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1、书书书 应用与环境生物学报 2006， 12 （1） ： 44 47 Chin J Appl Environ Biol = ISSN 100343567 2006-02-25 急性低氧下白介素-6 和低氧诱导因子-1 在大鼠海马中的表达* 徐建芬1， 2* 陈学群1 杜继曾1 （1浙江大学生命科学学院； 2浙江教育学院生物系 杭州 310027） 摘 要 模拟 5 km 急性低氧 2 h、 4 h、 8 h 和 24 h， 观察大鼠海马白介素-6（IL-6） 和低氧诱导因子-1（HIF-1） 表达的 时序变化. 分别运用免疫组化和 RT-PCR 分析海马 CA1、 CA2 和 CA3 区 IL
2、-6、HIF-1 和海马 HIF-1mRNA 的表达水 平. 与对照组相比， 5 km 急性低氧 8 h 和24 h， 海马 CA1 区 IL-6 水平升高14. 24%（P 0. 01） 和7. 76%（P 0. 05） ； 低 氧 8 h， 海马 CA2 和 CA3 区 IL-6 水平上升 3. 1%（P 0. 05） 和 5. 1%（P 0. 05） . 5 km 低氧 4 h、 8 h 和 24 h， 海马 CA1 区 HIF-1 水平分别升高 3. 67%（P 0. 05） 、 5. 5%（P 0. 05） 和 6. 27%（P 0. 01） ， 同时发现 HIF-1mRNA 在海马
3、 的表达上调. 上述结果表明， 5 km 急性低氧促进海马 IL-6 和 HIF-1 的表达增强， 推测 HIF-1 可能作为调控因子参与 低氧下海马 IL-6 的诱导表达. 图 5 表 1 参 21 关键词 低氧；IL-6；HIF-1；海马；免疫组化；大鼠 CLC R392. 12 Acute Hypoxia Induced IL-6 and HIF-1 Expression in Hippocampus of Rats* XU Jianfen1， 2*，CHEN Xuequn1& DU Jizeng1 （1College of Life Sciences，Zhejiang Universi
4、ty； 2Department of Biology，Zhejiang Education Institute，Hangzhou 310027，China） Abstract Interleukin-6（IL-6）and hypoxia-inducible factor 1 （HIF-1）expressions in hippocamus of rats were studied， exposing to 5 km acute hypoxia for 2 h ， 4 h， 8 h and 24 h. The expressions of IL-6 and HIF-1 in hippocampu
5、s were analyzed by immunocytochemistry，while that of HIF-1 mRNA by RT-PCR. 5 km acute hypoxia for 8 h and 24 h increased the expres- sion of IL-6 in hippocampus CA1 by 14. 24%（P 0. 01）and 7. 76%（P 0. 05） ，respectively. 5 km acute hypoxia for 8 h increased the expressions of IL-6 in hippocampus CA2 a
6、nd CA3 by 3. 1%（P 0. 05）and 5. 1%（P 0. 05） ，respectively. 5 km acute hypoxia for 4 h， 8 h and 24 h enhanced the expressions of HIF-1 in hippocampus CA1 by 3. 67%（P 0. 01） ， 5. 5%（P 0. 05）and 6. 27%（P 0. 01） ，and increased HIF-1 mRNA expression in hippocampus. The results showed that acute hypoxia in
7、duced HIF-1 and IL-6 expressions in hippocampus. It indicated that HIF-1 might regulate IL-6 expres- sion under acute hypoxia. Fig 5，Tab 1，Ref 21 Keywords hypoxia；IL-6；HIF-1；immunohistochemistry；hippocampus；rat CLC R392. 12 在中枢神经系统内， 由神经元和神经胶质细胞产生的白介 素-6（interleukin-6，IL-6） 具有神经保护和神经毒性作用， 因此 IL-6 在中
8、枢内具有免疫抑制和炎症反应双重作用 1. 文献报 道， 脑缺血、 脑损伤、 中风后， 中枢的皮层、 海马、 脑脊液和外周 血清 IL-6 水平明显升高 2， 3， 是造成脑二次损伤的重要因 素 4. Savman K 等认为， 新生儿窒息引起的缺氧缺血脑损伤 中， IL-6 等细胞因子造成的炎症是脑损伤的主要因素； 但同时 发现， 在各种脑损伤中 IL-6 对神经元具有保护作用， IL-6 能减 弱各类神经毒物质对脑的神经毒性， 对抗 NMDA 受体介导的 收稿日期： 2004-09-20 接受日期： 2004-12-28 *国家自然科学基金资助项目 （No. 30070289） ， 高等学科
9、博士学科点 专项科研基金资助项目 （200033502） 和浙江省教育厅基金资助项目 （20031254） Supported by the National Natural Science Foundation of China，Special Fund of Higher University for Doctors，and the Education Department of Zhejiang，China *通讯作者 Corresponding author（E-mail：xjf9699126. com） 缺血性脑损伤 5. 最近文献报道， 低氧诱导因子-1（hypoxia-in- d
10、ucible factor 1，HIF-1） 作为一种基因转录的核调节因子， 在低氧反应基因的转录和慢性缺氧生理适应中起重要的中介 作用. 炎性因子 TNF- 和 IL-1 能促进 HIF-1 蛋白的积累和 HIF-1mRNA 的表达 6， 7， 表明 HIF 可能介导炎症反应. IL-6 作为一个炎性因子与转录因子 HIF-1 的关系， 目前尚无文献 报道， 本文旨在阐明 5 km（10. 8%） 低氧下大鼠海马 HIF-1 和 IL-6 表达的时程变化， 以揭示两者的相互关系， 为高原医 学、 临床医学和军事医学的研究提供一定的理论依据. 1 材料与方法 1. 1 实验动物 健康雄性 Sp
11、rague-Dawley 大鼠， 体重 （180 20）g， 购自浙 江省实验动物中心. 在实验室 （20 2）自然光照下饲养1 wk 后用于实验研究. 1. 2 低氧模拟 实验动物随机分组， 共分 5 组 （2 h， 4 h， 8 h， 24 h 组和对照 组 CK） . 每组 8 只动物， 低氧组动物放入减压舱， 以 140 m/ min 速度升至所需海拔高度 （5 000 m， 10. 8% O2） ， 动物于舱内可 自由取食和饮水. 1. 3 脑组织切片制备 模拟低氧结束后， 动物给以 1%戊巴比妥钠 （40 mg/ kg） 腹 腔麻醉， 开胸暴露心脏， 经左心室主动脉插管灌注100
12、mL 生 理盐水， 冲洗血管内血液， 再灌注 400 mL 4% 多聚甲醛磷酸盐 缓冲液 （PBS， 0. 1 mol/ L，pH 7. 4） 灌注， 取脑置于 4% 多聚甲 醛 4 后固定 48 h， 在 0. 1 mol/ L PB 配制的 30% 蔗糖中浸泡 至组织沉底 （4 ） ， 在冷冻切片机上 （德国 HM505-E） 作连续 冠状切片， 片厚 30 m. 1. 4 免疫组化染色 采用 SP 法染色， 切片用 0. 4% Triton-100、 0. 3% H2O2、 血 清封闭后， 相邻海马切片用羊抗大鼠 IL-6 抗血清 （Santa Cruz， 1 “ 200） 、 兔抗大鼠
13、 HIF-1 抗体 （武汉博士德生物有限公司， 1 “ 300） 4 孵育过夜； 分别加入 1 “ 200 生物素标记的兔抗 羊 IgG、 羊抗兔 IgG（北京中山生物公司） 抗体 37 孵育 60 min； 最后加入 1 “ 200 辣根酶标记链霉卵白素 37 （北京中 山生物公司）孵育 60 min， 以一抗稀释液替代一抗作阴性对 照. DAB 显色， 中性树胶封片观察. 1. 5 RT-PCR 分析 HIF-1mRNA 5 km 低氧 4 h 和 8 h 后， 大鼠立即断头取海马， 按照 Trizol （上海生工） 操作说明提取组织总 mRNA， 取 2 g mRNA， Olig dT
14、作引物， M-MuLV （Fermentas） 逆转录酶逆转录成 cDNA， 取 1 L cDNA 作模板在50 L 反应体系中进行 PCR 扩增. GAPDH、 HIF-1 引物见表 1. 取 PCR 产物 10 L， 2% 的琼脂糖凝胶电 泳， 凝胶扫描系统进行扫描分析. 表 1 大鼠 HIF-1 和 GAPDH 的 PCR 引物 Table 1 PCR primers of HIF-1 and GAPDH of rat 引物名称 Primer5#3 HIF-1（ + ）GTA TCA TAC ACA TGA ATG TGG HIF-1（ - ）GAT AAA GCT TCT GTT AT
15、G AGG GAPDH（ + ）CAT GGT CTA CAT GTT CCA GT GAPDH（ - ）GGC TAA GCA GTT GGT GGT GC 1. 5 图像分析 大鼠海马免疫组化切片图像在 Nikon P40 显微镜下捕获， 用 Optimas6. 0 图像分析系统对海马 CA1， CA2 和 CA3 区 IL-6、 HIF-1 染色进行半定量分析， 光镜下棕黄色产物为阳性反应 物， 统计各切片海马区域单位面积内的阳性反应物的积分灰度 值 （除去背景灰度值） 求其平均值， 以 CK 为基准 （100%） . 数 据采用均数差异性检验 （t-test） 和方差分析 （ANOVA
16、） . 每组数 据以平均值 标准差 （x s） 表示， *P 0. 05 为差异显著， * *P 0. 01 为差异极显著. 2 实验结果 2. 1 5 km 急性低氧下海马 CA1 区 IL-6 的水平变化 IL-6 的免疫组化图像分析结果显示， 5 km 急性低氧 2 h、 4 h 后， CA1 区阳性反应细胞单位面积的积分灰度值与 CK 无统 计学差异. 5 km 急性低氧 8 h 和 24 h 后 CA1 区 IL-6 阳性细胞 明显增多， 免疫反应主要位于神经细胞的胞浆区 （图 1） ， 阳性 细胞单位面积的积分灰度值比 CK 显著升高 14. 24%（P 0. 05） 和 7. 7
17、6%（ P 0. 05） （图 2） . 图 1 5 km 急性低氧下大鼠海马 IL-6 和 HIF-1 的免疫组化图 Fig.1 Interleukin-6（IL-6）and HIF-1 immunoreactive cells in hippocampus A：CK；B：CA1 8 h（IL-6） ；C：CA2 8 h（IL-6） ；D：CA3 8 h（IL-6） ；E：CA1 8 h（HIF-1） ；F：CK. Bar =20 m 2. 2 5 km 急性低氧 8 h 后海马 CA1、 CA2 和 CA3 区 IL-6 的水平变化 如图 3 所示， 与各自 CK 相比， 5 km 急性低
18、氧 8 h 后， CA2、 CA3 区阳性反应细胞单位面积的积分灰度值为 103. 1%（P 0. 05） 和 105. 1%（P 0. 05） ， 均低于 CA1 区 （114. 24%） . 2.3 5 km 急性低氧下海马 CA1 区 HIF-1 的水平变化 与 CK 相比， 5 km 低氧4 h、 8 h 和24 h， 海马 CA1 区 HIF-1 阳性细胞单位面积积分灰度值分别为 103. 67%（P 0. 05） 、 105.5%（P 0.05） 和106.27%（P 0.01） （图4） . 2.4 5 km 急性低氧下海马 HIF-1mRNA 的表达变化 选取低氧 4 h、 8
19、 h 的大鼠海马组织进行 RT-PCR， 凝胶扫 描显示， 与 CK 相比， 低氧后 HIF-1mRNA 与 GAPDH mRNA 比 值升高 （图 5） . 3 讨 论 本实验的免疫组化结果表明， 5 km 急性低氧诱导大鼠海 马 CA1 区 IL-6 水平升高， 8 h 后达到峰值. Hagberg H 等报道， 新生大鼠单侧颈动脉结扎 （MCAO， 70 min） ， 在 3 h 后 IL- 54 1 期徐建芬等：急性低氧下白介素 -6 和低氧诱导因子 -1 在大鼠海马中的表达 6mRNA 的表达达到峰值， 图 2 5 km 急性低氧下大鼠海马 CA1 区 IL-6 水平变化 Fig.
20、2 OD of IL-6 in rat hippocampus CA1 after 5 km acute hypoxia *P 0.05，*P 0.01 vs CK. 下同 The same below 图 3 5 km 急性低氧 8 h 大鼠海马 CA1、 CA2 和 CA3 区 IL-6 水平变化 Fig. 3 OD of IL-6 in rat hippocampus CA1，CA2 and CA3 after 5 km acute hypoxia for 8 h 图 4 5 km 急性低氧下大鼠海马 CA1 区 HIF-1 水平变化 Fig. 4 OD of HIF-1 in rat
21、hippocampus CA1 after 5 km acute hypoxia 图 5 5 km 急性低氧下海马 HIF-1 的 PCR 电泳 Fig.5 PCR result of HIF-1 in rat hippocampus after 5 km acute hypoxia Lane M：DNA marker 6 h 后脑内 IL-6 水平显著升高 8. Suzuki S 等运用免疫组 化也证实， 沙鼠 10 min 前脑缺血， 3 h 后海马 CA1 区 IL-6 水平 显著升高， 一直持续 3 d 9. Block F 等报道， 大鼠 MCAO（3 h） 1 d 后， 缺血半球
22、IL-6 表达升高一直持续 14 d 10， 表明缺血引 起的缺氧和环境低氧均能诱导海马 IL-6 的表达， 前者表达比 后者早， 这可能与两者引起缺氧程度不同有关. 本实验结果表 明， 海马 CA1 区 IL-6 的水平比 CA2 和 CA3 区高， 周厚纶等也 报道， 大鼠的缺血再灌注过程中， CA1 区 fos 阳性细胞的表达 比海马其他各区时间长 11， 缺血过程 IL-6 的表达主要位于海 马的 CA1 的锥体细胞， 这与 CA1 对低氧的敏感性有关. 中枢神 经系统内 IL-6 表达升高的意义报道不一. 有文献报道， 由于中 枢 IL-6 有维持神经元的生存和促进分化作用， 而缺氧
23、对中枢 神经细胞是一种损伤作用， 推测机体通过 IL-6 表达的增加， 提 高机体的抗缺氧损伤能力. 杜彩霞等报道， 外源性 IL-6 对新生 大鼠的脑有损伤作用 12. IL-6 作为一个炎性因子， 可能参与缺 血性引起的炎症反应. 例如缺血再灌注后， IL-6 水平明显升高， 可使基质金属蛋白酶-1 （MMP-1） 表达增高而导致组织损 伤 13. Huell M 等报道认为， 在 AD 神经炎性斑早期形成过程 中存在大量 IL-6， 而在非痴呆型患者神经炎性斑中则无 IL-6 检出， 推测中枢神经系统 IL-6 参与脑炎症反应 14. 低氧诱导 的疾病例如中风、 肿瘤与炎性因子 IL-1
24、、 TNF、 IL-6 介导有 关 15. 当人进入海拔 3 000 m 以上的高原时往往引发急性的 高原脑水肿和肺水肿. 中枢正常表达低浓度 IL-6 可能参与中 枢的免疫介导、 神经修复等生理功能， 而缺血缺氧状态下高浓 度的 IL-6 则参与了神经损伤， 推测急性低氧海马 IL-6 的升高 可能与低氧诱导神经损伤有关. HIF-1 是对氧及其敏感的低氧调控因子， HIF-1 由 HIF-1 和 HIF-1 构成的异源性二聚体. HIF-1 对 HIF-1 是独特的， 决定 HIF-1 活性. 在正常条件下， 各组织 HIF-1 表达甚少， 而 在低氧下表达显著升高 16. 5 km 低氧
25、 4 h 后海马 HIF-1 蛋白 水平开始升高， 8 h 后与 CK 达到显著差异， 随低氧时间的延长 表达增强， 呈时效关系. 小鼠暴露低氧 （21% 6%）1 h， 运用 免疫印迹技术检测到脑内 HIF-1 蛋白的表达， 6% 低氧暴露 6 h 达到最高， 主要由脑内的神经元细胞和海马的颗粒细胞表 达 17. 与本实验 HIF-1 时间表达上的不同可能与低氧的强度 不同有关. mRNA 水平表明， 低氧 4 h 海马 HIF-1mRNA 的表达 明显升高， 低氧 8 h 的表达与 4 h 无明显差异， 表明低氧下 HIF-1 蛋白合成的调节并不在 mRNA 表达水平， 而在翻译和 翻译后
26、水平. 在常氧下 HIF-1 易和泛素蛋白结合被蛋白酶降 解， 低氧可以抑制 HIF-1 和泛素蛋白的结合与降解， 使 HIF- 1 蛋白快速聚集 18. 低氧时 HIF-1 蛋白水平和 HIF-1DNA 结 合活性增加， 调节许多低氧反应基因的表达 （EPO、 ET-1、 VEGF 等） ， 成为低氧反应基因表达的一个中心调节因子. 最近已有文献报道， 炎性因子 TNF- 和 IL-1 能促进 HIF- 1 蛋白的积累， 表明 HIF 可能介导炎症反应. 而 Jeong HJ 等最 近报道， HIF-1 的抑制剂阻断缺氧下肥大细胞炎性因子 IL-6 的表达， 其抑制作用强于 NF-kB 抑制
27、剂 （PDTC） ， 推测 HIF-1 可能参与调控低氧下 IL-6 的表达 19. HIF-1 诱导 IL-6 和 ET-1 的表达， 参与低氧引发的肺疾病的病理机制 20. 本研究发现， 急性低氧诱导海马 IL-6 和 HIF-1 表达升高， 在 mRNA 水平上 显示 HIF- 的表达早于 IL-6 蛋白表达， 推测 5 km 急性低氧过 程中 HIF-1 一方面直接参与 IL-6 的表达， 另一方面通过其诱 导中介物介导 IL-6 表达. 例 HIF-1 诱导的 ET-1 能呈剂量相 关刺激造骨细胞表达 IL-6 21. HIF-1 如何调控 IL-6 的表达尚 需进一步研究. 64
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