热休克预处理在大鼠脊髓损伤后细胞凋亡中的作用.pdf

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1、J o u m a l o f Me d ic a l F o r u m V o l . 2 6 N o . 1 3 J u l y 2 0 0 5 4 3 热休克预处理在大鼠脊髓损伤后 细胞凋亡中的作用 王 勇张永福毛伯锗 河南省人民医院神经外科郑州市4 5 0 0 0 3 摘要目的 探讨大 鼠脊髓损伤 后热休克蛋白7 0 ( H S P 7 0 ) 和氧化氮合酶( i N O S ) 在细胞凋亡中的作用 方法将 9 6只大鼠分为对照组、 损伤组和热休克预处理组。采用静压型脊敌损伤模型， 分别在伤后6 h , 1 2 h , I 天， 2天， 3天， 1 周， 2 周和3周处死动物用原位杂

2、交技术检测 H S P 7 0 m R N A在以上各时点的表达。同时用免 疫组化法检测 H S P 7 0 , i N O S在各时点的表达。运用 T O N E L法检测凋亡细胞。另外， 用C B S评分来评枯神经功 能。结果C B S 评分显示， 热休克预处理组的神经功能明显好于损伤组(P0 . 0 5 ) 凋亡细胞数在损伤组显 著高于热休克预处理组( 尸 0 . 0 5 ) ,通过原位杂交 和免疫组化发现， H S P 7 0 m R N A和蛋白水平在热休克预处 理组明显高于损伤组( P 0 . 0 5 卜 免疫组化的结果还显示， iN O S的量在热休克预处理组明显低于损伤组( P

3、 。 . 仍) 。结论热休克预处理能减轻脊髓损伤后的细胞调亡， 其机理可能同H S P 7 0合成增加， 并进一步抑制 i N O S的表达有关 关键词眷髓损伤 热休克预处 理热 休克蛋白7 0 i N O S 凋亡 图分类号: R一 3 3 2文献标识码: A文章编号: 1 6 7 2 - 3 4 2 2 ( 2 0 0 5 ) 1 3 - 0 0 4 3一 0 3 E ff e c t s o f H y p e r t h e r m i c P r e c o n d i t io n i n g o n A p o p t o s i s a f t e r S p i n a l

4、C o r d I n j u r y i n R a t s W A N G Y o n g , Z H A N G Y o n 动i , M A 0 B o y o n g D e p a r t m e n t o f N e u r o s u r g e r y , H e n a n P r o v i n c i a l P e o p le s H 峋) it a l , Z h e n g z h o u 4 5 0 0 0 3 , C h i n o A B S T R A C T O b j e c t i v e T o s t u d y th e e ff e c

5、t s o # H S P 7 0 a n d i N O S o n a p o p t o s i s a f t e r s p i n a l c o r d i n j u ry i n r a t s . M e t h o d s A t o ta l o f 9 6 r a t s w e r e d i v id e d i n t o c o n t r o l ( A ) ， t r a u m a ( B ) a n d h y p e r - t h e r m i c p re c o n d i t i o n in g ( C ) g r o u p . S p

6、 i n a l c o r d i n j u ry ( S C I ) m o d e l s w e re m a d e 场 s t a t i c c o m p r e s s io n . T h e a n i m a l s w e r e d e c a p i t a t e d a t 6 h , 1 2 h , l d , 2 d , 3 d , l w , 2 w a n d 3 w a f te r i n j u ry . H S P 7 0 a n d i N O S e x - p r e s s i o n i n s p i n a l c o r d

7、w e re d e t e c t e d b y u s i n g i m m u m o h i s ta c h e m i c a l t e c h n i q u e.H S P 7 0 m R N A e x - p r e s s i o n i n s p i n a l c o r d w e r e d e t e c t e d b y u s i n g i n s i t u h y b r i d i z a t io n ( I S H ) m e t h o d . C e l l s a p o p to s i s w e r e e x a m i

8、n e d 场t h e T U N E L r e a c t i o n . N e u r o lo g i c a l o u t c o m e w e r e e v a l u a t e d b y t h e c o m b i n e d b e h a v i o r a s c o r e ( C B S ) . R e s u l ts N e u r o l o g i c a l o u t c o m e i n t h e g ro u p C w a s s ig n i fi c a n t ly h i g h e r t h a n i n th e

9、g r o u p B ( P0 . 0 5 ) . I S H a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t ry a n a l y s i s s h o w e d t h e l e v e l o f H S P 7 0 m R N A in t h e g ro u p C w a s s i g n i fi c a n tl y h i g h e r t h a n i n t h e g r o u p B ( P0 . 0 5 ) . T h e l e v e l o f i N O S i n t h e g ro u p C

10、w e re s i g n i f i c a n tl y l o w e r t h a n i n t h e g r o u p B ( P0 . 0 5 ) . I n t h e g r o u p C， t h e n u m b e r o f a p o p t o t i c c e l l s w e r e s i g n i f i c a n tl y l e s s t h a n t h o s e i n g r o u p B ( P0 . 0 5 ) . C o n c l u s i o n H y p e r th e r m i c p r e c

11、 o n d i - t i o n in g m i g h t d e c r e a s e a p o p t o s i s , w h i c h m i g h t b e a s s o c ia t e d w i t h t h e i n d u c t i o n o f H S P 7 0 s y n t h e s is , s u g g e s t i n g t h a t H S P 7 0 p r e v e n t s a p o p t o s is b y i n t e r a c t i n g w i t h i N O S . KE Y WO

12、R D S S C I ; h y p e r t h e r m i c p r e c o n d i t i o n i n g ; H S P 7 0 ; i N O S ; A p o p t o s i s 细胞凋亡在脊髓损伤的继发性损害中起着关 键 作 用 1 1 。 我 们 通 过热 休 克 预处 理 诱 导大鼠 产生 热 休克蛋白7 0 ( h e a t s h o c k p r o t e i n 7 0 H S P 7 0 ) ， 应用 D N A缺口 末端标记( T U N E L ) 技术观察其对细胞凋 亡的影响， 通过原位杂交技术检测 H S P 7 0 m R

13、 N A 及免疫组化 L S A B法检测 H S P 7 0和氧化氮合酶 医 药论坛杂志 2 0 0 5 年7 月 第2 6 卷 第1 3 期 ( i N O S ) 的表达， 来探讨 H S P 7 0和 i N O S影响细胞 凋亡的机理。 1 材料与方法 1 . 1 动物模型( S D ) 大鼠麻醉后， 打开椎板将 3 0 ; 重物通过( 2 x 5 ) m m光滑金属垫片压迫于脊 髓后正中， 时间为 l o m i n , 以此来制做压迫模型。 1 . 2 动物分组取( 2 5 0 士 5 0 ) g 的雄性 S D大鼠 9 6只， 随机分为 3组。A组( 对照组) 1 6只， 不作

14、 预处理， 置室温( 1 8 一2 2 9 0) 中仅行椎板切开; B组 ( 损伤组) 4 0只: 不作预处理， 置室温( 1 8 一 2 2 9C ) 中行椎板切开并进行压迫处理制作脊髓压迫伤模 型; C 组( 热休克预处理组) 4 0 只， 大鼠麻醉后， 置 4 5 水浴箱中， 使其肛温升至4 2 后， 转至4 2 水 浴箱中维持 1 5 m i n ， 然后置室温恢复 6 h后制作脊 髓压迫伤模型。各组在伤后 6 h , 1 2 h , 1 天 、 2天、 3 天、 1 周、 2 周和3周共 8个时点进行观察 ， 其中 A 组每个时点2只， B和 C组每个时点各5只。 1 . 3 试剂与

15、方法 H S P 7 。 原位杂交检测 试剂盒及 H S P 7 0 和i N O S 兔抗大鼠多克隆抗体购白 武汉博 士德公司。 原位杂交按试剂盒说明进行， 免疫组 织化学应用 1 S A R法( 工作浓度均为 11 0 0 ) o 1 . 4 结果评定标准在光镜下， 原位杂交以细胞 胞浆出现棕黄色颗粒为阳性， 免疫组化 H S P 7 0以 胞浆或胞核中出现棕黄色颗粒为阳性; i N O S以 胞 浆中出现棕黄色颗粒为阳性。每张切片在相同放 大倍数下， 各选取阳 性细胞最集中的1 0 个视野， 每 个视野数 1 0 0个细胞， 计算出每张切片上阳性细胞 的百分率。 1 . 5 统计分析 数

16、据以无士 、 表示， 以 检验进行 显著性检验 。 其表达。余下的观察点未见表达， 结果见表 t o 2 结果 2 . 1 H S P 7 0 m R N A原位杂交结果对照组未 见 H S P 7 0 m R N A 表达。 损伤组在伤后6 h 可见 表达， 1 2 h 明显减少， 在以后的观察点基本为阴性。阳性 细胞主要是神经元， 同 时有部分胶质细胞呈阳 性。 热休克预处理组的H S P 7 0 m R N A的表达量在6 h , l 2 h 均大于损伤组( P 0 . 0 5 ) ; 而且在2 4 h还可见 表1 H S P7 0 . R N A的 原位杂交结果( x 士 s ) 分

17、组a 6 h 1 2 h I 天 损 伤组4 0 1 .9 2 士 1 . 3 1 0 . 3 2 士 0 . 4 1 0 预处理 组4 0 6 . 1 8 士 1 . 1 7 中2 . 5 8 士 0 . 8 9 0 . 1 6 士 0 . 2 1 注: 甲 与 损伤组比P a 0 . 0 5 . 2 . 2 T U N E L染色结果对照组罕见 T U N E L阳性 细胞。损伤组和热休克预处理组均可 见T U N E L 阳 性细胞， 在高倍镜下， 可见阳 性细胞符合典型凋亡 细胞形态特征。脊髓损伤区在伤后6 h即可见凋亡 细 胞; 随后凋亡细胞逐渐增多， 高峰期位于伤后 1 2 h ;

18、 接下来的观察点发现凋亡细胞又逐渐减少， 伤后3 周仍然可见凋亡细胞。阳性细胞主要分布 于白质， 少数分布于灰质。阳性细胞以胶质细胞 为主， 并可见少数神经元细胞阳性。热休克预处 理组和损伤组相比， 各观察点的凋亡细胞均显著 减少 ， 其中在 6 h , 1 2 h , 1 天、 2天和 3 天两组有明显 差异( P 0 . 0 5 ) 。损伤组与预处理组脊髓损伤中 的T U N E L 结果见 表2 0 2 . 3 H S P 7 0 免疫组化结果 H S P 7 0 蛋白在对照 组 仅见零星表达， 损伤组在 6 h即见表达， 并持续至 2 周 ， 高峰位于第 3天。阳性细胞主要也是神经元，

19、 另有少量胶质细胞、 血管内皮细胞呈阳 性。热休 克预处理组H S P 7 0蛋白虽然同样在伤后 6 h 一 2周 可见表达; 但其在1 2 h - 2 周的相同观察点， 阳 性细 胞计数大于损伤组( P 0 . 0 5 ) ， 见表3 , 2 . 4 i N O S免疫组化结果对照组少 见i N O S表 达， 损伤组i N O S 在伤后6 h 即见少量表达， 高峰 位 于第3 天， 在3 周仍可见 表达。阳 性细 胞主要是神 经元和胶质细胞。而在热休克预处理组， 虽未见 其持续时间缩短 ， 但在 1 天 一 2周阳性细胞数明显 小于损伤组( P 0 . 0 5 ) ， 见表4 , 3 讨

20、论 脊髓损伤的预后同继发损害的范围有关， 而 细胞凋亡作为继发损害的一个重要方面。其在脊 髓损伤预后中的作用正 日益受到重视， 所以如何 减轻细胞凋亡是我们治疗脊髓损伤的重点之一。 表2 脊髓损伤中的T U N E I结果( 宪 士: ) 分组 损伤组 预处理组 1 周2周3周 4040 5 . 4 2士0 . 4 1 4. 38 士 0. 46 2 1 . 9 4士 2. 2 1 1 5 . 1 8士2 . 8 f 1 6 . 8 4土 8 3 1 3 5 6士0 . 7 9 1 2 . 3 6士1 . 7 1 9 _ 9 6土1 _ 4 2 . 8 . 3 8士1 . 0 8 6 . 2

21、6士1 . 0 5 3 . 4 4士 0. 5 2 3. 28 士0 . 5 9 2 . 7 - 0. 4 7 2 3 土n 4R 2 . 9 .0 . 3 9 2 . 1 8 10 . 5 4 注: * 与 损伤组比P 0 .0 5 J o u rna l o f Me d i c a l F o mm V o l . 2 6 N o . 1 3 J u l y 2 0 0 5 表 3 H S P 7 0的免疫组化结果( x士s ) 分组 损伤组 预处理 组 6 1 , 1 2 h2周3 周 4 0 5. 7 4 m 1 . 9 7 7 . 9 6 1 2. 3 4 4 0 6. 7 2士1

22、 . 4 8 1 3 _ 0x3 . 2 7 1 1 . 7 4 士 2. 6 4 1 6 . 5 1 4 . 4 4 2 0 . 7 4 士 4. 1 7*2 7. 7 2 x 2 . 2 6“ 2 2. 6 6士3 . 3 4 4 3 R fi士4 . 8 2 1 0 . 3 2士3 1 5 . 5 6士3; 3 - 7 2 1 2_ 0 4 0 . 8 士 0 . 8 4 6 7 6士1 9 6 0 . 9 6 土 0 . 7 4 注: . 与同 期损伤 组相比 较P 0 . 0 5 表 4 士.1 ) 分组a 6 h2 周3周 损伤组4 0 1 0 . 5 2 m 2 . 7 8 1

23、3 . 4 4 x 2 . 3 8 2 3 . 5 4 m 2 . 5 7 预处理组 4 0 8林 士 3 . 0 3 1 0 . 9 8 士 2 . 1 8 1 5 . 6 士 2 . 6 3 AO S的免疫组化结果 2 天3大 3 2 . 9 4士3 . 3 4 4 6. 8 t 5 . 1 1 2 5 . 2 4 x5 . 0 2 0 3 9 . 3 6士 2. 7 3“ 2 7 . 0 4 x 4 . 6 1 1 8 . 5 2土3 . 9 4 1 9 . 3 8士 3. 8 9“ 1 1 . 312 . 2 9 2 . 2 4 士1 . 7 1 1 2 4 t1 1 8 注: . 与

24、同 期损 伤组 比 较P c 0 . 0 5 热休克反应是一种重要的应激反应， 对损伤 后的神经细胞具有保护作用， 而这一作用主要是 通过合成 H S P 7 0并发挥其生物效应来实现的。 H S P 7 0 做为一种应激蛋白， 大约有2 0 0 余种因素能 刺激其产生， 如理化有害刺激、 缺血、 缺氧等， 因而 又称热应激蛋白。H S P 7 0的保护机理同其分子伴 侣作用和抗凋亡等方面有关。 一氧化氮( N O )是 重要的生物信息分子和效应分子， 在体内 广泛参 与多种 生理、 病理过程。 体内N O由 一氧化氮合酶 ( N O S ) 生成， N O S 广泛存在于包括中枢神经系统 在

25、内的 各系统中。 N O S 有3 种亚型， 其中i N O S 产 生的N O 量大、 持续时间长。N O在神经系统中的 作用非常复杂， 有时具有双重性。它 可舒张微血 管， 避免微血栓形成， 以保证局部微循环的畅通。 另 外， 它还可通过直接引起过氧化损伤或作为信 号介质介导其它炎症因子而产生不利作用。 T s u c h ry a 2 等 通过大 脑中 动脉线 栓法 梗塞 模 型， 发现在H S P 7 0 转基因鼠中 不仅梗塞面积减小， 而 且凋亡细胞数也小于野生型鼠。在实验中， 我 们发现热 休克预处理组的H S P 7 0 m R N A的表达量 大于损伤组; 而且表达持续时间延长

26、( 表2 ) 。另 外， H S P 7 0 蛋白的阳性细胞计数大于损伤组 表 3 ) 。说明预处理组 H S P 7 0的转录和翻译水平均高 于损伤组。同时， 还观察到预处理组和损伤组相 比， 凋亡细胞明 显减少( 表1 ) 。 最终的C B S 评分 也表明前者较后者提高。说明热休克预处理对脊 髓损伤有一定的 保护作用。而此保护作用又同 凋 亡细胞减少有关。 急性脊髓损伤中， 我们观察到损伤组i N O S 在 伤后6 h 即见少量表达， 高峰位于第3 天， 在第3 周 仍可见表达。而在热休克预处理组， 虽未见其持 续时间缩短， 但在 1 天 一 2 周阳性细胞数明显小于 损伤组( 表4

27、) 。关于 i N O S和 H S P 7 0的关系: 有学 者认为H S P 7 0 增加可导致i N O S 表达 减少: 3 1 ， 但也 有研究得出相反的结论i 4 1 。在我们的实验中， 观 察到i N O S 在H S P 7 0 高表达的热休克预处理组较 低表达的损伤组低。有研究认为通过用脂多糖 L P S 孵育C 6 胶质细胞可使i N O S m R N A I 蛋白 水平 和其活性均增加。随后用4 3 C 孵育细胞， 使其产 生热休克反应， 发现在1 8 一 2 4 h 后 其活 性减 低。 再 用H S P 7 0 的反义寡核昔酸又可逆转此反应， 使其 活性再度增加。所

28、以， 在胶质细胞中， 使其大量表 达H S P 7 。 可 减少i N O S的表达。 但关于其具体机 制尚不清楚。 关于i N O S 在凋亡中的 作用， Y u n e I s j 等在脊髓 损伤中的研究发现， 在伤后4 h 损伤区域的i N O S 和N O水平显著增加。同时还观察到T U N E L阳 性 细胞在伤后2 4 一 4 8 h 达到高峰， 他 们认为凋亡是由 于 N O增加所致， 因为在运用 N O S竞争性抑制剂 L 一 N 一 硝基精氨酸甲醋( L 一 N g 一 n it r o 一 a r g i n in e m e t h 川 e s t e r ) 后， 可导

29、致T U N E L阳性细胞减少。所 以， 本实验证实， 热休克预处理可诱导H S P 7 0 表达 增加， 进而抑制i N O S 的合成， 最终减少细胞凋亡 并 对脊髓损伤产生保护作用。 但是， 关于其具体 作用机理仍需进一步研究。 参 考 文 献 S e k i T, H i d a K, T a d a M, e t a l . B o le o f t h e h c l 一 2 g e n e a f - te r c o n t u s iv e s p i n a l c o r d in j u ry in m ic e . N e u ros u r g e ry, 2 0

30、 0 3 , 5 3 ( 1 ) : 1 9 2 - 1 9 8 T s u c h iy a D, H o n g S , Ma ts u mo r i Y, O v e r e x p r e s s io n o f r a t h e a t s h o c k p r o t e in 7 0 r e d u c e s n e u mn a l in j u ry a f t e r tr a n s i - e n t fo c a l i s c h e m i a , t r a n s i e n t g l o b a l is c h e m i a , o r k a

31、 i n ic a c id一i n d u c e d s e i z u re s . N e u m s u rg e ry, 2 0 0 3 , 5 3 ( 5 ) : 1 1 7 9 - 1 1 8 7 L a u S S , G r i f fi n T M, M e s t r i l B . P rot e c t io n a g a i n s t e n d o t o x - e mia铸 H S P 7 0 i n ro d e n t c a r d i o m y my t e s . A m J P h y s i o l H e a r t C i r c P

32、 h y s io l , 2 0 0 0,2 7 8 ( 5 ) : 1 4 3 9 - 1 4 4 5 B e ll m a n n K, B u r k a rt V, B r u c k h o f f J , e t a l . P 3 8 一d e p e n d - e n t e n h a n c e m e n t o f c y t o k i n e 一i n d u c e d n i t ri c一o x id e s y n - t h - g e n e e x p r e s s i o n b y h e a l s h o c k p rote i n 7

33、 0 . J B i o l C h e m, 2 0 0 0 , 2 7 5 ( 2 4 ) : 1 8 1 7 2 - 1 8 1 7 9 Y u n e T Y , C h a n g M J , K i m S J . I n c re a s e d p ro d u c ti o n o f t u m o r n e c ros i s f a c t o r一 a l p h a i n d u c e s a p o p to s i s a f te r tr a u - ma t ic s p in a l c o r d in j u ry i n r a ts . J N e u m t m u ma , 2 0 0 3, 2 0 ( 2 ) : 2 0 7 - 2 1 9 2 0 0 5 -0 3 -2 4收稿