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1、1 抑制补体激活对脓毒症大鼠肺组织的作用研究 魏乔1 ，曹戍2 ，康福新1 ，石银川2 ，宋华2 ，王瑞兰1 ，李国平2 ( 1 上海交通大学附属第一人民医院危重病科，上海2 0 1 6 2 0 ； 2 南昌大学第二附属医院急诊科，南昌3 3 0 0 0 6 ) 摘要：目的观察补体抑制剂眼镜蛇毒因子( C V F ) 抑制补体激活对脓毒症大鼠肺组织的作用。方法1 4 4 只清 洁级雄性S D 大鼠( 体质量2 5 0 3 0 0g ) 被随机分为A 、B 、C3 组，每组4 8 只。A 组( 假手术组) 仅开腹翻动盲肠后关 腹，B 组( 脓毒症组) 采用盲肠结扎穿孔术( C I 。P ) 复制
2、脓毒症大鼠模型，C 组( C V F 组) 在C L P 前2 4h 按5 0 # g k g 注 射C V F 以耗竭补体，而A 组和B 组则在术前2 4h 给予等量生理盐水。术后2 、4 、8 、1 2 、1 6 、2 4h6 个时间点处死动 物后大体观察各组大鼠肺脏及胸腔积液变化，并采集肺组织标本检测肺组织M P O 水平，同时观察肺组织病理学及 超微结构变化。结果B 组可见肺组织实变区及胸腔积液情况随时问增长逐渐加重，C 组明显减轻，A 组没有相关 表现。A 组肺组织M P O 水平术后一直处于较低水平，而B 组和C 组则迅速升高，除2h 外，其余时间点均显著高 于A 组( P 0 0
3、 5 或P 0 0 1 ) ，但C 组显著低于B 组( P o 0 5 或P 0 0 1 ) 。肺组织病理学及超微结构变化提示 B 组损伤最严重。C 组明显减轻。绪论补体抑制剂C V F 可以明显减少中性粒细胞在肺内的聚集，并有效减轻脓 毒症大鼠的肺损伤，显示出对肺组织良好的保护作用。 关键词：脓毒症；补体；眼镜蛇毒因子；肺；动物，实验，大曩 中图分类号；R - 3 3 2 ；R 5 1 5 3文献标识码：A文章编号：1 0 0 0 - - 2 2 9 4 ( 2 0 0 8 ) 0 3 - - 0 0 0 1 - - 0 4 E f f e c t so nL u n gT i s s u
4、e sb yI n h i b i t i o no f C o m p l e m e n tA c t i v a t i o ni nS e p t i cR a t s W E IQ i a 0 1 ，C A OS u 2 ，K A N GF u - x i n l ，S H IY i n - c h u a n 2 ，S O N GH u a 2 ，W A N GR u i l a n l ，L IG u o - p i n 9 2 ( 1 I n t e n s i v eC a r eU n i t ，t h eA f f i l i a t e dF i r s tP e o
5、p l e sH o s p i t a lo fS h a n g h a iJ i a oT o n gU n i v e r s i t y ， S h a n g h a i2 0 1 6 2 0 ，C h i n a ；2 D e p a r t m e n to fE m e r g e n c y ，t h eS e c o n dA f f i l i a t e dH o s p i t a lo f N a n c h a n gU n i v e r s i t y ，N a n c h a n g3 3 0 0 0 6 ，C h i n a ) A B S T R A
6、C T ：O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h ep r o t e c t i v ee f f e c t so nl u n gt i s s u e sb yi n h i b i t i o no fc o r n p l e m e n ta c t i v a t i o nb yc o b r av e n o mf a c t o r ( C V F ) i ns e p t i cr a t s M e t h o d s O n eh u n d r e da n df o r t y f o u rS Dr a t
7、s ( c l e a n ，m a l e ，2 5 0 3 0 0g ) w e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s ( e a c hn 一4 8 ) ： g r o u pA ( s h a mg r o u p ) ：a b d o m e nw a so p e n e da n dc l o s e dl a t e rb u tw i t h o u tc e c a ll i g a t i o na n dp u n c t u r e ( C I 。P ) ，g r o u pB ( s e
8、 p s i sg r o u p ) ：s e p s i sw a si n d u c e db yC L P ，g r o u pC ( C V Fp r e t r e a t m e n t g r o u p ) ：s e p s i sw a si n d u c e db yC I 。Pa f t e rp r e t r e a t m e n tw i t hC V F A t2 4h o u r sb e f o r et h eo p e r a t i o n ，r a t sw e r eg i v e nam a i n l i n ed o s eo fe i
9、 t h e r5 0 t g k gC V Fi ng r o u pCo ra ne q u a lv o l u m eo fs a l i n es o l u t i o ni nb o t hg r o u p sAa n dB E i g h ta n i m a l sw e r ek i l l e da t2 ，4 ，8 ，1 2 ，1 6 ，2 4h o u r sp o i n t s a f t e ro p e r a t i o n C h a n g e so fl u n gt i s s u e sa n dp l e u r a le f f u s s
10、i o nw e r eo b s e r v e d ，a n dl u n gt i s s u e sw e r e h a r v e s t e da f t e rt h ea n i m a ld i e dt od e t e r m i n et h el e v e l so fM P Oa n di n v e s t i g a t et h ec h a n g e so fp a t h o l o g ya n du h r a s t r u c t u r e R e s u l t s T h ec h a n g e so fl u n gt i s s
11、u e sa n dp l e u r a le f f u s s i o nw e r es e v e r e i ng r o u pBt h a no t h e rg r o u p s T h eM P Ol e v e l so fl u n gt i s s u e si ng r o u pAr e m a i n e dl o wi na l lt i m e p o i n t s H o w e v e r ，t h el e v e l si ng r o u pBa n dg r o u pCr o s eq u i c k l ya f t e ro p e r
12、 a t i o na n dw e r eh i g h e r 收稿日期：2 0 0 7 1 2 2 9 基金项目：江西省自然科学基金资助项目( 0 4 4 0 0 8 3 ) 作者简介：魏乔( 1 9 8 l 一) ，男，硕士研究生，主要从事危重病的临床研究。 通讯作者：王瑞兰，博士，主任医师，教授，主要从事危重病的临床研究，E - m a i l ：w a n g y u s u n h o t m a i l c o r n 。 万方数据 2 t h a nt h a to fg r o u pAs i g n i f i c a n t l ye x c e p tt h e2hp
13、 o i n t ( P 0 0 5o rP 0 0 1 ) T h el e v e l si ng r o u p Cw e r el o w e rt h a nt h a t o fg r o u pBs i g n i f i c a n t l y ( P 0 0 5o rP O 0 1 ) T h ec h a n g e so fp a t h o l o g y a n du l t r a s t r u c t u r es h o w e dt h a tt h el u n gi n j u r yw e r es e v e r ei ng r o u pBt h
14、a ni no t h e rg r o u p sa n d l u n gi n ju r yi ng r o u pCw e r el e s s e n e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dt Ot h a to fg r o u pB C o n c l u s i o n C V F c o u l dr e d u c et h ea g g r e g a t i o no fn e u t r o p h i li nt h el u n gt i s s u e sa n dl e s s e nt h el u n gi
15、n ju r yi ns e p t i c r a t ss i g n i f i c a n t l y ，w h i c hs h o w e dt h ep r o t e c t i v ee f f e c t so nl u n gt i s s u e so fs e p t i cr a t s K E YW O R D S ：s e p s i s ；c o m p l e m e n t ；c o b r av e n o mf a c t o r ；l u n g ；a n i m a l ，l a b o r a t o r y ；r a t s 脓毒症是由感染导致
16、的全身炎症反应综合征， 是严重创伤、烧伤、休克、外科大手术、感染等临床急 危重患者的严重且常见并发症之一，极易诱发脓毒 性休克、多器官功能障碍综合征( M O D S ) 及多器官 衰竭( M O F ) ，其中肺脏常常是最早受累的器官，但 具体原因尚不清楚。有研究表明补体系统过度激活 可能参与了这一过程【1 。补体抑制剂眼镜蛇毒因子 ( c o b r av e n o mf a c t o r ，C V F ) 是一种经典的补体抑制 剂，可以经旁路途径激活补体，通过不断裂解补体 C 3 、C 5 使补体耗竭而发挥抗补体作用。本研究采 用盲肠结扎穿孑L ( c e c a ll i g a
17、t i o na n dp u n c t u r e ，C L P ) 复制脓毒症大鼠模型，通过动态观察C V F 抑制补体 激活后肺组织髓过氧化物酶( M P O ) 的变化，并结合 肺组织病理学及超微结构改变，进一步探讨抑制补 体激活对脓毒症大鼠肺组织的作用及意义。 1 材料与方法 1 1 实验动物与分组 清洁级雄性S D 大鼠( 江西中医学院实验动物 中心提供) 1 4 4 只，体质量2 5 0 3 0 0g ，将大鼠随机 分为假手术组( A 组) 、脓毒症组( B 组) 和C V F 组 ( C 组) 3 组，每组4 8 只。各组按照标本采集点的不 同又分为术后2 、4 、8 、1
18、2 、1 6 、2 4h6 个时间点亚组， 每个时间点亚组8 只。A 组仅开腹翻动盲肠后关腹 并复苏，不行C L P ，B 组和C 组均需行C L P 复制脓 毒症模型。C 组于术前2 4h 经大鼠阴茎背静脉注 射C V F5 0 卫g k g ，A 组和B 组则给予等量生理盐 水。 1 2 模型制作 B 、C 组按照参考文献 2 3 报道的方法行C L P 复制严重腹腔感染致脓毒症模型。步骤为：质量分 数为3 的戊巴比妥钠按1m L k g 腹腔注射麻醉成 功后固定大鼠，腹部常规脱毛、消毒、铺巾，沿腹正中 线作一长约1 5c m 的切口，找到盲肠后将粪便由升 结肠挤入到盲肠，在远离回盲瓣的盲
19、肠根部用不吸 收缝合线结扎。使用2 0 号针头在盲肠上贯穿2 次， 挤出肠内容物少许，形成盲肠漏，并于近端贯通处留 置1 条0 5c m 3 0c m 橡皮条，防止针孔闭合，同 时剪除适量腹膜避免包裹，然后将盲肠还纳腹腔，逐 层缝合腹壁切口，术毕立即皮下注射6 0m L k g 生 理盐水以补偿术中体液丢失并抗休克。术后动物置 笼内自由活动，不禁饮食。 1 3 。肺组织M P O 水平测定 在相应时间点处死动物后，严格无菌条件下取 右侧肺组织下叶，经生理盐水冲洗并无菌纱布吸干 后立即置于无菌E P 管中一8 0 保存，采用分光光 度法测定肺组织M P O ，M P O 试剂盒由南京建成生 物工
20、程研究所提供，具体操作步骤按照试剂盒说明 书进行操作。 1 4 病理检查 1 4 1光镜下肺组织病理学观察 取右侧肺上叶放人4 中性甲醛固定液固定， 常规石蜡包埋切片及H E 染色后由光镜观察肺组织 病理学变化。 1 4 2电镜下肺组织超微结构观察 于左侧肺组织上、中、下3 个部位各取若干块 0 1c m 0 1c m 0 1c m 肺组织，放入2 。5 戊二 醛预固定，按电镜标本常规制备方法处理，国产6 1 8 树脂包埋，L K B - V 型超薄切片机切片，铀一铅双重染 色，H - 6 0 0 型透射电镜( 日本H I T A C H I 公司) 观 察。 1 5 统计学处理 本实验中所有
21、计量资料以均数标准差( j 士s ) 表示，实验数据采用S P S S1 5 0 软件进行统计分 析。多组问均数的比较采用单因素方差分析，组间 两两比较采用最小显著差异法。P O 0 5 表示具有 统计学意义。 2 结果 2 1 大鼠肺脏及胸腔积液大体观察 A 组大鼠肺脏红润，未见发白的实变区及胸腔 万方数据 江西医学院学报2 0 0 8 年第4 8 卷第3 期 A c t aA c a d e m i a eM e d i c i n a eJ i a n g x i2 0 0 8 ，V o l4 8 ，N 0 33 积液；B 组大鼠随时间增长逐渐可见到肺脏出现发 白的实变区，且随时间加重，
22、而且1 2h 后可见到明 显的胸腔积液；C 组大鼠肺组织实变及胸腔积液情 况明显减轻。 2 2 肺组织M P O 水平变化 A 组M P O 术后处于一个较低水平，而B 组、C 组则迅速升高，除2h 外，其余时间点均显著高于A 组( P o 0 5 或P o 0 1 ) ，但C 组显著低于B 组( P 0 0 5 或P 0 0 1 ) a 见图1 。 图3B 组2 4h 光镜下肺组织 2481 2 2 时阳C h ) 与同时同点A 组比较：# P O 0 5 ，P O 0 1 与同时间点B 组比较：* P - C 0 0 5 ，P 0 0 1 图13 组间肺组织M P O 水平的变化比较 2
23、3 光镜下肺组织病理学变化 A 组肺组织病理学变化不明显。B 组随时间增 长可发现肺泡壁内毛细血管扩张淤血，肺泡壁水肿 进行性加重，肺泡间隔增宽以致肺泡腔狭窄，4h 便 可见到局部出血区( 图2 ) ，8h 出血进一步加重，1 2h 出现了实变区，2 4h 可见到肺泡壁断裂( 图3 ) ，同时 伴有大量的中性粒细胞或淋巴细胞浸润。C 组各时 间点较B 组明显改善，未见明显出血区及实变区 ( 图4 5 ) ，炎症细胞浸润较B 组明显减轻。 图2B 组4h 光镜下肺组织 图4C 组4h 光镜下肺组织 图5C 组2 4h 光镜下肺组织 2 4 电镜下肺组织超微结构变化 A 组肺组织超微结构未见明显改
24、变。B 组肺泡 隔增宽，型肺泡上皮细胞表面微绒毛逐渐不整齐 甚至消失，细胞质板层体内板层凝集成不规则团块 和颗粒并逐渐脱落，至2 4h 已基本完全脱落，线粒 体嵴模糊，核染色质边聚逐渐加重，部分基质脱落， 溶酶体形状不规则，另外可见部分肺泡壁明显纤维 化( 图6 ) 。C 组细胞损伤较B 组明显改善，型肺 泡上皮细胞微绒毛排列较整齐，线粒体基本正常，仅 部分板层体内可见少量板层脱落( 图7 ) 。 4 2 O 4 2 l l 3 ， 2 2 2 2 l I ， 一I奢一舡9m薹驻鞲毒 万方数据 4 图6B 组电镜下肺组织 图7C 组电镜下肺组织 3 讨论 脓毒症时可出现全身性补体激活，而且这种
25、过 度的补体激活很有可能参与了肺损伤的发生 4 。补 体激活过程中产生的C 3 a 和C 5 a 是具有强大活性 的致炎因子，是循环中中性粒细胞的主要趋化因子， 能激活并趋化大量的白细胞向肺毛细血管床转移， 使中性粒细胞黏附于血管内皮并脱颗粒，释放活性 氧、蛋白水解酶和白三烯，另外可以促使吞噬细胞释 放颗粒酶、前列腺素及T N F - 扒I L - 1 、I L - 6 等促炎细 胞因子，刺激溶酶体释放溶酶体酶并促进肥大细胞 释放组胺之类的血管活性物质，导致小血管舒张、血 管通透性增强，出现肺水肿表现 5 。有研究报道脓 毒症时C 5 a 的产生具有促凝作用，影响脏器灌流， 导致缺血缺氧，此外
26、还可以诱导肺泡上皮细胞凋亡， 但同时又可以延迟中性粒细胞的凋亡，从而进一步 加重肺组织损伤即 。M P 0 是中性粒细胞嗜天青颗 粒所释放的过氧化物酶，其水平与中性粒细胞数目 之间存在极显著的相关性，可作为中性粒细胞的标 志间接反映大鼠肺组织中性粒细胞的变化。本研究 中脓毒症大鼠肺组织病理及超微结构改变均提示肺 损伤呈进行性加重，而且M P O 变化与病理变化一 致。 鉴于补体系统过度激活可能对肺组织造成的巨 大损伤，许多学者尝试通过抑制补体激活从而观察 肺组织的损伤变化。H i e t b r i n kF 等n 3 研究发现，阻 断补体因子C 5 可降低脓毒症模型肺和肠的通透 性，并可以减
27、少中性粒细胞在肺内的聚集。C V F 是 众多补体抑制剂中一种经典的补体抑制剂，可以在 短时间内耗竭补体，对肺组织仅仅会产生短暂的一 过性的可逆的损伤改变，4h 后基本恢复正常【8 。 本研究预先采用C V F 抑制补体激活后发现，C V F 组大鼠肺组织实变、胸腔积液及白细胞聚集情况较 脓毒症组明显减轻。另外，肺组织损伤的病理改变 也明显减轻，光镜下，肺泡壁水肿明显减轻，未见明 显的出血及实变区，而且没有出现肺泡甓断裂现象， 炎症细胞浸润较脓毒症组也明显减轻；透射电镜下， 型上皮细胞损伤明显减轻，微绒毛、板层体及线粒 体损伤轻微。这些均提示脓毒症早期补体激活介导 的炎症细胞在肺脏的聚集与激活
28、及炎症介质的释放 可能参与了肺损伤的发生，而抑制补体激活可以有 效地抑制中性粒细胞在肺脏的聚集与激活，减轻肺 组织水肿、出血及实变，从而明显增强了对肺组织的 保护作用，这与C z e r m a kB J 等L 9 、L uF 等n 叩学者 的研究结果基本一致。补体抑制剂C V F 在本研究 中所产生的积极作用为研究脓毒症时肺损伤提供了 一个新的思路。 ( 本研究得到了南昌大学第二附属医院动物实验中心肖鲁闽老 师及病理科李啦香主任、江西省医学科学研究所电镜室、江西省南昌 市内分泌研究所实验室、南昌大学研究生李彩花，沈浩、阵志勇等同 学的大力支持和帮助，在此一并致谢! ) 参考文献： 1 F l
29、 i e r lMA 。S c h r e i b e rH ，H u b e r - L a n gMS T h eR o l eo fC o r n p l e m e n t C 5 aa n dI t iR e c e p t o r si nS e p s i sa n dM u l t i o r g a nD y s f u n c t i o nS y n d r o m e J JI n v e s tS u r g ，2 0 0 6 ，1 9 ( 4 ) ：2 5 5 2 6 5 2 C h a u d r yIH W i c h t e r m a nKA ，B a u
30、eAE E f f e c to fS e p s i so n T i s s u eA d e n i n eN u c l e o t i d eL e v e l s J S u r g e r y ，1 9 7 9 ，8 5l2 0 5 2 l L 3 朱雪琦，刘清泉。姚咏明脓毒症动物模型制备方法的研究进展 J 巾国危重病急救医学，2 0 0 6 ，1 8 ( 2 ) ：1 1 4 1 1 6 4 H i e t b r i n kF K o e n d e r m a nL ，R i j k e r sG ，e ta 1 T r a u m a ：t h eR o l e o ft
31、 h eI n n a t eI m m u n eS y s t e m J W o r l dJE m e r gS u r g ，2 0 0 6 ， 1 ：1 5 5 H a r k i nDW ，M a r r o nCD R o t h e rRP ，e ta 1 C 5C o m p l e m e n t I n h i b i t i o nA t t e n u a t e sS h o c ka n dA c u t eL u n gI n j u r yi na nE x p e r i m e n t a lM o d e lo fR u p t u r e dA b
32、d o m i n a lA o r t i cA n e u r y s m J B rJS u r g ，2 0 0 5 ，9 2 1 1 2 2 7 1 2 3 4 6 H a a sPJ ，v a nS t r i j pJ A n a p h y l a t o x i n s ；T h e i rR o l ei nB a c t e r i a l I n f e c t i o na n dI n f l a m m a t i o n J I m m u n o tR e s ，2 0 0 7 ，3 7 ( 3 ) l 1 6 1 17 5 7 P h i l i p p a
33、 r tF ，C a v a i l l o nJM S e p s i sm e d i a t o r s J C u r rI n f e c t D i sR e p 2 0 0 7 9 ( 5 ) ：3 5 8 3 6 5 8 M i z u n oM ，N i s h i k a w aK ，O k a d aN ，e ta 1 I n h i b i t i o no faM e m b r a n eC o m p l e m e n tR e g u l a t o r yP r o t e i nb yaM o n o c l o n a lA n t i _ b o d
34、yI n d u c e sA c u t eL e t h a lS h o c ki nR a t sP r i m e dw i t hL i p p o p o l y s a c c h a r i d e J JI m m u n o l ，1 9 9 9 1 6 2 ：5 4 7 7 5 4 8 2 9 C z e r m a kBJ 。B r e e k w o l d tM 。R a v a g eZB ，e ta 1 M e c h a n i s m so f E n h a n c e dL u n gI n j u r yd u r i n gS e p s i s J A mJP a t h 0 1 1 9 9 9 ， 1 5 4 ( 4 ) ：1 0 5 7 1 0 6 5 D o L uF ，Q i nG ，F e r n a n d e sSM 。e ta 1 C 1I n h i b i t o r - m e d i a t e dP r o t e c t i o nf r o mS e p s i s J JI m m u n o l ，2 0 0 7 ，1 7 9 ( 6 ) ；3 9 6 6 3 9 7 2 ( 责任编辑：况荣华) 万方数据