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1、第3 1 卷第9 期第三军医大学学报V 0 1 3 l ，N o 9 2 【X ) 9 年5 月 A C T AA C A D E M I A EM E D I C I N A EM I L n A R I ST E R T I A E M a y2 0 0 9 8 1 3 文章编号：1 0 0 0 - 5 4 0 4 ( 2 0 0 9 ) 0 9 - 0 8 1 3 一0 5 小鼠慢性脑血流低灌注状态的行为学检测及病理学观察 段炜，郑健，桂莉，田洪( 第三军医大学新桥医院神经内科，重庆4 0 0 0 3 7 ) 0 论著 摘要：目的观察小鼠慢性脑血流低灌注状态下行为学及其病理学变化。方法6
2、 2 只c 5 7 B L 6 小鼠均分为模型 组和假手术组。模型组：采用内径为0 1 8 咖的微型弹簧圈套C 5 7 B L 6 小鼠双侧颈总动脉，造成血管狭窄导致全脑血流 低灌注状态；假手术组：仅暴露双侧颈总动脉，不圈套微型弹簧。在成模3 0d 时两组各取8 只小鼠，采用八臂迷宫实验检 测小鼠认知功能的改变，并在成模7 、1 4d 和3 0d 时分别处死动物，采用u v e r B a n e m 染色观察神经纤维改变及免疫组化 观察胶质细胞增生程度，同时用E v 卸sB l u e 荧光观察血脑屏障通透性的变化。结果建模3 0d 后模型组八臂迷宫实验工 作记忆错误显著多于假手术组( P
3、O 。0 5 ) 。 2 2 八臂迷宫实验 在术前和术后3 0d 时分别进行八臂迷宫实验，实验共持续 l Od 。每天训练1 次。2 组术前工作记忆错误无显著变化，但 是在术后3 0d ，模型组的工作记忆错误较假手术组显著增多 ( P O 0 5 ) ，见表l 。 表I 模型组与假手术组的工作记忆错误( n = 8 ，i s ) a ：P O 0 5 ，与假手术组比较 万方数据 第9 期段炜，等小鼠慢性脑血流低灌注状态的行为学检测及病理学观察 8 1 5 A 、D 、G ：假手术组；B 、E 、H ：模型组1 4d ；C 、F 、I ：模型组3 0d ；A 、B 、C ：胼胝体；D 、E 、F
4、 ：内囊；G 、H 、I ：视束 图1模型组与假手术组脑白质区域神经纤维n w 肾- B a m m 染色观察 2 3 脑白质神经纤维髓鞘损伤程度 与假手术组比较，模型组7d 时白质区域未见明显病理改 变。模型组1 4d 时观察到白质区域神经纤维排列紊乱，3 0d 时 白质区域神经纤维稀疏，残留神经纤维排列杂乱。均以胼胝体 ( 侧脑室中间部) 最为严重，其次是内囊，最轻为视束( 图1 ) 。 胼胝体、内囊、视束神经纤维损害程度的分级见表2 。3 0d 时胼 胝体损害程度接近2 级，与假手术组比较差异有统计学意义 ( P O 0 5 ) ；视束损害最轻，仅接近O 5 级。 裹2 模型组与假手术组
5、脑白质不同部位损伤程度( n = 6 ，i 5 ) 8 ：P 0 0 5 ，与假手术组比较 2 4 脑白质区域胶质细胞增生程度 与假手术组比较，7d 时模型组白质区域未见明显胶质细 胞增生现象。在术后1 4 、3 0d 时模型组白质区域内均可见星型 胶质细胞、小胶质细胞数量显著增多，以胼胝体( 侧脑室中间 部) 最为显著。但是小胶质细胞形态无显著变化( 图2 ) 。胼胝 体、内囊和视束3 个区域0 1 2 5 咖2 内的星型胶质细胞和小胶 质细胞的计数见图3 ，模型组1 4 、3 0d 时胼胝体、内囊部位星型 胶质细胞和小胶质细胞数目与假手术组比较均具有统计学差 异( P 0 0 1 ) 。
6、2 5 血脑屏障通透性评价 假手术组胼胝体部位的小血管未见E v 绷sB l u e 向血管壁 外渗出，血管呈细线状。模型组可见明显E v 蛐B l u e 向血管壁 外渗出现象。见图4 。 万方数据 8 1 6 第三军医大学学报 第3 l 卷 A 、B 、C ：G F A P 染色；D 、E 、F ：C D l l b 染色；A 、D ：假手术组；B 、E ：模型组1 4d ；C 、F ：模型组3 0d 图2 模型组与假手术组胼胝体的G F A P 和C D l l b 免疫组化观察( S - P ) a ：P 0 0 l ，b ：P O 0 5 ，与假手术组比较 图3 各组脑白质不同部位星
7、型胶质细胞( A ) 和小胶质细胞( B ) 计数 A ：假手术组；B ：模型组T ：微血管外渗部位 圈4 小鼠胼胝体部位血脑屏障通透性( 荧光显微镜) 3 讨论 由于脑室周围白质和半卵圆区为皮层长髓支和白 质深穿支供血交界区，均为终末动脉，很少或完全没有 侧支循环，并经过较长的距离才终止于脑室壁附近，而 且血管调节能力差，容易在多种病因的作用下发生缺 血缺氧性损伤。临床研究发现慢性脑血流低灌注 的主要病理改变为皮质下白质脱髓鞘样改变，临床主 要表现为认知功能损害，大多数是主观记忆力下降，即 缺血性白质脑病，是血管性认知损害的主要类型之 一 7 8 】。目前慢性脑血流低灌注导致的脑损伤的病理
8、机制尚不十分清楚，因此对其病理改变的深入研究具 有重要意义。本研究采用c 5 7 B 蜥小鼠成功建立慢 性全脑血流低灌注模型，观察其行为学及病理学变化， 为缺血性白质脑病防治的深入研究奠定基础。 缺血性白质脑病动物模型的建立是对其深入研究 的基础。目前常用大鼠或沙土鼠双侧颈总动脉夹闭或 万方数据 第9 期 段炜，等小鼠慢性脑血流低灌注状态的行为学检测及病理学观察 8 1 7 缩窄模型，但建模过程中动物存活率较低，文献 9 报 道为6 0 。本实验模型小鼠术后3 0d 存活率为 8 8 ，死亡时间段主要位于8 1 4d 。C 5 7 B L 6 小鼠属 于近交系小鼠，个体差异小，实验结果稳定性好
9、，是目 前基因修饰研究最常用的动物。因此，本研究选择 C 5 7 B L 6 小鼠作为研究对象。 本研究采用特制的微型弹簧( 内径O 1 8 咖，全长 2 5m m ) 圈套C 5 7 B L 6 小鼠双侧颈总动脉造成血管狭 窄，导致全脑血流低灌注。建模后模型小鼠运动功能 无明显改变，未见肢体瘫痪及转圈现象。既往研究发 现大鼠慢性脑血流低灌注3 7d 后出现白质疏松现 象【6 1 引。本研究表明，在建立模型1 4d 病理学检查发 现白质神经纤维稀疏及星形胶质细胞和小胶质细胞增 生现象，在建模7d 时未见明显的白质损害及胶质细 胞增生。同时我们在建模3 0d 后采用八臂迷宫实验 检测模型小鼠工作
10、记忆的受损程度。工作记忆反映前 额叶脑区执行功能，其主要依赖于大脑前额叶皮层神 经环路J 。大量临床研究认为脑室周围白质损害可 导致认知功能减退，尤其是主观记忆力损害，执行功能 障碍及精神运动速度减慢。而且认知功能损害与脑白 质疏松的严重程度有关 1 2 13 I 。通过病理学研究，我们 观察到慢性低灌注模型动物主要是皮质下白质损伤， 然而白质纤维是连接皮层与皮层、皮层与皮层下深部 核团的重要纽带，其纤维受损必然造成功能障碍。本 实验结果表明，模型动物工作记忆错误显著多于假手 术动物，表明其记忆中间储备环节受损和空间学习记 忆能力降低，反映主观认知功能损害。 与既往研究不同的另一发现是，本研究
11、通过组织 病理学及E v 粕sB l u e 渗透特性观察模型小鼠的病理学 改变发现，模型建立1 4d 后出现白质神经纤维稀疏、 胶质细胞增生，并且通过E v a n sB l u e 发现血脑屏障破 坏。对皮质下白质脑区主要观察胼胝体、内囊和视束 3 个区域，结果显示胼胝体病理损伤最为严重，其次是 内囊，病变最轻为视束，仅在胼胝体部位观察到E v a n s B l u e 外渗现象。然而既往大鼠动物模型实验均发现 慢性低灌注状态导致的病理损害最明显的区域是视 束，其次是胼胝体、内囊 10 1 4 J 。分析其可能原因是由 于本模型小鼠的双侧颈总动脉并未完全闭塞，故由颈 内动脉直接供血的眼动
12、脉缺血程度较轻，因此视觉系 统的损害降至最低。 本研究结果表明，小鼠慢性脑血流低灌注状态的 主要病理改变是皮质下自质损伤，胶质细胞增生和血 脑屏障功能受损，在建模1 4d 后出现。病理损害最严 重部位是胼胝体，其次是内囊，视束最轻；神经功能缺 损主要表现认知功能损害，而运动功能无障碍。 参考文献： 1 M u n DG h k o a r a i i 6 叩di h e I I I i a ：b e y o n dt h em y t l I J S t m k e ，2 0 0 6 ，3 7 ( 6 ) ：1 3 4 8 1 3 4 9 2 K u l l e rLH ，L o n 昏吨r
13、e t l lw TJ r ，A m o l dAM ，dd w l l i t e 咐n e rh y p 耐m e n s j t y c 瑚i a l 咖印e 6 cr e s o n 卸c ei m a g i I l g ：ap r e d i c t o r0 f 8 t r D k e J s t r o k e ，2 0 0 4 ，3 5 ( 8 ) ：1 8 2 l 1 8 2 5 3 F 诎砸E h i t 衄PG ，B a r iF P e n r 啪e m ，b i l a l e r a lc o 咖佣c 啪t i d a n e r yo c c l u s i o
14、 ni nt I e 豫t ：am o d e lf b rc h r o I l i cc e 糟b r a lh y p o p 幽8 i 彻 删r 删l D d e g e l I e 枷v ed i 嗍 J 蹦nR e s 胁，舢，5 4 ( 1 ) ：1 6 2 1 8 0 4 K u 川m 拙iT ，K u d oT ，I k u r aY ，以缸w h i l em a n e rc l l a n g 髓i nt l l e 鼬i lb r a i nu n d e rc l l r o I l i cc e m b r a lh y p o p e 血s i 蚰 J s t
15、r o k e ，1 9 9 8 ， 2 9 ( 5 ) ：1 0 5 8 一1 0 6 2 5 F a r k 鹳E ，D o n hG ，d e - V RA ，口耐E x p e r i m 朗脚c e 比b r a lh y 一 础卿硝叩j n d u c e sw k l e 瑚n e ri n j u I y 锄dm i c l 端“8 la c l i v 砒i 佃i nt b e r a tb r a i n J A c t aN e u 删o l ，2 0 0 4 ，1 0 8 ( 1 ) ：5 7 6 4 6 w a k i t aH ，T o I I l i t 0H ，
16、A k i g I I c l l iI ，e l 以G l i a la c t i 、r a t i dw K t e m a t t e rc h a n 学i l lt I I em tb m i ni n d u c e db yc l l | 喇co e 他b 憎lh 弭叫p e r f l l B i 蚰：蛐i 咖n o h i s t o c h e m i c a l 咖d y J A c t aN 唧砒h o l ，1 9 9 4 ，8 7 ( 5 ) ：4 8 4 4 9 2 7 R 锄a ncc ，E r k i n j u n t t iT ，w 矗l l j nA
17、，d 础S l l b c m t i c a li s c h 趾m i c v a 目l I a rd e m t i a J 1 J a n c e tN e u m l ，2 0 0 2 ，l ( 7 ) ：4 2 6 4 3 6 8 O s I l l l i 咖M ，M o 而sRG ，H u c pB ，d 越D 豳l s i t s o rM l u c o r r e l a l 髑w i t e x e c I l 6 v ed y 加c t i o ni np “e n t 8w i t l li h 神I I l i cl e u k o - a r a i 喁i s
18、J JN e u r o IN e 叫培u r gP s y c h i a h y ，2 0 0 4 ，7 5 ( 3 ) ：4 4 l 一 4 4 7 9 P i n r 啪Hw ，G 丑j nDD B i l a t e r a lo c c l i 0 ft l l ec 啪t i d8 n e r y J A r i zM e d ，1 9 6 3 ，2 0 ：3 2 3 7 1 0 I a 卅n 8 k yD ，A r t e m i Ns A c h a v a l M ，d “c I l l 吼i c 蛳锄l 删 删i d 盯蛔y c l u s i I 哪：an 1 0 d
19、e lf 矗o c I l l a ri h 枷cs y n d I 伽i I It h e 哪 J G r a e f 矗A I hc h nE 印0 p h t I l a l 脚J ，2 0 0 6 ，2 4 4 ( 2 ) ：1 9 9 2 0 4 1 1 郭春彦工作记忆：一个备受关注的研究领域 J 心理科学进 展，2 0 0 7 。1 5 ( 1 ) ：l 一2 1 2 P a n t o l I iL ，B D g g e s iA ，B 鹊i I eAM ，d 越L 朗k 衄r a i o s i 寻p r e d i c t Bh i d d 锄g l o b a I 劬c t
20、 i o n i n gi m p a i m l e n ti n 咖d i s a b l e do I d e rp t ，o p l e ：岫 L A D I s ( b k r 8 i i B 锄dD i B a b i h t yi nt l l eE l d e r l y ) S t I l d y J JA I n G 商d 盯s o c 2 0 0 6 ，5 4 ( 7 ) ：1 0 9 5 一l 1 0 1 1 3 刘其强，孙治坤，朱永林尼美舒利对大鼠慢性脑缺血后白质损 伤的改善作用 J 郑州大学学报：医学版，2 0 0 5 ，4 0 ( 6 ) ：1 0 9 0 1 0 9 3 1 4 w a k i 诅H ，1 o m i f t oH ，A k i g I I c h iI 。耐耐缸呷a Id a 蛐咿彻dd e - m y e l i 枷o ni nt l I ew h i t em 撕a f k rc h m n i cc e 地b r a lh y I o p e 西膪i o n i l l t h em t J B r a i n ，2 0 0 2 ，9 2 4 ( 1 ) ：6 3 7 0 ( 编辑吴培红) 万方数据