素、头孢氨苄、林可霉素等药物敏感
3、性较差。 关键词：副溶血弧菌；分离鉴定；药敏试验；海马 中图分类号：S965. 8 文献标识码：A 海马 Hippocampus kelloggi 属温带海洋鱼类，约有 354 种，具有经济价值的有 30 多种。海马是传 统的名贵中医处方药材，现代医学证明，海马的乙醇/ 水提取物具明显的抗衰老、抗血栓作用。 近年来，在国际市场上海马供不应求，导致国内外海马的人工养殖迅猛发展。但由于海马的活动 能力差，抗逆性弱，因而养殖中病害较多，海马病害在很大程度上制约了海马养殖业及相关产业的发 展。关于海马病原体的研究很少，国内外仅有零星报道 1 -5。海马消化道疾病是目前中国最严重的海 马病害之一 1 -
4、3。本试验中，作者从患病的海马中分离出病原体，并进行药敏试验，筛选出高效抗生 素，旨在为食用、药用和观赏性海马养殖的病害防治提供依据。 1 材料与方法 1. 1 材料 试验用海马取自大连虎滩海洋公园珊瑚馆的水族箱中。养殖用水为过滤海水，在 400 L 水族箱中 暂养 10 d，水温 18 22，正常光照，常规饲养管理。细菌生化反应鉴定管和药敏试纸取自浙江军 区卫生检疫检验所。 1. 2 方法 1. 2. 1 病原菌的分离鉴定 用灭菌网具将患病海马轻轻捞起，用灭菌过滤海水冲洗样本，然后解剖 海马，摘取消化道，用生理盐水（按 1: 1 比例）研磨，在普通营养琼脂平板上划线。在 28下培养 18 2
5、4 h， 挑选形态一致的优势菌落进行纯培养， 获得 3 株菌株， 编号为 40C、 40G、 40F， 斜面接种保存。 将分离菌株在营养琼脂平板和 TCBS 平板上划线，28下培养 24 h 后观察。取新鲜固体培养物， 用革兰氏染色，显微镜下观察。根据文献6生化试验的方法对菌株进行鉴定。 1. 2. 2 人工感染试验 将试验菌株接种于营养琼脂斜面，在 28下恒温培养 18 24 h，无菌条件下 用灭菌生理盐水制成分离菌株纯培养菌悬液，实测浓度为 9 106CUF/ mL（平板计数法） 。从水族箱 收稿日期： 2005-01-03 基金项目：国家质检总局资助项目（LK31 -2002） 作者简介
6、：杨弘诣（1964 - ） ，男，兽医师。E - mail：shanxidalian yahoo. com. cn 中选取12 尾体重为16 20 g 的健康海马，分为3 组，其中一组腹腔注射0. 1 mL 上述菌悬液，另一组 注射 0. 1 mL 生理盐水，第 3 组不做任何处理。将 3 组海马分别养殖于相同条件的水族箱中，并进行 观察。 1. 2. 3 药敏试验 将 28下恒温培养 18 24 h 的菌落，用生理盐水制成菌悬液，均匀涂抹在 M - H 琼脂平板上，贴上药敏试纸，置于恒温箱内 24 h 后进行观察。抑菌圈直径小于 10 mm 为不敏感，10 20 mm 为敏感，大于 20 m
7、m 为高敏感。 2 结果 2. 1 人工感染试验 人工注射菌悬液的试验组，48 h 内海马全部发病，其中1 尾濒于死亡，其发病症状同自然状态下 患病海马的病症相似。患病海马身体弯曲，活力减弱，腹腔积水，腹部膨大，腹腔和消化道充血红 肿。另外两组海马未出现任何不适和可疑症状。 2. 2 病原菌的鉴定 从患病海马体中分离到的 40F、40C、40G 株菌，经革兰氏染色皆表现为阴性，镜下观察为杆状， 单极生鞭毛，无荚膜、芽孢。在 TCBS 培养基上呈绿色，28下恒温培养 24 h 后，表面光滑、湿润， 边缘整齐，菌落直径为 4 5 mm。根据其生理生化试验结果（表 1） ，鉴定此 3 株菌均为副溶血
8、弧菌 Vibrio parahemolyticus 6。 表 1 分离菌和副溶血弧菌的生化反应结果 Tab. 1 The characteristics of the isolated strains and Vibrio parahemolyticus 项目 item4OF40C40GVibrio parahemolyticus项目 item40F40C40GVibrio parahemolyticus G-明胶酶+ O/ FFFFFONPG 水解- 单极生鞭毛+硝酸盐还原+ 运动+西蒙氏枸橼酸盐-D 杆菌+酒石酸盐- 色素产生-七叶苷水解- 氧化酶+4生长- 葡萄糖产气-10生长+ 触酶+
9、35生长+ M - R-D42生长+ V - P-无盐胨水- 吲哚-+30 g/ L 氯化钠胨水+ 精氨酸双水解酶-60 g/ L 氯化钠胨水+ 赖氨酸脱羧酶+80 g/ L 氯化钠胨水+ 精氨酸脱羧酶-100 g/ L 氯化钠胨水- 鸟氨酸脱羧酶+0/129（10）SSSR 脂酶+0/129（150）SSSS 淀粉酶+甘露糖+ 脲酶-半乳糖+ 肌醇-蕈糖+ 甘露醇+绵子糖-N 水杨酸-卫矛醇-N 阿拉伯糖+D蔗糖- 乳糖-D山梨醇- 纤维二糖+葡萄糖+ 麦芽糖+N果糖+N 木糖-N鼠李糖+N 注： + 表示阳性， - 表示阴性，F 表示发酵，S 表示对药敏感，R 表示耐药，D 表示不确定，N
10、 表示无记录。Notes：+ means posi- tive， - means negative，F means fementative，S means sensitive，R means resistance，D means variable，N：no noted. 2. 3 药敏试验 药敏试验结果表明，所分离菌株对链霉素、利福平、卡那霉素、环丙沙星、氟派酸、四环素、复 达欣、菌必治、奈定酸等抗菌药表现为高敏感性；对红霉素、新霉素、先锋霉素、强力霉素、新生 霉素、头孢呋肟、呋喃妥因等药物敏感性较高；对氨苄青霉素、羟苄青霉素、头孢氨苄、林可霉素等 药物敏感性较差。 231大连水产学院学报 第
11、 21 卷 3 讨论 从患病海马消化道分离的 3 株菌株，其纯培养物在 48 h 内使健康海马致病，并有部分死亡，其 症状和自然养殖患病海马的症状相似。再从被感染的患病海马体中分离出致病菌株，其形态特征和生 理生化及糖发酵反应结果与原菌株一致，证实副溶血弧菌为海马的致病菌。海马消化道疾病是一种严 重的海马疾病，传染性强，死亡率高，主要感染 20 日龄的幼海马。患病海马行动迟缓，体色发黑， 腹部膨大，消化道水肿出血并伴有脓状物。弧菌是条件性致病菌，广泛存在于各种水体中，其致病性 取决于水生动物的生理状态、细菌数量和理化等环境因子 7。通常 5 10 月为该病的多发季节，6 9 月尤甚，因为该季节
12、水温较高，水质易恶化，因而致病菌大量繁殖 1。若养殖海马机体抵抗力因某 种原因而下降时，则有可能引发该病。因此，高温季节应加强管理，保持良好的水质尤为重要。 据 Wooten 等 5的报道，当水质恶化时，一种弧菌可引起海马腐烂病（Flesh - Erosion Disease） ， 表现为海马活动迟缓，呼吸急促，眼发黑，腹部膨大，组织腐烂脱落，严重时可烂到骨骼，直至死 亡。这种病死亡率极高，用呋喃 II（Furan）和 Paragon II 混合制剂治疗特别有效，四环素族次之，而 强力霉素和土霉素则差强人意，用新生霉素局部涂搽也有一定疗效。本试验结果与 Wooten 等 5的报 道相似。另外，
13、弧菌还可引起海马患口鼻肿大腐烂病（Snout Rot） ，患病海马口鼻部褪色发白、肿 大，严重时会因不能进食而致死。用 Paragon II 治疗最为有效，新生霉素局部涂搽也有一定疗效。弧 菌对海马的致病作用很明显，但不同情况下其表现形式不同。 养殖海马的用途不尽相同。对于药用和食用海马疾病的防治，用药量和药的品种必须遵守有关药 用和食用水产品的法规，而观赏性海马的用药可不受限制，因此，筛选出适合于不同用途海马的高效 药物以及制定严格的停药期制度，对于海马的养殖具有重要的指导意义。 参考文献： 1 上海水产学院 . 鱼类学与海水鱼类养殖 M . 北京： 农业出版社， 1982： 490 -49
14、1. 2 魏祥东， 陈东红， 叶长明. 海马的人工养殖现状及前景 J . 中山大学学报论丛， 2002， 22 （3） ： 236 -239. 3 张晓锋. 海马养殖中几种常见病害的防治 J . 齐鲁渔业， 2003， 20 （1） ： 36 -37. 4 BEATTY K T， MCGAREY D J， GRIER H J， et al. Vibrio harveyi an opportunistic pathogen of the common snook， Centropomus unidecimalis （Bloch） ，held in captivity J . Journal of
15、 Fish Diseases， 1990， 13： 557 -560. 5 WOOTEN W， WAUGHMAN S. Gas Bubble Disease：What the heck is it ？ EB/ OL . 2004 -12 -26 . www. seahorse. org. 6 中国科学院微生物所细菌分类组. 一般细菌常用鉴定方法 M . 北京： 科学出版社， 1978. 7 FYFE L，FINLEY A，COLEMAN G，et al. A study of the pathological effects of isolated Aeromonas salmonicida
16、extracellular protease on Atlantic salmon，Salmo salar. Journal of Fish Diseases， 1991， 14： 171 -183. 8 海马的救援 EB/ OL . 2004 -12 -21 . http： / / e - info. org. tw. The experimental study of isolate and checkup of pathogenic bacteria and its drug sensitive to antibiotics in seahorse （Hippocampus kellog
17、gi） YANG Hong-yi1， YANG Wei-dong2， ZHAO Wen3， TENG Li-ping2， ZHANG Guo-hui1， CHENG Gang4 （1. Test and Quarantine Bureau in Liaoning Province，Dalian 116601，China； 2. Dalian Tiger Beach Amusement Park，Dalian 116001，China； 3. Key Laboratory of Hydrobiology in Liaoning Province s University，Dalian Fishe
18、ries University，Dalian 116023， China； 4. Test and Quarantine Bureau in Dayaowan， Dalian 1116001，China） Abstract：Three strains of bacteria were isolated from the diseased seahorse（Hippocampus kelloggi） ，which were cultured in tanks. The biochemical characteristics of these bacteria isolated are the s
19、ame as those of Vib- rio parahemolyticus and these bacteria isolated were identified as Vibrio parahemolyticus. Healthy seahorse which were injected with the bacterial isolation solution were infected after 48 hours. These seahorses showed the similar characters as the diseased seahorses did. The ba
20、cterial isolates were highly sensitives to streptomy- cin，rifampin，kanamycin，ciprofloxacin，norfloxacin，tetracycline，oxacinceftazidime，ceftriaxone，nalidixic acid and etc. Key words：Vibrio parahemolyticus； isolate and checkup of pathogen； drug sensitive to antibiotics；seahorse 331第 2 期 杨弘诣， 等：海马病原菌的分离鉴定及其对抗生素敏感性的研究