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1、文章编号: 10012087(2001)03016402 单底物一步法测定血清脂肪酶及其临床应用 沈 瑛1,宋耀虹1,刘 斌2,黄辉明2,吴菊芳3 (1 1 北京协和医院,北京100730;21 友谊医院;31 潞和医院) 摘要:目的 介绍一种脂肪酶(L ipase,L PS)测定的新方法,并探索其临床应用。方法 采用一个大分子有机物 作单底物的一步速率法。结果 该法零级反应长达15 m in以上,线性范围01 500 U?L ,CV 118%718%之间。 与比浊法相比r= 01998。临床观察38例急性胰腺炎,同时测定胰淀粉酶,二酶呈高度相关。结论 本法简单、 准确、 稳定、 可与淀粉酶一
2、起用作急腹症的常规测定。 关键词:脂肪酶;急性胰腺炎;酶法测定 中图分类号: Q 556 文献标识码: A 血清脂肪酶(L ipase,L PS)为急性胰腺炎的重 要诊断指标,由于它的组织来源比 2淀粉酶少,故 诊断的特异性优于淀粉酶。L PS的测定方法有滴定 法,比浊法,荧光光度法和免疫法等。1986年以来 Beckman公司推出四酶偶联法,近又见报道五酶偶 联法1。 这些方法在实际应用中都还存在一些问题, 以致它的测定未能普及。我们介绍一种新方法即单 底物一步速率比色法,并对其性能作初步评价。 材 料 和 方 法 一、反应原理 采用一个人工合成的大分子有 机物1, 22二月桂基2rac2丙
3、三氧基232戊二酸试灵酯 为底物。该底物在碱性环境中, L PS和共脂肪酶 (Colipase)作用生成1, 22o2二月桂基甘油和戊二酸 基26 甲基试卤灵。后者不稳定,在碱性条件下自发 生成戊二酸和甲基试卤灵。甲基试卤灵是一个显色 团,在波长581 nm处有吸收峰,其581 nm= 57194 mmol . cm(T ris2HCl pH 712),因此可通过测定颜色 生成的速率定量测定L PS的活性。 单位定义:在本实验条件下每m in转化1mol 底物的酶量为1个单位。 二、仪器 日立705,Beckman CX7,德国宝灵 曼公司Reflotron反射光度计(干片法)。 三、试剂 1
4、1 胰淀粉酶干片试纸条(德国宝灵 曼公司生产,参考值为 135 U?L)。21L PS测定试剂 盒,德国Centronic公司生产,北京天象人公司提供。 试剂? 缓冲液T ris2HCl pH7125010 mmol?L 脱氧牛磺胆酸 610 mmol?L 试剂 底物(乳剂) 012 mmol?L 共脂肪酶 500 kU?L 校正液 人胰淀粉酶 572 U?L 四、方法 Beckman CX7参数,采用同时双试 剂加样。反应类型带标准Rate,主次波长570?700 nm ,温度37,样本量10 l, 试剂? 为200 l, 试剂 为20 l, 加试剂? 开始后3046s读试剂空白。 第320
5、秒加入样品后于第384秒开始到第488秒读 数,仪器会自动读出 A?m in。 结 果 一、精密度试验 批内重复性,取高低水平脂 肪酶,重复测定20次,低值CV为1183% ,高值CV 为1169%。 批间重复性,取高低水平L PS,分别在10 d共测定20次,低值CV为7184% ,高值CV为 4185%。 二、线性试验 选取高值血清做线性试验,结 果表明,L PS活性在1 500 U?L范围内呈线性。 三、对照试验 与Centronic公司生产的比浊 法试剂盒作对比,选活性在0900 U?L之间样本 56份,用二法测定,结果经统计学处理得回归方程 为: Y(酶 )= 0 19963X(浊)
6、216,r= 01998。 四、参考值范围 我们测定133名健康人的血 清L PS活性,结果参考值为 190U? L , 比德国人提 供的参考值 220 U?L为低。 五、临床应用 1.用本法和德国宝灵曼公司的 干化学法分别测定38例经临床确诊为急性胰腺炎 病人的L PS和胰淀粉酶(P2AM Y ), 急性胰腺炎时 两种酶呈高度相关。两种酶在发病早期出现阳性的 时相基本一致。38例中L PS最高值5062 U?L , P2 Amy为3 656 U?L ,分别为各自的参考值上限的 2616和2710倍,可见两种酶均有较高的灵敏度。21 461上海医学检验杂志2001年第16卷第3期 1995-2
7、005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 我们还测定了5例非急性胰腺炎,结果见表1。 表1 5例非胰腺炎病人两种酶情况 例 号临床诊断P2AM Y(U?L)LPS(U?L) 1贲门癌32413 2胰腺占位344114 3胰腺C癌543151 4腹痛25090 5腹痛28084 结果表明P2AM Y全部呈低值假阳性,而L PS 则全部阴性。31 有二例胆源性胰腺炎 ,B 超诊断为水 肿型,入院时症状重,两种酶升高显著,但经保守治疗 后痊愈,我们追踪观察了两种酶变化,结果见表2。 表2 2例胆原型胰腺炎病程中
8、两种酶观察 例号 LPS(U?L) 第1天第3天第7天 P2AM Y(U?L) 第1天第3天第7天 11 0627581601 05157295 23 4001 8804891 142728104 可见L PS在发病早期上升幅度大, 7 d临床治 愈后P2AM Y已转阴,但例2的L PS仍阳性,提示 L PS的持续时间长。 讨 论 L PS(EC3111113,又称甘油脂酰水解酶)能水 解多种含长链 (8 18) 碳链脂肪酶的甘油酯,三酰甘 油是它的天然底物。L PS对三酰甘油两端 位的脂 肪酸亲和力强,而且酶和底物的反应只在油水的界 面上进行。因此底物必须呈乳剂状态。本底物唯一 的一个酯链在
9、一端的 位,具有与酶反应的优越条 件,而甘油另两个羟基分别与12烷醇连接,组成12 烷基醚结构。 这是一种非离子表面活性剂,具有增溶 和乳化的性质2,因此这个底物既有较强的亲和力, 又能在有机溶剂中形成稳定的乳化结构。有利于与 酶进行反应,因此它一出现就显示强大的生命力。 Panteghini 3认为本法推广将会导致L PS 测定方法 的革新。 我们采用速率法,由于底物在有机溶剂中制成 的乳剂高度稳定,而L PS与底物又只在乳剂的界面 发生反应,这种反应方式自然地避免常见血清内溶 血、 黄疸和乳糜的干扰。 文献报道4急性胰腺炎时 , P 2AM Y敏感度为 85% ,特异性为80% ,而L P
10、S两者均为90%。如同 时测定两种酶,敏感度可提高到95%。38例急性胰 腺炎和5例非胰腺炎活性的表现支持以上论断。故 认为将L PS列入急腹症的急症项目,必可减少对急 性胰腺炎的漏症和延误而造福患者。 本法简单、 快速、 准确、 稳定,无干扰而且容易自 动化。我们深信通过本法的推广,L PS测定能起到 比以往更重要的作用。 参 考 文 献 1关广雄,邓巍.血清脂肪酶酶偶联法试剂盒的应用J . 临床检验杂志, 1997, 15(3): 1502152. 2赵维荣,张胜义,章玉川,等.表面活性剂活化学.第1 版.合肥:安徽大学出版社, 1997. 2072218. 3 PanteghiniM ,
11、 et al . M easurement of pancreatic lipase activity in serum by a kinetic colori metric assay utiliz2 ing a chromogenic substrate reagent, Clin Chem 1996, 42(6): s101. 4林其燧.临床化学方法大全.北京:北京大学出版社, 1990. 7192720. (收稿:2000204207 修回:20002082 08) (本文编发:龚晓霖) 561上海医学检验杂志2001年第16卷第3期 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.